中科院-生物化学与分子生物学考博补充一

生物膜的运输机制？细胞膜物质转运的方式有单纯扩散，易化扩散，主动转运，出胞与入胞各自特点和机制为：单纯扩散，脂溶性的小分子物质或离子从膜的高浓度侧移向低浓度一侧的现象称为单纯扩散。

单纯扩散的特点是，不需膜蛋白质帮助，不消耗细胞自身代谢能量，顺浓度差进行，单纯扩散转运的物质为脂溶性小分子物质易化扩散，指水溶性的小分子物质或离子在膜蛋白质的帮助下从膜的高浓度一侧移向低浓度一侧的转运方式。

易化扩散的类型有载体转运。

载体转运的特点有特异性，饱和性，竞争性抑制。

载体转运转运的物质：主要是水溶性小分子有机物。

主动转运，指在细胞膜上生物泵的作用下,通过细胞本身的耗能将物质从膜的低浓度一侧向高浓度的转运。

主动转运转运的物质主要是离子物质如钠，钾，钙。

特点是需要生物泵作用，消化细胞自身代谢能量，逆浓度差进行。

出胞与入胞，大分子物质从细胞内移向细胞外称为出胞。

大分子物质从细胞外移向细胞内称为入胞。

出胞与入胞转运的物质为大分子物质。

出胞与入胞的特点为需要细胞膜的运动，消耗细胞自身代谢能量。

DNA复制原理？DNA复制基本规律：①复制过程为半保留方式；②原核生物单点起始,真核生物多点起始,复制方向多为双向,也有单向；③复制方式呈多样性, (直线型、Q型、滚动环型…等)；④新链合成需要引物,引物RNA长度—般为几个～10个核苷酸,新链合成方向5’→ 3’,与模板链反向,碱基互补；⑤复制为半不连续的,以解决复制过程中,两条不同极性的链同时延伸问题,即…—条链可按5’→ 3’方向连续合成称为前导链,另一条链先按5’→ 3’方向合成许多不连续的冈崎片段(原核生物一般长1000-2000个核苷酸,真核生物一般长100--200个核苷酸),再通过连接酶连接成完整链, 称后随链,且前导链与后随链合成速度不完全—致,前者快,后者慢.DNA复制主要包括引发、延伸、终止三个阶段.DNA的复制是一个边解旋边复制的过程.复制开始时,DNA分子首先利用细胞提供的能量,在解旋酶的作用下,把两条螺旋的双链解开,这个过程叫解旋.然后,以解开的每一段母链为模板,以周围环境中的四种脱氧核苷酸为原料,按照碱基配对互补配对原则,在DNA聚合酶的作用下,各自合成与母链互补的一段子链.随着解旋过程的进行,新合成的子链也不断地延伸,同时,每条子链与其母链盘绕成双螺旋结构,从而各形成一个新的DNA分子.这样,复制结束后,一个DNA分子,通过细胞分裂分配到两个子细胞中去!免疫共沉淀与ChiSeq原理。

什么是ChIP?ChIP的原理很简单：选择性富集包含某一特异性抗原的染色体（质）片段。

能够识别某一蛋白或目的修饰蛋白的抗体被用来确定抗原在基因组中一处或多处的相对丰度。

1、分离总染色体（质）（需要通过交联使目的抗原固定在染色体（质）与其结合的部位）。

2、将染色体（质）切割成片段（以提高精度）。

3、对切成片段的染色体（质）进行免疫沉淀。

4、免疫沉淀的染色体（质）片段进行分析，确定靶DNA序列水平与其输入的染色体（质）的相对丰度。

甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片段---PCR分析。

简述真核生物5’帽子结构和功能。

m是甲基，m7G指7-甲基鸟嘌呤核苷酸m7G是所有mRNA的帽子都有结构，它跟5'-PPPN相连（即mRNA5'端起始三磷酸核苷酸）。

帽子结构通常有三种：m7GPPPN，m7GPPPNm，m7GPPPNmNm。

它们分别被称为O型、I型和II 型mRNA的加工修饰包括：5‘端形成帽子结构、3’端加polyA、剪接除去内含子和甲基化。

①在5’-端加帽成熟的真核生物mRNA的5’-端有m7GPPPN结构，称为甲基鸟苷帽子。

它是在RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶和mRNA（核苷-2’）甲基转移酶催化形成的。

甲基化程度不同可形成3种类型的帽子：CAP 0型、CAP I型和CAP II型。

鸟苷以5’-5’焦磷酸键与初级转录本的5’-端相连。

真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。

5’帽子的功能mRNA 5’-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。

帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5’ →3‘核酸外切酶的攻击。

在蛋白质合成过程中，它有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起始。

作用就有提高翻译强度。

防止转录产物被核酸酶降解。

可以促进蛋白质生物合成中起始复合物的形成。

缺失后，无法起始翻译。

有丝分裂及其调控（有丝分裂的过程、变异及其调控前期（prophase）：染色质逐渐凝缩变粗，起先是卷曲为一团乱麻，继而能分清各个染色体，且明显可以见到每条染色体都是由两条染色单体构成的，两条染色单体共用一个着丝点。

核仁和核膜逐渐变得模糊不清。

纺锤丝（spindle fiber）开始形成。

中期（metaphase）：核仁和核膜完全消失，纺锤体（spindle）明显可见。

从细胞的侧面观察，各个染色体的着丝点均排列在纺锤体中央的赤道面上，而其两臂则自由地伸展在赤道面的两侧（图mitosis-metaphase-cemianguan)。

此时，染色体具有典型的形状，适于观察和记数(图2-8-1)。

后期（anaphase）：每个染色体的着丝粒分裂为二，每条染色体的两条染色单体各自分开而成为两条独立的染色体，并在纺锤丝的牵引下分别移向两极。

移向两极的染色体数目是完全一样的，且同分裂前母细胞的染色体数目、形态完全一样(图mitosis-anaphase)。

末期（telophase）：染色体已移至两极(图mitosis-telophase)，围绕者染色体重新出现核仁核膜，染色体又重新变得松散细长，回复为染色质的状态。

至此，一个母细胞内形成了两个子核。

接着在纺锤体的赤道板区域形成细胞板，细胞质被分隔开,一个母细胞分裂为两个完全相同的子细胞。

继而，子细胞又进入G1期。

以哺乳动物精子和卵子发生为例。

简述减数分裂精子减数分裂时,初级精母细胞DNA复制一次,然后进行一次分裂（即减数第一次分裂）,形成两个次级精母细胞,每个次级精母细胞再进行一次分裂（减数第二次分裂）,共形成四个精子卵细胞减数分裂时,初级卵母细胞DNA复制一次,然后进行一次分裂（即减数第一次分裂）,形成两个大小不等的细胞,大的称之为次级卵母细胞,小得称之为第一极体.次级卵母细胞再分裂一次,再次形成两个大小不等的细胞,大的即卵细胞,小的称为第二极体.相同点：都是DNA复制一次而进行两次分裂；都在减数第一次分裂发生同源染色体的配对以及同源染色体的分开；都在减数第二次分裂发生姐妹染色单体的分离；分裂后细胞内的染色体数都减半.不同点：初级精母细胞减数分裂的结果是形成四个精子而初级卵母细胞减数分裂的结果是形成一个卵细胞、一个第一极体和一个第二极体.试述细胞膜的化学组成流动镶嵌模型模型认：细胞膜结构是由液态的脂类双分子层中镶嵌可以移动的球形蛋白质而形成的.随着科学研究技术的不断创新和改进,流动镶嵌模型也逐步得到完善,是目前比较公认的膜结构模型.这一模型强调两点：①膜的流动性,膜蛋白和膜脂均可侧向移动.②膜蛋白分布的不对称性,球形蛋白质有的镶嵌在膜的内或外表面,有的嵌人或横跨脂双分子层. 膜的流动性是细胞膜结构的基本特征之一,同时也是细胞膜表现其正常功能的必要条件.膜的流动性是指膜结构分子的运动性,它包括膜脂的运动和膜蛋白的运动.膜脂的流动性膜脂的运动在正常生理状况下,膜脂分子处于运动状态.膜脂的运动方式主要有侧向扩散、旋转运动、旋转异构运动、左右摆动以及翻转运动等.细胞膜中的蛋白质也能以侧向扩散等方式运动.人们通过实验已充分证实了膜蛋白的流动性.膜蛋白主要有以下几种运动形式：① 随机移动有些蛋白质能够在整个膜上随机移动.移动的速率比用人工脂双层测得的要低. ② 定向移动有些蛋白比较特别,在膜中作定向移动.例如,有些膜蛋白在膜上可以从细胞的头部移向尾部.③ 局部扩散有些蛋白虽然能够在膜上自由扩散,但只能在局部范围内扩散其主要特点是：细胞膜不是静态的,而是膜中的脂质和蛋白质都能自由运动.即是：磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架,蛋白质分子贯穿在磷脂双分子层中或覆盖有磷双分子层表面.由于磷脂双分子层可以运动、蛋白质分子可以运动,所以整个膜是可流动的。

给你一个新基因，如何研究它的功能基因功能的研究思路主要包括:1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GST pulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)4.gain-of-function & loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.关于基因的表达和定位,可以这样去做：1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...）,提取RNA,反转录,做RT-PCR或real time RT-PCR,检测基因的表达情况/变化.（或者以northern blot、Rnase protection assay方法,检测基因的mRNA表达情况/变化.）2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞,以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达.3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体,在适合的模式细胞中表达,在活细胞中观察蛋白的细胞定位.DNA重组的意义简述RNA剪接和蛋白质剪接RNA剪接：将转录初始物中的内含子切除,紧接着将其编码多肽链的外显子连接在一起的过程.RNA剪接方式：1.一类内含子的自我剪接；2.二类内含子的自我剪接；3.核内mRNA剪接体剪接；4.核内前体tRNA酶促反应剪接.前两类内含子的剪接方式都是两次转酯反应,区别就是第一次转酯反应所用亲核试剂不同；第三类剪接方式分为组成性剪接与选择性剪接,前者识别5‘-GU······AG-3'内含子序列,而后包括可变poly A位点和可变剪接方式；第四类需核酸酶及连接酶等工具酶,形成成熟tRNA.蛋白质剪接是蛋白质内含肽介导的,一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程,它由一系列分子内的剪切一连接反应组成.蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列,可以催化自身从蛋白质前体中断裂,使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质.蛋白质内含肽的发现,不仅丰富了遗传信息翻译后加工的理论, 在实践中也有广泛的应用前景.蛋白质相互作用什么是反义RNA?真核生物中反义RNA调节基因表达的机理是什么?反义RNA(antisense RNA)是一类自身没有编码功能，但能通过配对碱基间氢键与目的RNA特别是mRNA的特定区域补结合，从而抑制基因表达的小分子RNA。