灵芝发酵液一种蛋白酶抑制剂的纯化与特性
中药发酵研究进展
中药发酵研究进展在现代中药发酵炮制中，研究人员逐渐开始利用现代研究成果，定向改变药物的性能，或根据药物之间的特性有目的进行组合，利用单一菌种，或用混合菌种定向发酵。
如五倍子的发酵炮制，是采用含有根霉菌和L-赖氨酸等物质的酵曲发酵五倍子，通过发酵，克服了鞣酸在肠道内与食物中的蛋白质结合的缺点，显著提高五倍子的收敛作用[7]。
中药发酵主要有液体深层发酵和固体发酵两种，其中中药的现代发酵工艺一般仍采用固体发酵炮制，且在整个发酵过程中力求准确地控制发酵菌种的种类和数量，同时对温度、湿度、酸碱度、通气等工艺因素进行动态控制，提高发酵品质量。
现代中药发酵工艺基本包含了生物发酵工程的全部环节，包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵、产品的分离、提纯等过程[8]。
二、发酵对中药活性成分的影响在中药发酵过程中，由于微生物的生长代谢和生命活动具有强大分解转化物质的能力，并能产生多种次生代谢产物，可以比一般的物理或化学手段更大幅度地改变药性，产生新的化学成分或活性更强的先导化合物。
发酵过程能完成一些化学合成难以进行的反应，主要涉及羟基化、环氧化、脱氢、氢化、水解、水合、酯基转移、酯化、胺化、脱水、异构化、芳构化等化学反应[9]。
发酵对中药活性成分的影响，可以从 4 个方面概括其途径[5]：①微生物在生长过程中产生生物活性物质，包括多种酶、抗生素等。
如米曲霉在生长过程中产生数种蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、酰胺酶、酯化酶、淀粉酶和糖化酶等，酵母在发酵时可产生蔗糖酶、淀粉酶、酒化酶、脂肪酶等。
这些酶类可以催化中药成分的分解，或转化成其他成分，如中药淡豆豉，经过发酵过程，其苷类成分发生了变化，转化为游离的苷元，具有更强的生理活性。
②微生物的次生代谢过程中产生活性化合物。
③中药所含的某些成分可以改变微生物的代谢途径，形成新的成分或改变各成分的相互比例。
④微生物的代谢可以将中药中的有效成分转化成新的化合物，同时微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应，也能产生新的化合物。
灵芝的生物学特性、液体发酵及药理作用的研究进展
Edible and medicinal mushrooms2020，28（2）：107～111灵芝的生物学特性、液体发酵及药理作用的研究进展鲍程谢春阳*（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118）摘要以灵芝生长特性、液体发酵、药理作用为切入点，综合查询近5年发表的收录于中国知网和艾斯维尔等数据库中的相关文献，就灵芝的生物学特性、液体发酵条件、药理作用方面的研究进展进行综述，为更好地开发利用灵芝资源提供依据。
指出现今灵芝的药理作用等基础研究较多，而生长栽培和发酵条件优化的研究报道则较少，而其临床应用的机制则有待进一步探讨。
关键词灵芝液体发酵；药理作用；免疫调节中图分类号：S646文献标识码：A文章编码：2095-0934（2020）02-107-05 Research status of biological characteristics,liquid fermentation and pharmacological effects of Ganoderma lucidumBao Cheng Xie Chunyang（Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）Abstract The purpose of this paper is to provide reference for further research of Ganoderma lucidum.With the keywords of"Ganoderma lucidum,growth characteristics,fermentation and pharmacological effects",the related literature published in the past five years in the databases of China HowNet and Esville was consulted.The growth process,fermentation conditions and pharmacological effects of Ganoderma lucidum were summarized in this paper.At present,there are many basic studies on the pharmacological effects of Ganoderma lucidum,but few studies on the growth,cultivation and optimization of fermentation conditions.The mechanism of clinical application of Ganoderma lucidum needs to be further explored.This review provides a basis for better utilization of Ganoderma lucidum resources.Key words Ganoderma lucidum;growth characteristics;liquid fermentation;pharmacological effect灵芝是我国传统的珍贵药材，隶属担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属，品种多样，资源广泛。
生物发酵技术在化妆品中的应用研究进展
生物发酵技术在化妆品中的应用研究进展摘要：随着消费者对绿色、安全以及功效显著的化妆品需求的持续增长，化妆品产业历经了无数次变革和衍生，其核心竞争力逐步凝聚在安全和功效两方面。
因此，安全且功效突出的化妆品原料及产品在市场中具有良好的前景。
生物发酵技术的应用已经逐步进入化妆品领域，它在保湿、美白、抗衰、舒缓等功效方面均有较好的应用。
生物发酵技术是利用微生物独有的某些功能，采用现代生物工程技术手段，通过工业大规模生产出产品或直接把微生物应用于产品终端。
这已经成为化妆品领域的研发热点及应用方向，越来越多生物发酵技术的应用，大大改善了化妆品的安全性和功效性。
关键词：化妆品；生物发酵技术；功效成分中图分类号:文献标识码：A引言随着国外许多优秀化妆品不断加大力度进军中国市场，中国化妆品行业的竞争日趋激烈，并聚焦于高科技含量产品的创新。
其中，生物发酵技术在化妆品中的研究和应用便成为热点之一。
但是，生物发酵技术真正应用于化妆品的生产制造还需解决很多实际操作方面的难题，包括高产菌株的选育、廉价培养基的筛选及生产工艺参数优化等方面的研究。
1发酵技术在化妆品中的应用现状发酵技术具有悠久的历史，在我国，传统发酵食品的历史可以追溯到约 9 000年前。
当前，以工业发酵进行大规模的物质加工与转化的先进制造技术广泛应用于生产，包括生物基化学品、生物基材料、生物燃料等产品的生产，其涉及食品、制药、能源等许多重要工业领域。
发酵技术是利用细胞的生长特性及生物催化反应体系，与有机物底物发生反应，最终得到目标产物，即生物反应合成物质或细胞。
这一技术不仅改变了底物原有的性能，还能产生新的功效物质。
发酵的形式一般分为两种，一种是液体发酵，另一种是固体发酵。
发酵技术与化学方法相比，具有较好的可控性、较高的安全性、节能、产生的副产物少以及对环境污染少等优点，并且微生物的分解性可以使特殊结构的生物合成保持高度均一，确保产物的安全和功效。
2不同微生物的发酵及产生的功效性成分2.1真菌发酵2.1.1药用真菌发酵我国拥有丰富的药用植物和真菌资源，化妆品中已使用的真菌的种类有三十多种。
三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇
三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究1蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶，广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。
在生物制药等领域，蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。
本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。
一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中，其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。
植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。
研究表明，植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性，其中一些同源物可以分为家族或亚家族。
此外，植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的调节。
植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。
例如，灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质，这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。
另外，复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多种酶的协同作用，达到改善松软度、延长保质期等目的。
二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。
前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。
细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等，具有高效、快速、经济等优势。
细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。
例如，基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶，具有无细胞毒性、操作简单等特点；生产蛋白药物方面，葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白；在食品加工过程中，外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。
三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。
前者主要用于胶原的加工，后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。
真菌蛋白酶的纯化方法有很多种，包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。
真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等条件下均表现出不同的活性和特异性。
灵芝-白灵菇酸奶配方的优化及其营养成分分析
灵芝-白灵菇酸奶配方的优化及其营养成分分析李靖;陈伟;程芳;刘锦绣【摘要】根据响应曲面法的Box-Behnken试验原理,在单因素实验基础上,设计4因素3水平的响应面实验,对灵芝-白灵菇酸奶的配方进行优化,并测定优化后其产品的乳酸菌数、营养成分和风味物质含量。
得到灵芝-白灵菇酸奶的配方：嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌的接种比例为1.17∶1,灵芝与白灵菇发酵液的添加比例为2.24∶1,添加量为20%,CMC添加量为0.21%,发酵温度为41℃。
添加真菌发酵液的酸奶,其乳酸菌数达到108CFU/mL,显著高于对照酸奶107CFU/mL;酸度和持水力也有所提高,蛋白质降解更充分,氨基酸、胞外多糖含量显著高于对照酸奶,乙醛和丁二酮的含量均高于对照酸奶。
%Based on the principle of Box-Behnken design,response surface methodology(RSM) was applied for the optimization of the formula of Ganoderma lucidum-Pleurotus yogurt.Four factors and three levels of response surface experiments were designed according to the single factor experiment.The result showed that the optimal formula of the yogurt were obtained as follows: the inoculation ratio of Str to Lac was 1.17∶ 1,additive proportion of zymotic fluid of Ganoderma lucidum to Pleuro tus was 2.24∶ 1 and accounted for20%,amount of CMC was 0.21%,fermentation temperature was 41℃.Under these optimal conditions,the Ganoderma lucidum-Pleurotus yogurt with superior quality was obtained.In the yogurt with the submerged culture filtrate of fungal,the count of lactic acid bacteria was up to 108cfu/mL,which was significantly higher than the control yogurt(107CFU/mL).The acidity and WHC also were increased.Protein was degradedmore fully.The content of amino acids was increased significantly.The content of polysaccharide was significantly higher than that in the control yogurt.The levels of Butanedione and acetaldehyde were higher than those in the control yogurt.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)006【总页数】6页(P122-127)【关键词】灵芝;白灵菇;酸奶;响应面;乳酸菌【作者】李靖;陈伟;程芳;刘锦绣【作者单位】山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018【正文语种】中文【中图分类】TS275.5酸奶中的碳水化合物容易被人体消化，蛋白质易于吸收，维生素和矿物质代谢含量丰富。
灵芝发酵工艺流程
灵芝，自古以来就被誉为“仙草”，具有极高的药用价值和营养价值。
灵芝发酵工艺是现代生物技术在灵芝领域的重要应用之一，通过科学合理的发酵过程，可以有效提高灵芝的活性成分含量，改善其药理作用，从而更好地发挥灵芝的功效。
本文将详细介绍灵芝发酵工艺流程的各个环节，包括菌种选育、培养基制备、发酵条件控制、产物提取与纯化等。
一、菌种选育菌种选育是灵芝发酵工艺的基础和关键环节。
优质的菌种具有生长快、产孢多、活性成分含量高等特点，能够为后续的发酵生产提供良好的基础。
目前，常用的灵芝菌种选育方法主要包括自然选育、诱变选育和杂交选育等。
自然选育是指从自然界中分离筛选出具有优良特性的灵芝菌株。
通过采集灵芝的子实体、孢子或土壤等样本，在特定的培养基上进行培养和筛选，从中选诞辰长良好、形态特征符合要求的菌株。
自然选育虽然简单易行，但效率较低，且难以获得具有突破性的优良菌株。
诱变选育是利用物理、化学或生物等因素对灵芝菌种进行诱变处理，使其发生基因突变或染色体畸变，从而产生具有新特性的菌株。
常用的诱变方法包括紫外线照射、射线辐射、化学诱变剂处理等。
诱变选育可以在较短时间内获得大量变异菌株，提高筛选优良菌株的效率，但诱变产生的变异具有随机性，需要进行大量的筛选和鉴定工作。
杂交选育是将两个不同来源的灵芝菌株通过有性杂交的方式进行基因重组，获得具有优良性状的杂交菌株。
杂交选育可以综合两个亲本菌株的优点，克服其各自的缺点，获得具有更强适应性和更高活性的菌株。
但杂交选育技术难度较大，需要对杂交过程进行严格的控制和管理。
在菌种选育过程中，还需要对筛选出的菌株进行性能测试和鉴定，包括菌株的生长特性、产孢能力、活性成分含量、稳定性等方面的测定。
只有经过严格筛选和鉴定的优良菌株才能用于后续的发酵生产。
二、培养基制备培养基的质量对灵芝的生长和发酵产物的形成具有重要影响。
合理的培养基配方能够提供灵芝生长所需的营养物质，促进其快速生长和代谢活动，同时有利于活性成分的积累。
灵芝液体发酵流程
3.制备培养基：根据所选的菌种和发酵需求制备培养基，并进行必要的消毒处理，以避免细菌污染。
二、灵芝液体发酵阶段。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
在完成准备工作后，即可开始进行灵芝液体发酵。
1.搅拌培养基：将准备好的培养基倒入发酵罐中，并用搅拌器将其充分搅拌均匀，以便后续的灵芝发酵。
灵芝液体发酵流程
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三、收尾工作阶段。
在灵芝液体发酵完成后，需要进行一些收尾工作，以保证发酵效果的完美。
1.分离发酵产物：将发酵产物与培养基分离，获取纯净的灵芝提取物。
灵芝的液体发酵与菌种制作
灵芝的液体发酵与菌种制作1、生产流程摇瓶培养基制备→灭菌→培养基→灭菌→斜面菌种→接种→摇瓶培养→种子槽发酵→发酵槽发酵→放缸→菌丝和发酵液分离→分别烘乾→培养基配制→灭菌→磨粉直接应用或提取→成品2、斜面菌种制备液体发酵用的斜面菌种，必须生命力强，菌龄期要短，接种后能迅速生长，否则就会感染杂菌，斜面菌种以菌龄10～14天，刚长满试管的为宜。
斜面菌种培养基斜面菌种培养基配方种类很多不一定局限哪一种。
常用的培养基有：a.PDA斜面培养基马铃薯200～250g、葡萄糖20～25g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
制法：马铃薯去皮、切成薄片，称取200g，加水1000ml，煮沸15～20分钟左右，到薯片酥而不烂止，取滤汁，加琼脂，继续煮，待琼脂全部溶解，再加葡萄糖20g，搅拌，使之全部溶解，再补充水至1000ml，装入试管，装量为试管高度的1/5～1/4，塞上棉塞，1.05kg蒸气压保持20～25分钟，灭菌，摆成斜面即可。
b.PDA综合培养基马铃薯200～250g、葡萄糖20～50g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂20～50g、水1000ml、自然pH。
制法与PDA培养基同。
c.玉米粉葡萄糖培养基玉米粉20～25g、葡萄糖15～20g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
制法：玉米粉40克，加水1000ml，煮沸，保持30～35分钟，不断搅拌，然后用密及纱布过滤，取滤液，以下与PDA培养基制法同。
然后灭菌制成斜面。
3、摇瓶菌培养培养基玉米粉1%、葡萄糖3%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、自然PH。
制法：玉米粉加些许的水，均匀的搅拌，加热至微沸，保持1hr，取过滤液，再加入其他成分并补充水至1000ml，搅拌，分装於500ml 约三角瓶中，每瓶装200ml，用密及的纱布包口，包上不透气纸，灭菌锅1.05kg蒸气压（121℃）30～35分钟灭菌。
4、接种方法在无菌箱或接种室中，用接种针挑取试管表面菌种，并将其割碎，接入灭菌的三角瓶培养基中，每管接1瓶，24～28℃摇瓶培养，摇瓶速度每180次/分，培养5～7天，当培养液呈清澈透明状，培养液中充满菌球时，即可终止摇瓶，作菌种发酵灌接种用。
微生物多糖提取与纯化
鲜香菇碱提: 鲜香菇50g 加蒸馏水50ml 打浆,再 加0. 4mol/ L 的NaOH 100ml ,5 ℃浸提24h ,过 滤,滤液浓缩后加甲醇等同三氯乙酸浸提。鲜香 菇酸提: 鲜香菇50g 加蒸馏水50ml 打浆,再加入 2mol/ L 的乙酸100ml ,5 ℃浸提24h ,过滤,滤液 浓缩后加甲醇等处理同三氯乙酸浸提。
LPS 粗品的制备：菌悬液反复冻融三次后，与等 量9 0 % 苯酚共同加热至68℃后混合，剧烈搅拌 30min 后，冰浴至2℃离心(4℃，3000 × g， 20min)。酚相加等体积无热原水重复洗涤2 次， 收集水相溶液装于透析袋中，流水透析12h去酚， 再蒸馏水透析60h(FeCl3 检测无紫色出现为止)， 可用50% 聚乙二醇6000 浓缩至1/4，即得LPS 粗品。 LPS 的纯化：浓缩后粗LPS中加DNase和 RNase各50μ g/ml，37℃下酶解4h，100℃水 浴加热10min，冷却至室温后离心(1500r/min， 30min)，弃沉淀，于上清中加2 倍体积丙酮，沉 淀后既可获得纯化LPS 。
香菇多糖的提取与纯化工艺
香菇(Lentinus edodes)是侧耳科(Pleara taco) 的担子菌，含有多种有效药用成分。尤其是香菇 多糖(Lentinan，LNT)，是一种宿主免疫增强剂 (Host defense—tiator，HDP)，它具有抗病毒、 抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 1969 年日本学者千原率先证实了香菇热水提出 物的抗肿瘤活性,羽田、佐木进一步研究证实其有 效成份是香菇多糖,Coro Chi2hara 从香菇子实 体中浸提出6 种香菇多糖,并证明其中一种具有明 显的抗肿瘤作用, 定名为Lentinan 。1980 年恂 二等确认香菇多糖为Th 细胞激活剂,它使机体免 疫功能得到恢复和提高而杀灭肿瘤细胞,可用于辅 助癌症治疗。
灵芝的生理学特性
灵芝的生理学特性构成灵芝菌丝体和子实体的物质基础是各种化学元素。
这些化学元素又组合成许许多多的化合物；由这些化合物构成了有生命活动的灵芝。
灵芝的生命活动主要是不断的从外界的基质中吸收各种化学元素及各种化合物用以构成自己；同时又不断地将其自身的一些化合物分解、氧化，以释放出其生命活动时所需要的能量；并且不时的将其代谢过程中产生的一些对其自身无用的或者是多余的废物或代谢产物排出。
一、灵芝菌丝的主要化学成分组成灵芝菌丝的化学成分与其它生物相同，主要是水、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类及各种无机盐类。
构成这些化合物的化学元素有几十种；其中含量较多有碳、氢、氧、氮、磷、钾、镁、硫、钙、铁、钠、铜、锰、锌及氯等等；其中碳、氢、氧、氮、硫、磷等六种元素含量最多，约占细胞总重量的95%以上。
其它元素的含量很少，称之为微量元素。
这些元素在菌丝内绝大多数是以化合物的形式存在，可分为无机化合物与有机化合物两大类。
（一）无机化合物1.水菌丝中90%以上是水。
在菌丝内的水包括二类：（1）结合水：与其它化合物结合起来的水分子，在一般的物理因素影响下很失去，也不能流动。
（2）自由水：是以游离状态存在的水。
它是菌丝内重要的溶剂、能溶解各种营养成分及代谢产物。
它在菌丝内起着贮存、运输的作用。
2.无机盐类：主要是指那些以离子状态存在的各种元素。
如K+、Ca2+、Mg2+、Po3-、Ce2-等等。
这些离子在菌丝内的总重量约占菌丝总重量的0.3%～0.9%左右。
其中含量最多的是磷，约占菌丝总重量的0.15%～0.45%，它是以磷酸根的形式存在，并经常是与其他元素共同组成磷脂、核苷酸、二磷酸腺苷（A TP）等有机化合物，成为菌丝的重要组成成分。
其它微量元素也很重要，其中的一些元素是酶的活性基因或者是酶的激活剂。
（二）有机化合物1.碳水化合物（糖类）它包括有D-葡萄糖等单糖，麦芽糖、蔗糖等双糖，以及肝糖原等多糖类，和多种有机酸、醇、酚等化合物；其中含量最多的是多糖类。
菌类原料的名词解释
菌类原料的名词解释引言：菌类原料是指从真菌或菌类培养物中提取的物质，广泛应用于食品、医药、农业等领域。
本文将对菌类原料的一些常见名词进行解释，从它们的定义、特点以及应用领域等方面进行探讨。
一、菌丝体菌丝体是真菌的基本组织结构，也是真菌生长的主要形态。
菌丝体由细长的菌丝组成，菌丝之间相互交织形成复杂的网络。
菌丝体可用于生产多种菌类原料，如菌丝体发酵产生的多糖、酶等。
由于菌丝体结构独特，能够提供良好的生物活性物质产出，因此在医药、保健品等领域有广泛的应用。
二、菌种菌种指的是菌类的种类，是一种特定的真菌品种。
菌种的选择对菌类原料的品质和产量有着重要影响。
常见的菌种有食用菌类如香菇、平菇等，以及医药领域常用的木耳、灵芝等。
不同菌种在生长条件、适应性和生物活性物质产出上有所差异，因此在选择菌种时需要综合考虑不同需求。
三、菌核菌核是指真菌内部形成的一种球状结构，它在真菌的生殖过程中起到保护和传播孢子的作用。
菌核中富含蛋白质、多糖等营养成分，并且具有一定的生物活性。
通过提取菌核，可以获得丰富的菌类原料，如多糖、氨基酸等。
菌核在食品、保健品、化妆品等领域具有广泛应用，尤其是一些菌核中特殊的生物活性成分能够对人体健康产生积极影响。
四、发酵液发酵液是指在菌种或菌株培养中，通过微生物代谢产生的液体。
发酵液中含有菌体、菌丝、代谢产物等多种成分。
发酵液中的菌类原料主要包括多糖、酶、多肽等。
发酵液被广泛应用于食品、饮料、保健品等行业，如利用发酵液生产的植物酵素可以用于食品加工中的蛋白酶替代，具有一定的食品改良功能。
五、菌株菌株是指由同一种菌种分离的、经一定培养和筛选得到的纯种菌。
菌株的选择对菌类原料的质量和产量有重要影响。
菌株的选择需要考虑其菌丝生长速度、菌核形成能力、抗病能力等特性。
通过菌株的筛选和培养，可以获得高产和高品质的菌类原料，满足不同领域的需求。
六、提取工艺菌类原料的提取工艺是将菌类中所需的有效成分分离和提取的过程。
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收稿日期： !"", -"( -!. 作者简介： 田亚平， 女， 博士研究生， 副教授， /01 ： （ "#." ） #2(#",+ ， 3-4%51 ： &%657895%7: ;<94%51= ><4=
及食品技术中。近 年 来， 不断有新的蛋白酶抑制剂 被发现、 提取和合成。灵芝含有多种生物活性成分， 是一种具有广泛药 理 活 性 的 药 用 真 菌， 其中的主要 成分灵芝 多 糖 具 有 抗 肿 瘤、 增 强 免 疫 力 的 作 用［ . ］，
。本文对灵芝发酵液中的蛋
白酶抑制剂 "#%&! ! 进 行 了 分 离 纯 化， 并对其抑制 特性进行了研究， 这将为揭示蛋白酶抑制剂与发酵 灵芝液的药理活性之间的关系建立一定的基础。
!" 实验部分
! ! !" 仪器与试剂 ’ ’ ()!*! +,-./0+0 ’)) 型 中 压 色 谱 系 统 （ %120$ 32452 ） ， 6575 -0/8+57 ! 型电泳 仪 （ 95/$:2; ） ， ’’)) 高效液相 色 谱 仪 （ !<5.+78 ） ， 其 余 为 国 产 常 规 设 备。 =>-+0;+, !)) 凝 胶 色 谱 柱 （ ") 43 ? ’* ’ 43 5* ;* ） 及 =/>04+ ") @ 离 子 交 换 色 谱 柱 （ ’) 43 ? ’* % 43 5* ;* ） 购自 %12032452 公 司。 灵 芝 发 酵 液 由 本 课 题 组制备， 所用试剂为分析纯。 ! ! #" 色谱条件 ’ ’ 凝胶色谱： 流动相为 $) 33/. A # 的磷酸钠缓冲 液 （ -B &* ) ） ， 每管收集 ’ 3# ，流速为 ’ 3# A 357 ， 在 !() 73 波长下进行紫外检测。 ’ ’ 离 子 交 换 色 谱：流 动 相 ! 液 为 $) 33/. A # 的 *05C$BD. 缓 冲 液 （ -B (* ( ） ， 9 液 为 $) 33/. A # 的 *05C$BD. 缓 冲 液（ 含 ’ 3/. A # E2D. 溶 液 ） （ -B (* ( ） 。洗脱模式： 以 ! 液 洗 脱 ! 倍 柱 床 体 积 后， 以 ) F 9 液 #$’)) F 9 液 线 性 梯 度 洗 脱 ’) 倍 柱 床 体 积， 每管收集 $ 3# ，流速为 ! 3# A 357 ，在 !’$ ， !() 73 处进行双波长紫外检测。 ’ ’ 高效液相色谱： D’( 色谱柱 （ ’!$ 33 ? #* ) 33 ； 流动相 ! 为 !) 33/. A # 醋酸钠溶液， 流动相 5G ;G ） 9 为 !) 33/. A # 醋 酸 钠 溶 液 $ 甲 醇 $ 乙 腈 （ 体积比为 ’ + !+ ! ） ， 梯度洗脱， 流速 ’* ) 3# A 357 ； 柱温 #) H ； 进 样量 $ " # ； 检测波长 ""( 73 。 ! ! $" 实验方法 ’ ’ 样品的粗分离： 取灵芝发酵液’ ))) 3# ， 旋 转真 空浓缩为原来的 ’ A $ 后， 加入乙醇至乙醇体积占溶 液总体积的 ") F 后， 以( ))) 0 A 357 的速率离心去除 沉淀， 上清液中继续加入 乙 醇 至 其 体 积 分 数 为 () F 后， 离 心 收 集 所 得 沉 淀， 即得乙醇分级沉淀部分 。 （ ") F I () F ） ’ ’ 抑制剂的粗提 取： 将前述乙醇分级沉淀部分复
图 # " 4+0*(& $% 5 阴离子交换色谱纯化抑制剂冻干粉 "#$! # " 6)*+,-.+$*-, +/ #2)#3#.+* 7+81&* 39 -2#+2 &:()-2$& ()*+,-.+$*-7)9 6/L5.+ -12C+ ：! ，$) 33/. A # *05C$BD.（ -B (* ( ） ；9 ，$) 33/. A # *05C$BD. 4/7825757< ’ 3/. A # E2D.（ -B (* ( ） G JKK.>+78 4/..+485/7 ：$ 3# A 8>L+G M+8+485/7 O2P+.+7<81 ： C/.5; .57+ ，!() 73 ；;/88+; .57+ ，!’$ 73G 图 ! " 抑制剂粗品的凝胶色谱图 "#$! ! " %&’ ()*+,-.+$*-, +/ (*01& #2)#3#.+* JKK.>+78 4/..+485/7 ：$ 3# A 8>L+G M+8+485/7 28 !() 73G ’ ’ ! 0 ：’ G ’() ))) ；! G "#$ #) ))) ；" G "#$ !) ))) ；# G N ’) ))) G
［(］
#" 结果与讨论
# ! !" 蛋白酶抑制剂的分离纯化 # ! ! ! !" 凝胶色谱 ’ ’ 称取 “’G "” 节所制备的抑制剂粗品 ") 3< ， 溶解 于 ’* ! 3# )* )$ 3/. A # 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ -B &* ) ） 中用于凝胶色谱分离， 结果见图 ’ 。
发酵滤液和菌丝体 中 同 样 具 有 多 种 蛋 白 质、 多肽和 多糖等生 物 活 性 物 质［ & ］。 本 课 题 组 曾 在 提 取 和 筛 选酵母蛋白 酶 ! 抑 制 剂 时 从 灵 芝 发 酵 液 中 提 取 到 一种对 蛋 白 酶 ! 有 较 强 抑 制 作 用 的 糖 蛋 白 "#$ %&! ’ ， 其相对分 子 质 量 为 "( ))) ，并 对 其 作 用 条 件 进行了一 定 的 研 究
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谱
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灵芝发酵液中蛋白酶抑制剂 !"#$%! 的纯化及其特性
田亚平， & 章克昌
（ 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 !.,"’( ） 摘要： 采用乙醇分级沉淀、 凝胶色谱纯化、 阴离子交换色谱分离等步骤从灵芝深层 发 酵 液 中 提 取 得 到 蛋 白 酶 抑 制 剂 ’()*+ . 与 ’()*+ ! 。其中 ’()*+ ! 仅在 !.# ,- 处有紫外吸 收， 经 十 二 烷 基 硫 酸 钠.聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 鉴 定 为 单 一条带， 相对分子质量为 .# """ 。由其氨基酸组成分析谱图 可 看 出， 其 酸 性 氨 基 酸 含 量 较 高， 碱性氨基酸及芳香族 它对天冬氨酸族的胃蛋白酶和酵母蛋白酶 + 有相对较 氨基酸含量较低。 ’()*+ ! 抑制剂的底物特异性研究表明， 强的抑制作用。 关键词： 凝胶色谱； 阴离子交换色谱； 纯化； 蛋白酶抑制剂； 灵芝； 深层发酵 中图分类号： /(#2? ? ? 文献标识码： +& & & 文章编号： .""" .2).’ （ !""# ） "’ ."!() ."’
Hale Waihona Puke ・ !%(・色谱
第 !" 卷
灵芝酸有抗艾滋病 的 作 用［ ! ］， 糖蛋白有抗滤过性病 毒的 作 用 用
［$， %］ ［"， #］
溶于磷酸盐缓冲液中， 以 , $)) 0 A 357 离心除去不溶 物， 取上清液冻干， 即为抑制剂粗品。
， 一些蛋白质还有免疫活性等作
。适合于大规模 工 业 化 生 产 的 灵 芝 液 体 深 层
%43,’+*, ：+ 3<"=94,2>9 4,;4?4="< ’()*+ ! @2> 3A<4B49C =" ;"-"59,94=D B<"- A’.)/#*B’ 3052/C 0B ?D >A?-9<59C B9<-9,=2=4",$ 0;9 3A<4B4:2=4", @2> :2<<49C "A= ?D 9=;2,"# B<2:=4",2# 3<9:434. ，59#.B4#=<2=4"