人凝血酶原复合物中Ⅶ因子提取工艺的研究
人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： Ｌ Ｉ Ｕ － Ｘｉ ａ ｏ ，Ｅ— ｍａ ｉ ｆ ：ｂ ｏ ｙ ｌ ｘ ｌ Ｏ ０ ６ ＠１ ２ ６ ． ｃ ｏ ｍ
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｃ ｏ ａ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｅ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ（ Ｐ Ｃ Ｃ ）ｍ ａ ｎ ｕ ｆ ａ ｃ —
何彦 林 ， 刘晓 ， 潘孟娇 ， 刘 晓宇 ， 张磷 ， 张继 鹏 ， 张安 山 ， 杨晓 东
兰州生物制 品研究所有 限责任公 司 甘肃省疫苗工程技术研究 中心 ， 甘肃 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ 摘要 ：目的 通过 比较 以组分 Ⅲ沉淀和血浆为原料制备人凝血酶原复合物 （ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ， Ｐ Ｃ Ｃ ） 分别对 以组分 Ⅲ沉淀和血浆为原料制
备的 Ｐ Ｃ Ｃ中间品活化 的凝血 因子活性和人凝血酶活性两个项 目均不合格 。以组分 Ⅲ沉淀 为原料制备 Ｐ Ｃ Ｃ生产过 程中添加肝素后 ， Ｐ Ｃ Ｃ中间品的活化 的凝血 因子 活性 和人凝血 酶活性均不合格 。以血浆为原料制备 的 Ｐ Ｃ Ｃ中间品 活化的凝血因子活性和人凝 血酶活性两个 项 目均合格。结论 的风险 ， 新鲜冰冻血浆可作为制备 Ｐ Ｃ Ｃ的原料 。 关键词 ： 人凝血酶原复合物 ； 凝血因子活化 ； 人凝血酶活性
离子交换吸附法提取人凝血酶原复合物工艺优化
Ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｈｕ ｍａ ｎ ｐｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ ｈ ｕｍ ａ ｎ ｐ ｌ ａ ｓ ｍａ ｕｓ ｉ ｎ ｇ ｉ ｏ ｎ ｅ ｘ ｃ ｈａ ｎｇ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｒ ｐｔ ｉ ｏ ｎ
结论 确定 了人凝血酶原复合 物提取工 艺的条件。 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ５ － ５ ６ ７ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ １ － ０ ０ ２ １ — １ ０ 关键词 ： 人凝 血酶原复合物 ； 人 血浆 ； 离子交换 吸附工艺 中图分类号 ： Ｔ Ｑ ４ ６ ４ ． ５ ６
人 凝血酶原复合物 中凝 血 因子 Ⅱ、 Ⅶ、 Ⅸ和 Ｘ吸附 率 为考 察指 标 ， 初 步优选 吸附温 度 、 吸 附 时 间、 凝 胶用 量 和血
浆ｐ Ｈ四个工艺参数 。结果 优 化试 验结果 为血浆 温度 ２ ０℃ 、 吸 附时 间 ６ ０ ｍ ｉ ｎ 、 凝胶 用量 １ ． ５ ｇ ／ Ｌ 、 血浆 ｐ Ｈ ７ ． ４ 。
＿
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｒ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ａ
重组人长效凝血因子Ⅶ药物研发进展
重组人长效凝血因子Ⅶ药物研发进展血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，病症多为自发性或轻度外伤后出血不止，轻则造成患者终生残疾，重则短时间即可危及患者生命。
血友病尚无根治办法，目前的治疗方法主要为替代疗法，通过长期输注血浆、缺失的凝血因子的方式来治疗。
血友病治疗最严重的并发症是中和性抗体（抑制物）的形成，从而阻碍了替代疗法的止血作用。
抑制物的产生导致血友病患者的致残率和死亡率增高，只有少数旁路制剂可用于这些患者的出血治疗，如活化凝血酶原复合物浓缩物（aPCC）和重组活性凝血因子Ⅶ（rFVIIa）。
在A型血友病中，约30%的重症患者和5%～10%的非重症患者会产生抑制物，B型血友病患者有3%～5%会产生抑制物[1]。
活化的rFVII对于A型和B型血友病都具有良好的治疗效果，同时对体内产生抑制性抗体的血友病患者同样具有治疗效果[2]，是目前临床治疗血友病的最常用药物之一。
由于血液中FVII含量较低（0.5～2.0mg·L-1，其中FVIIa仅占1%），且半衰期非常短（约2.5h），血液提取难度非常大，因此利用基因重组技术表达rFVIIa是目前唯一可行的方法。
诺其是丹麦诺和诺德（Novo Nordisk）公司在1999年上市的rFVIIa，由新生仓鼠肾宿主（BHK）细胞表达。
rFVIIa和血浆来源的FVIIa的结构、功能研究显示，二者仅在翻译后修饰γ羧基化和N糖基化中有微小差异，但功能基本一致，均可以缩短体外凝血时间，并对无抑制物和伴发抑制物的血友病患者均具有治疗作用[3-4]。
诺其主要用于治疗存在Ⅷ因子（FVIII）或Ⅸ因子（FIX）中和抗体的先天性血友病和继发性血友病患者的自发性或手术性出血，在欧洲还被批准用于获得性血友病的治疗[5]；此外，还可用于产妇分娩出血的治疗。
但药物的半衰期短，约2.9h，自发性出血标准治疗方案包括单次注射270 μg·kg-1，或出血后每3h 注射90 μg·kg-1，共3 次。
人凝血酶原复合物在制备过程中凝血因子活性的检测和分析
文献标 志码 ：Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ ５ — ５ ６ ７ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ６ — ０ ０ ２ ２ — ０ ４
Ｄ ｏＩ ： １ ０ ． １ ３ ３ ０ ９ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｐ ｍｉ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ６ ． ０ ０ ６
Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｃ ｏ ａ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｉ ｎ ｐｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈｕ ｍａ ｎ ｐｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍ ｂｉ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎｔ ｒ ａ ｔ ｅ
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ａ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｉ ｎ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ — ｔ ｒ ａ ｔ ｅ（ Ｐ Ｃ Ｃ ） ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｃ ｏ ａ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ Ｉ Ｉ ， Ｖ Ｉ Ｉ ， Ｉ Ｘ， Ｘ ｗ ａ ｓ ｍ ｅ ａ ｓ ｕ ｒ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｂ ａ ｔ ｃ ｈ ｅ ｓ ｏ ｆ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ａ ．Ｔ ｈ ｅ
人凝血酶原复合物提取及纯化工艺的研究
人凝血酶原复合物提取及纯化工艺的研究何淑琴;张丽铃;黄璠【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)017【摘要】[目的]确定血浆中人凝血酶原复合物提取及纯化的最佳工艺条件.[方法]以人血浆为原料,凝血酶原复合物的吸附率和回收率为评价指标,采用单因素试验及正交试验对提取和纯化条件进行优选.[结果]最佳工艺为:选用pH值为7.0的DEAE-Sephadex A50凝胶从人血浆中提取人凝血酶原复合物,吸附50 min时,凝胶对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附率可达84.0％、86.5％、85.7％和78.0％;采用NaCl浓度为0.1 mol/L、pH值为7.2的洗涤液洗涤吸附后的凝胶5次,然后用NaCl浓度为2.0 mol/L的洗脱液洗脱3次,对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的回收率可达84.9％、76.4％、82.8％和78.7％.[结论]该工艺合理、可行,适合人凝血酶原复合物的工业化生产.【总页数】3页(P7420-7422)【作者】何淑琴;张丽铃;黄璠【作者单位】江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000;江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000;江西博雅生物制药股份有限公司,江西抚州344000【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.人凝血酶原复合物中Ⅶ因子提取工艺的研究 [J], 原路杰;任妙香;李勇;2.金属螯合亲和膜吸附分离与纯化溶菌酶的研究(Ⅲ)混合酶和蛋清(壳)中的溶菌酶提取及纯化新工艺 [J], 李静;陈欢林;柴红3.人凝血酶原复合物分离纯化工艺的研究进展 [J], 邱家山;徐琦;方为茂;钟本和4.人凝血酶原复合物分离纯化工艺的研究进展 [J], 邱家山;徐琦;方为茂;钟本和5.牛蒡子总木脂素提取纯化工艺及纯化前后体外抑菌作用研究 [J], 张丽珉;赵琳;韩啸;周丽萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人凝血因子Ⅷ提取工艺优化研究
ｃ ｅ ｎ ｔ ａ ａ ｎ ｄ ｐ ｏ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｅ ｔ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｐ ｒ ｅ ｅ ｃ ｌ ａ ｍｐ ｓ ｉ ａ ［ Ｊ ］ ． Ｃ ｉ ｒ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
『 １ １ ］ Ｔ ｅ ｓ ｓ ｅ Ａ， Ｍｅ ｚ ｉ ａ ｎ ｉ Ｆ， Ｄ ａ ｖ ｉ ｄ Ｅ， ｅ ｔ ａ １ ． Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｅ ｌ ｅ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｐ ｒ ｅ ｅ ｃ ｌ ａ ｍ—
ｐ ｔ ｉ ｅ ｗｏ ｍｅ ｎ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｈ ｙ ｐ ｏ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｓ ｅ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｐ ｒ ｅ ｇ ｎ ａ ｎ ｔ
２９ — ３ ９ ．
信 号传 达通 路触 发 炎症 系 统㈣ 另 一方 面 ． 同型半 胱 氨 酸可 以促进 氧 自 由基 的 生成 。损 伤 血管 内皮
细胞 ， 造 成其 功 能异 。
【 ８ ］ 蔡霞 ， 乔拉 ， 耿丽红 ， 等． 妊 娠 高 血 压 综 合 征 胎 盘 细 胞 凋 亡 的研 究 ［ Ｊ ］ ． 新疆医科大学学报 ， ２ ０ ０ ３， ５： ０ ２ １ ． ［ ９ ］ Ｈ ｕ ｎ ｇ Ｔ Ｈ， Ｓ ｋ ｅ ｐ ｐ ｅ ｒ Ｊ Ｎ， Ｃ ｈ ａ ｍｏ ｃ ｋ — Ｊ ｏ ｎ ｅ ｓ Ｄ Ｓ， ｅ ｔ １． ａ Ｈ ｙ ｐ ｏ ｘ ｉ ａ — ｒ ｅ ｏ ｘ ｙ －
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ， ２ ０ ０ ２， ９ ０ （ １ ２ ） ： １ ２ ７ ４ － １ ２ ８ １ ． （ １ ｏ ］ ｓ Ｅ 林， 辛晓燕 ， 王哲 ， 等． 妊娠高血压综 合征胎盘组织 中细胞凋 亡 的观察［ Ｊ １ ． 第 四军 医大学学报 ， ２ ０ ０ ５ ， ２ ６ （ ２ ０ ） ： １ ８ ９ ５ — １ ８ ９ ７ ．
人凝血酶原复合物制备工艺研究现状
（ 兰 州 生 物 制 品研 究 所 有 限 责 任公 司 甘 肃 省 疫 苗 工 程 技 术 研 究 中心 ， 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ ）
摘要： 人凝血酶原复合 物（ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ， Ｐ Ｃ Ｃ ） 是一 种含有凝 血 因子 Ｉ Ｉ 、 Ｖ Ｉ Ｉ 、 Ｉ Ｘ、 Ｘ四种维生 素 Ｋ 依赖性凝血 因子 ， 能够促进血液凝 固的血浆 蛋 白制剂 。目前 ， 多数生产厂家采用 Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ 一 ５ ０凝胶从 混合 血浆 中制 备 Ｐ Ｃ Ｃ。Ｐ Ｃ Ｃ制备工艺 的选择 、 制备原料 的挑选 及质量 控制 、 关键工 艺参数 的优化及 控制 等方面对 Ｐ Ｃ Ｃ 制 艺 、 制备原料 、 关键工艺参数 的优 化及 生产过程中凝 血因子活化
ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ（ Ｉ Ｉ ，Ｖ Ｉ Ｉ ， Ｉ Ｘ ａ ｎ ｄ Ｘ） ．Ｉ ｔ ｉ ｓ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｉ ｏ ｎ — ｅ ｘ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ｏ ｎ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ 一 ５ ０ ｒ ｅ ｓ ｉ ｎ ｆ ｒ ｏ ｍ ｌ ａ ｒ ｇ ｅ
的控 制 策 略进 行 了 综 述 。
关键词 ： 人凝血酶原复合物 ； 制备工艺 ； 关键工艺参数 优化
中 图分 类 号 ： Ｑ ８ １ 文献标志码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ５— ５ ６ ７ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４— ０ ０ ７ ９— ０ ６
Ｔｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｎ ｐｒ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈｕ ｍａ ｎ ｐｒ ｏ ｔ ｈｒ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ
一种提高人凝血酶原复合物中FⅦ收率的方法[发明专利]
![一种提高人凝血酶原复合物中FⅦ收率的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b46371f055270722182ef74b.png)
专利名称：一种提高人凝血酶原复合物中FⅦ收率的方法专利类型：发明专利
发明人：辛叶,梁华,肖雷,王玉兵,徐建生
申请号：CN201610429456.9
申请日：20160616
公开号：CN106085992A
公开日：
20161109
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了用于提取人凝血酶原复合物的平衡液以及提取人凝血酶原复合物的方法。
所述用于提取人凝血酶原复合物的平衡液包括：0.10mol/L～0.15mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述平衡液的pH值为6.8～7.2。
利用本发明的平衡液能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是凝血因子Ⅶ(FⅦ)的收率较高。
此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。
申请人：武汉中原瑞德生物制品有限责任公司
地址：430206 湖北省武汉市东湖新技术开发区光谷七路99号
国籍：CN
代理机构：北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李志东
更多信息请下载全文后查看。
一种人第VIII凝血因子的制备方法[发明专利]
![一种人第VIII凝血因子的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3575e226da38376baf1faefa.png)
专利名称：一种人第VIII凝血因子的制备方法专利类型：发明专利
发明人：陈正旺,胡辉恒,邵恒波,汪模正
申请号：CN201310573675.0
申请日：20131115
公开号：CN103613658A
公开日：
20140305
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种人第VIII凝血因子的制备方法，包括如下步骤：（1）从人血浆中分离冷沉淀，加入Tris-HCl溶解液溶解；（2）一次PEG沉淀：向溶解液中加入PEG1溶液，搅拌静置后离心；（3）收集离心后的上清液，加入S/D溶液灭活；（4）二次PEG沉淀：将灭活后的所述上清液澄清过滤，滤液转至低温反应罐，在搅拌条件下加入PEG2溶液，搅拌静置后离心；（5）沉淀洗涤、采用溶解液溶解，溶解完全后离心，收集上清，过滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到产品。
本发明所述方法采用二次PEG沉淀法简化了生产工艺，降低了对大型设备的要求，占地面积小，操作简单，成本低廉，提高了劳动效率，提高了经济效益。
申请人：同路生物制药股份有限公司
地址：230022 安徽省合肥市绩溪路230号
国籍：CN
代理机构：北京双收知识产权代理有限公司
代理人：王菊珍
更多信息请下载全文后查看。
人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定
［基金项目］ 国家８６３计划资助项目（２０１２ＡＡ０２１９０２）；病原微生物生物安全国家重点实验室资助项目（ＳＫＬＰＢＳ１１０３）；广东省教育部产学研结合资助项目（２０１１Ａ０９０２０００７１）［作者简介］ 揭飞龙，男，硕士研究生，研究方向：外源蛋白在哺乳动物细胞的高效表达［作者单位］ １．南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所，广州 ５１０５１５；２．军事医学科学院野战输血研究所，北京 １００８５０［通讯作者］ 章金刚，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｇ＠ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ；李红卫，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｗｅｉｌｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定揭飞龙１，吕茂民２，王升尧１，颜仁和１，何 悦１，李红卫１，章金刚２［摘要］ 目的 构建表达人凝血因子Ⅶ（ＦⅦ）的重组腺病毒载体，利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（ｒｈＦⅦ）。
方法 利用Bam ＨⅠ和Eco ＲⅤ双酶切ｐｃＤＮＡ３．１－ＦⅦ载体得到ＦⅦ基因片段，补平后，插入经Sal Ⅰ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）表达盒的ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ腺病毒穿梭载体，构建ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＦⅦ，继而进行酶切和测序鉴定；经Pme Ⅰ单酶切线性化后，ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＦⅦ在ＢＪ５１８３感受态菌内与ｐＡｄＥａｓｙ－１腺病毒骨架发生同源重组，构建重组表达ＦⅦ的腺病毒质粒ｐＡｄ－ＦⅦ；经Pac Ⅰ酶切后的ｐＡｄ－ＦⅦ，使用ＰＥＩ试剂转染２９３Ａ细胞，包装表达ＦⅦ的重组腺病毒Ａｄ－ＦⅦ；利用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测重组腺病毒Ａｄ－ＦⅦ介导２９３Ａ细胞表达ＦⅦ的蛋白水平；通过观察ＥＧＦＰ的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。
结果 经酶切和测序鉴定，ＦⅦ克隆到ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ腺病毒穿梭载体中，获得重组质粒ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＦⅦ；将其与ｐＡｄＥａｓｙ－１在细菌内发生同源重组，成功获得ＦⅦ重组腺病毒质粒ｐＡｄ－ＦⅦ；在２９３Ａ细胞内包装重组腺病毒，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测到ＦⅦ蛋白的表达。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
表 2 不同凝胶量对Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率的影响
凝胶量
Ⅶ因子 残留量%
Ⅶ因子 吸附率%
Ⅸ因子 残留量%
Ⅸ因子 吸附率%
1.0%
46.8
53.2
15.8
84.2
1.5%
40.2
59.8
9.5
90.5
2.0%
35.6
64.4
3.2
96.8
2.5%
34.9
65.1
2.9
3.0%
34.5
65.5
2.8
97.1 97.2
国内现有的PCC制剂,其Ⅶ因子含量均低。本论文根据实验数 据提供一些借鉴,来提高Ⅶ因子的含量[2]。
根据实验数据得出,Ⅶ因子含量减少主要在S/D灭活前,故本 论文将针对S/D灭活前作讨论。
1 材料与方法
1.1 材料 人血浆为山西康宝生物制品股份有限责任公司下属的血浆站 采集,质量符合药典要求。DEAE-Sephadex A-50凝胶购自GE Healthcare公司。4种凝血因子促凝活性检测试剂盒均购自Instrumentation Laboratory公司。 1.2 方法 1.2.1 凝胶 PH 参数的优选 调节凝胶至不同PH条件下,对同一批等量的血浆进行吸附,吸 附方法和吸附时间均相同。然后收集吸附后的血浆,测其Ⅶ因子和 Ⅸ因子残留量,进而计算凝胶对Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率[3]。 1.2.2 凝胶量参数的优选 凝胶量按血浆量的1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%分别吸附相同条 件下的血浆,吸附条件均相同,然后收集吸附后的血浆,测其Ⅶ因子和 Ⅸ因子残留量,进而计算不同凝胶量对Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率。 1.2.3 吸附次数参数的优选 采用二次吸附法,即:准备两份条件相同的凝胶A和B,将血浆 经凝胶A吸附后,再次经凝胶B吸附的方法。分别收集吸附后的血浆 A和B,测其Ⅶ因子和Ⅸ因子残留量,进而计算凝胶对Ⅶ因子和Ⅸ因
子的吸附率。 1.2.4 洗涤次数参数的优选 血浆经凝胶吸附后,用相同量和相同条件的洗涤液洗涤5次,分
别收集洗涤后的溶液,用双缩脲法测其中的蛋白含量,用凝血酶能 使人纤维蛋白原凝固的原理检测其中是否有凝血因子［4］。
2 结果与分析
2.1 凝胶 PH 参数的优选结果 在不同PH条件下,由表1可知,Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率在 PH=7.6时较高。虽然PH=7.9时也高,但杂蛋白增多了,所以PH=7. 6时,凝胶吸附的效果最好。 2.2 凝胶量参数的优选结果 在不同凝胶量的情况下,由表2可知,Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率 在凝胶量为2.0%时较高。虽然2.5%,3.0%时也高,但不利于洗脱,所 以凝胶量为2.0%时,凝胶吸附的效果最好。 2.3 吸附次数参数的优选结果 采用二次吸附法,由表3可知,Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率在再次 经凝胶B吸附后较高。 2.4 洗涤次数参数的优选结果 由表4可知,在洗涤3次时,杂蛋白已基本洗出,但后两次仍有极 少量的凝血因子。洗涤3次,在凝血因子损耗少的情况下,且基本洗 出杂蛋白,所以,3次为最佳洗涤次数。
是
是
是
是
是
作者简介:原路杰,男,山西省长治市,助理工程师,大学本科,研究方向:生物技术。
表 1 凝胶 PH 对Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率的影响
凝胶 PH
6.7 7.0 7.3 7.6 7.9
Ⅶ因子 残留量% 35.6 35.1 34.2 32.8 32.3
Ⅶ因子 吸附率% 64.4 64.9 65.8 67.2 67.7
Ⅸ因子 残留量% 3.2 3.1 3.0 2.8 2.7
Ⅸ因子 吸附率% 96.8 96.9 97.0 97.2 97.3
生物技术 世界
医药论坛
人凝血酶原复合物中Ⅶ因子提取工艺的研究
原路杰 任妙香 李勇 (山西康宝生物制品股份有限公司 山西长治 046000)
摘要:目的:确定人凝血酶原复合物中Ⅶ因子提取的最佳工艺条件。方法:以健康人血浆为原料,DEAE-Sephadex A-50凝胶为吸附介质,人凝血因
子Ⅶ的吸附率和残留率为评价指标,对Ⅶ因子提取的条件进行优选。结果:最佳工艺为:凝胶PH=7.6,凝胶量为血浆量的2.0%,洗涤次数为3次,且采用二次
3 结论
该试验发现,在凝胶PH=7.6,凝胶量为血浆量的2.0%,洗涤次 数为3次,且采用二次吸附法时,Ⅶ因子的提取率较高。
综上所述,该工艺条件可得到较高含量的Ⅶ因子,且该工艺合 理、可行,适合于人凝血酶原复合物的工业化生产,希望对国内生产 PCC制剂的厂家有所帮助,进而促进我国PCC制剂与国际的接轨。
表 3 二次吸附对Ⅶ因子和Ⅸ因子的吸附率的影响
凝胶
A B
Ⅶ因子 残留量% 39.8 35.2
Ⅶ因子总 吸附率% 60.2 64.8
Ⅸ因子 残留量% 6.3 3.5
Ⅸ因子总 吸附率% 93.7 96.5
表 4 每次洗涤液中蛋白含量和是否有凝块
蛋白含量 mg/ml 是否有凝块
1
2
3
4
5
23.0 12.1 7.13 4.03 1.6
参考文献
[1]赵彦鼎.人血源凝血因子Ⅸ纯化研究概况[J];中国输血杂志;2006 年 05 期. [2]刘隽湘.输血疗法与血液制剂.1996.141-141. [3]邬杨斌;余蓉. 凝血 IX 因子复合物的研制.华西药学杂志.20 00. 177-179. [4]陈卫东;董晓燕;孙彦.阴离子交换剂 DEAE — Spherodex M 的蛋白 质吸附性能.化学工程.2004.57-61.
吸附法时,Ⅶ因子的提取率较高。结论:通过工艺条件的优化可得到较高含量的Ⅶ因子,且该工艺合理、可行,适合于人凝血酶原复合物的工业化生产。
关键词:人凝血酶原复合物 凝胶吸附 凝血因子Ⅶ
中图分类号:R654.4
文献标识码:A
文章编号:1674-2060(2015)08-0155-01
凝血酶原复合物(Prothrombin Complex,简称PCC)是从健康 人混合血浆中分离制备的冻干制剂,含有依赖维生素K合成的凝血 因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ。临床上广泛应用于治疗先天性凝血因子Ⅸ缺乏 的乙型血友病所致的出血和治疗肝脏疾病(重症肝炎、慢性活动性肝 炎、肝硬化等)以及维生素K依赖性凝血因子(Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ和Ⅹ)缺乏所 致的出血。在国内由于肝炎发病率很高,因此大量应用在临床肝脏 出血的病人。随着医生的认同,PCC的使用量正在逐年增加[1]。