第二章-组培
药用植物组织培养
药用植物组织培养一、名词解释：1、初代培养:从植物体上别离下来的第一次培养叫初代培养，或叫第一代培养。
2、继代培养：以后将培养物转移到新的培养基上进展培养称为继代培养，也可细分为第二代培养，第三代培养。
3、药用植物组织培养: 是以现代生命科学理论为根底，结合化学学科的科学原理，采用先进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进展其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。
4、外植体：是指由活植物体上切取下来以进展培养的那局部组织和器官。
5、培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养要求而人工配制的营养基质。
它通常含有无机元素、维生素、氨基酸、糖类、植物生长调节物质、固化物、活性炭、天然提取的营养物、水组成。
是植物组织生长的物质根底，也是植物组织培养能否成功的重要因素之一。
6、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口外表形成的一团薄壁细胞。
在组织培养中，那么指在人工培养基上由外植体上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
7、胚状体：指的是在植物组织培养中起源于一个非合子细胞〔合子细胞：两性配子相融合形成的新细胞〕，经过胚胎发生和胚胎发育的过程形成双极性的胚状构造。
8、细胞分化:是细胞功能特化的过程9、细胞脱分化：是指一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象。
即失去已分化细胞的典型特征。
10、细胞再分化：是脱分化的分生细胞重新恢复细胞分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定构造和功能的细胞。
11、外植体：是指用于无菌培养的离体植物材料。
即泛指第一次接种所用的植物组织、器官等一切材料。
选择适宜的植物材料是进展组织培养关键的一步。
12、愈伤组织的继代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，次生代产物的积累，原有的培养基已不适宜愈伤组织的生长，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做愈伤组织的继代培养。
13、植物离体快速繁殖:是指利用植物组织培养技术进展的一种营养繁殖方法，又称微体快繁。
【安徽】中职农业生物技术(主编曹春英、丁雪珍第二版 高教版)教案：第二章 植物组织培养技术04
第三节植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节植物组织培养操作技术（2）。
二、学时安排2学时。
三、教学目标1．掌握培养基的作用。
2．掌握培养基中生长调控物质的作用。
3．了解培养基的类型。
四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。
难点：培养基中生长调节物质的作用。
五、教具电化教学设备。
六、教学方法讲授法，演示法。
七、教学过程Ⅰ.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。
II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。
配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。
没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。
（二）培养基的种类1.培养基的种类划分2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
常用的培养基配方：表1 常用培养基配方只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。
常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物来提供。
第二章——植物组织培养实验室
D、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水 洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。
E、除菌过滤器
除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后 用蒸馏水冲洗，晾干备用
（二）灭菌技术
1.灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、 超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）如：火烤后的物体；
（二）药品贮存和配制仪器设备
1.冰箱 • 作用：低温保存材料，存放药品、
培养基母液、激素、酶制剂。
2.天平
• 陈列于制备室中 • 作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
3.酸度计
• 陈列于制备室中 • 作用：测定培养基及酶制剂的pH值
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
（三）观察分析仪器设备
5.摇床和旋转床
• 进行液体培养时用以改善气体状况
小型臭氧发生器
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
三、玻璃器皿及用具
（一）玻璃器皿 1.培养器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 2.分注器 类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、
量筒漏斗式分注器 3.其他玻璃仪器 烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等
组培
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。
器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层。
薄壁组织。
叶肉组织。
胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
中文名称：植物组织培养英文名称：plant tissue culture 定义：在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。
1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。
1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。
不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。
在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
组织培养
组织培养复习提纲：一．名词解释植物组织培养：在无菌条件下，植物体的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程。
体细胞胚状体：在离体或活体条件下，体细胞经“原胚期-球形培期-心形培期-鱼雷培期-子叶期”等阶段形成的胚。
细胞全能性：植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息。
人工种子：将植物离体培养产生的体细胞胚报埋在营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。
细胞质杂种：一方亲本的细胞核和细胞质及另一方亲本的全部细胞质融合，可使两种来源不同的核外遗传与一个特定的核基因结合在一起，这种杂种称为细胞质杂种。
外植体：在组培中，从活植物体上取下以进行培养的部分。
茎段培养：带有腋芽（侧芽）或叶柄、长数厘米的茎段进行离体培养。
指示植物：可以呈现病毒在病的植物上出现的枯斑和某些病理症状来鉴别病毒的植物。
愈伤组织：在组培中，在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长、高度液泡化、呈无定形态的薄壁细胞。
体细胞杂交：以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。
再分化：从愈伤组织再生出小植株的过程。
植物快速繁殖：应用组织培养技术,快速繁殖名优特新品种,使其在较短时间内繁衍较多的植株;快速繁衍珍稀濒危植物,使物种得以保存。
衰退现象：长期继代培养的材料会逐渐衰退，丧失形态发生能力（生长不良，再生能力下降，增值率下降）。
离体保存：将组织和细胞培养中的外植体或试管苗贮存在使其抑制生长\缓慢生长\无生长的条件下，达到长期保存的方法。
驯化现象：植物组织经长期继代培养，在其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长的想象。
原生质体融合：同体细胞杂交脱分化：由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组织的过程。
细胞进入分裂状态。
细胞悬浮培养：用液体培养基对保持良好的分散状态的单个细胞或小的细胞聚集体于摇床上进行培养的方法。
植物组织培养
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不 能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
• （2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成
小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养 基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细 胞分裂，维持不分化状态。
• （3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能
各异的细胞。
②愈伤组织的生长特性
（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤 组织表面形成一层愈伤组织， Callus的细胞数目迅速增 多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可 以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
组织培养的奠基人
细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
第二章： 愈伤组织培养
一）、 愈伤组织形成
1 、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细
胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定 状态。
在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成 分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起 源。
根发生在组织的深处，与整体植株发生类似， 是内起源。
愈伤组织的外部形态也随分化而改变，一般 由疏松转向紧密。
• 无论在MS还是在H或B5培养基中，不附加激素2, 4-D均不能诱导 扁桃花药愈伤组织的形成，
• 扁桃花药在H+1.0mg/L 2,4-D的培养基上诱导率最高为47%;在 MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上诱导率为67.0%;在B5+0.5～ 1.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D为0.5mg/L时， 出愈率高达100%.。说明在扁桃花药诱导过程中，最适基本培养 基是B5，最佳 2,4-D浓度为0.5mg/L。
分裂期：
外植体(explant)中已分 化的活细胞在外源激素的作 用下，外植体外层细胞出现 了分裂，由于外层细胞的迅 速分裂使得这些细胞的体积 缩小，逐渐回复到分生组织 状态，该时期细胞通过脱分 化的起动期而进入分裂，并 开始形成愈伤组织。
分裂期特征：
生理生化上分裂期的一个明显特征 是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不 分裂。另外还有细胞数目增加，体积变 小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量 达到最高等。
• 此时期的愈伤组织：细胞分裂快， 结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅 而透明。
分裂期愈伤组织
形成期：
• 细胞分裂从分裂期的周缘细胞分 裂为主逐渐转向内部的组织细胞， 愈伤组织表层细胞分裂减缓或停 止，内部深层细胞分裂并形成像 维管束或类似于分生组织组成的 鸟巢状结构的次生组织。
组织培养 植物组织培养基本操作
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
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大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
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⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
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4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
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5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
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植物组织培养学PPT课件
• 培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根
据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空 间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火 的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最 低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1．7m左右。 培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长 I．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。
• ②生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求 而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20— 30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由 于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供 规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
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植物细胞全能性的表达
• 脱分化（dedifferentiation)：将来自已分 化组织的已停止分裂的细胞从植物体部 分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞 的分裂活性。
• 再分化（redifferentiation):经脱分化的组 织或细胞在一定的培养条件下可有转变 为各种不同细胞类型的能力。
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接种室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板 及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以 减少开关门时的空气扰动。
接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1～2 盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使 室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。
接种室应设有缓冲问，面积1m2为宜。进入无菌操作室 前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最 好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
植物组织培养绪论第一章第二章大纲
一、植物组织培养的广义含义(tissue culture)在无菌条件下，将离体植物的器官、组织、细胞或原生质体在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件使其长成完整植株的过程或生产具有经济价值的其他产品的技术。
也称离体培养（Invitro culture）。
二、此定义内涵：1、无菌条件（asepsis)：外植体、培养基、培养容器、接种工具、操作环境、培养环境等。
2、外植体（explant）：健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。
包括营养器官、生殖器官、组织、细胞等。
3、培养基（culture medium)：是植物组织培养的重要基质，它提供植物生长所需的营养物质。
人工配制，成分确定。
4、组培的理论基础：植物细胞的全能性（totipotent）。
5、激素：调控培养物的状态和发育方向，实现不同的实验目的。
6、封闭培养：通过封口材料实现气体交换。
7、培养条件（ culture condiction）:人为控制。
*植物组织培养的狭义含义指对植物体所有组织如分生组织、胚乳组织、薄壁组织、花药组织、愈伤组织的培养。
本课程所涉及的组织培养若无特殊说明均指广义含义。
三、植物组织培养的四要素（1）无菌（2）培养材料：①器官：根、茎、叶、花、果实②组织：花药组织、胚乳、皮层等③细胞：体细胞（2n）、生殖细胞（n）④原生质体（3）培养基（4）培养条件：温度、光照、湿度等四、与组培有关的术语及理论1、植物细胞全能性（totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
原理：植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，植物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
潜在全能性的原因：基因表达的选择性。
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。
第二章-组培
第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术第一节植物组织培养的基本理论一、植物细胞的全能性及其表达1. 植物组织培养（Plant tissue culture）：在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。
外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。
分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture, shoot apex culture, apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture)2. 植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下进行表达，具有分化发育成完整植株的潜能，称为~。
植物组培诞生的理论基础。
不同类型细胞全能性的强弱：卵细胞＞茎尖、根尖分生组织＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化）＞特化细胞（筛管等细胞）。
3. 植物细胞全能性的表达全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为~。
全能性只是一种可能性。
完整细胞核具有该植物体全套的遗传信息，是全能性表达的内因。
全能性表达须满足2个条件：1）脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制；2）营养和激素，使其脱分化与再分化。
二、植物细胞的脱分化与再分化1. 细胞分化（Cell differentiation）定义：指在个体发育中，由同一种细胞类群经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同细胞类群的过程。
细胞分化是组织与器官分化的基础。
细胞分化的本质是基因差别表达。
通过组培研究，揭示细胞的分化规律：1）成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。
第二章植物组织培养基本操作
第⼆章植物组织培养基本操作教学⽬的：了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本⽅法。
职业技能教学点：具有植物组织培养基本操作程序的认知。
能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能⼒，具有选择外植体、表⾯灭菌、⽆菌接种等基本能⼒；具有植物组织培养条件控制基本能⼒；有进⾏组培苗驯化练苗的基本能⼒。
教学时间：10学时教学重点：各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表⾯灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽⽅法。
教学难点：各类培养基特点，培养基制作及⾼压灭菌操作，外植体的表⾯灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。
教学内容：第⼀节培养基成分、种类及特点植物⽣长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。
离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于⽔，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的⽆机盐。
培养基是根据植物⽣长所需营养成分，配制成的供植物⽣长的⼈⼯制作的营养物质。
⼀、培养基的成分不同植物组织器官所需要的营养条件不完全⼀样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基⼀般包括⽆机盐、有机化合物和⽣长调节剂三⼤基本组成成分。
1、⽆机盐类离体组织⽣长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：⼤量元素—植物所需元素的使⽤量⼀般在每升⼏⼗-⼏千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素—植物所需元素的浓度⼩于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。
除C、H、O外，其它矿质元素通常以⼀定浓度的⽆机化合物形式，按⼀定⽐例配制⽽成，溶于⽔中以离⼦态被吸收，N有硝态氮KNO3和铵态氮（NH4）2SO4两类提供。
2、有机化合物培养基中只有⽆机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的⽣长，还需添加有机成分，常⽤有糖类、维⽣素、醇类、嘌呤、氨基酸等。
第二章 植物组织培养快速繁殖
第二章：植物组培培养快速繁殖目的要求：1.掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；2.掌握培养基的种类、特点；掌握基本培养基的配方；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；熟练掌握培养基的灭菌方法；一般掌握培养基的筛选办法。
3.了解组培快繁的类型，重点掌握无菌培养物的建立。
4.掌握植物组培快繁中常见问题的解决措施。
教学重点、难点：基本培养基的配方；培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；培养基的灭菌方法；培养基的筛选办法。
第一节植物组培快繁的工厂化生产设施在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。
实验室的大小取决于工作的目的和规模。
以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。
在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。
植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。
要做到无菌的条件，首先需要一定的设备、器材和用具。
一个标准的组织培养实验室应当包括：普通实验室（洗涤室、培养基配制室）、无菌接种室、恒温培养室、观察培养情况并作记录的细胞学实验室等。
在实际中可结合可行条件，合并一部分。
实验室的大小和设置可根据自己的工作性质和规模自行设计，其中最主要的是无菌操作室和恒温培养室。
一、植物组培快繁场地设计（一）组培快繁场地的选择无菌环境，周围安静、无污染，阳光充足，无高大建筑物遮挡，交通便利。
（二）组织快繁厂房的设计1.药品贮藏间面积10~15m2，需终年保持相对较低的温度和较好的通风干燥条件，同时需要遮光。
2.药品配制间面积15m2左右，需抗盐酸、牢固、平稳，具有较好抗震性的试验台。
3.玻璃器皿洗涤间（cleaning room）面积20m2左右，本室主要用于组织培养所需玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。
植物组织培养的培养条件
Auxins——生长素
溶于95%乙醇或 1mol/LNaOH
诱导细胞的分裂和根的分化
培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响
No NAA
NAA reduced to 0.1 mg. l-1
NAA increased to 5.0 mg. l-1
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
CoCl2.6H2O 0.025 mg/L
Na2.EDTA
37.3 g/L
FeSO4.7H2O 27.8 mg/L
一、母液的配制与保存
培养基母液：培养基各类溶液的浓缩液。
一、母液的配制与保存
• 培养基母液：配制母液不但可以保证各物 质成分的准确性及配制时的快速移取。一 般母液配成比所需浓度高。
第一节 植物组织培养的条件
1. 植物组织培养最基本的前提条件：用于培 养的外植体细胞必须具有全能性
2.离体隔离 3.适宜的培养条件
环境条件：光照、温度、湿度。 营养条件：培养基。
一、环境条件
温度
植物组织培养在最 适宜的温度下生长分 化才能表现良好，大 多数植物组织培养都 是在23-27 ℃之间进行，
无机盐浓度高、元素间比例适当,离子平衡性好，具 有较强的缓冲性，是目前使用最广泛的培养基。
White培养基特点：
无机盐、有机成分含量较低，适用于生根培养。
一、常用培养基特点
B5培养基 特点：
含较高的NO3-N，氨态氮含量较低，含有 较高的硫胺素（VB1）较适用于一些要求较 高氮素营养的植物培养，如常见木本植物 双子叶植物组培的选择
Murashige and Skoog (MS） Medium
广西职业技术学院植物组织培养概论教案第二章 植物组织培养的基本知识
教具：
白板笔
教学过程：
1、导言：
植物组织培养不仅能使处于分生状态的细胞继续保持分裂能力，同时也可使永久组织的细胞恢复分裂能力，如同生殖细胞或合子胚一样，其原因何在呢？这一章我们就一起来探究这个问题。
2、课前提问：
植物组织培养之所以取得成功得益于植物细胞的什么特性？
3、采用的实例：
甘蔗的成苗过程
4、板书设计：
第二章植物组织培养的基本知识
第一节植物组织培养的基本原理，思路及特点
一、组培的原理：
二、植物离体分化成苗的五种类型：
1.无菌短技型
2.丛生芽增殖型
3.器官发生型
4.胚状体发生型
5.原球茎型
三、组培所经历的五个基本阶段：
1.0阶段（准备阶段）
2.初代培养阶段
1.天平
2.灭菌锅
3.烘箱
4.冰箱
5.蒸馏水器
6.酸度计
7.显微镜
8.空调机
9.振荡培养机
10.培养架
三、组培必要的器皿
1.玻璃器皿
2.金属器械
3.器皿的清洗
5、小结
6、思考题：
植物离体分化成苗的五种类型中，不容易产生变异的有哪几种？
3.增殖阶段
4.保长和生根阶段
5.移栽阶段
四、组培的特点：
1.培养材料经济
2.培养条件可人为控制
3.生长周期短、繁殖率高4.管理方源自，利于自动化控制教学内容与设计
第二节组培商业性实验室的基本设备
一、实验室的设置：
1.化学实验室
2.接种室
3.培养室
4.洗涤室
5.观察室
6.贮存室
7.温室
植物组织培养的意义
一 植物组织培养的意义
外植体〔explant〕：从植物体上分离下来 的用于离体培养的材料。 胚乳 分生组织
组织
种子
成熟组织
原生质体
花粉
根 茎
花梗 胚珠 子房 花器 花托 花药 苞片
子叶 胚 胚轴
果实 幼苗
芽
叶 叶柄
一
植物组织培养的意义
（二）、植物组织培养的分类
固体培养
1.根据培养基分类
液体培养
对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。
二 植物组织培养发展简史
植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：
一、探索阶段 二、奠基阶段 三、迅速发展阶段
二 植物组织培养发展简史
一、探索阶段（上世纪初至上世纪30年代中） 1902年德国著名的植物生理学家和植物学家 哈伯兰特（Haberlandt） 在Schleiden和Schwann 的细胞学说的推动下，提出了高等植物细胞全能 性理论 。它是植物组织培养的理论依据，对植物 组织培养的发展起了先导作用。
二 植物组织培养发展简史
组织培养技术的蓬勃发展只是近 50年的事，但它的整个历史可以追溯 至19世纪末和上世纪初。
二 植物组织培养发展简史
植物组织培养与细胞培养开始于19世纪 后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完 全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通 过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这 样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的 条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植 物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。
即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相 等则不分化。
二 植物组织培养发展简史 50年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣， 10年当中引人注目的进展主要有7项： 1952年，莫雷尔（Morel）和马丁（Martin） 通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的 大丽花中首次获得无病毒植株；
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第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术第一节植物组织培养的基本理论一、植物细胞的全能性及其表达1. 植物组织培养（Plant tissue culture）：在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。
外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。
分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture, shoot apex culture, apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture)2. 植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下进行表达，具有分化发育成完整植株的潜能，称为~。
植物组培诞生的理论基础。
不同类型细胞全能性的强弱：卵细胞＞茎尖、根尖分生组织＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化）＞特化细胞（筛管等细胞）。
3. 植物细胞全能性的表达全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为~。
全能性只是一种可能性。
完整细胞核具有该植物体全套的遗传信息，是全能性表达的内因。
全能性表达须满足2个条件：1）脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制；2）营养和激素，使其脱分化与再分化。
二、植物细胞的脱分化与再分化1. 细胞分化（Cell differentiation）定义：指在个体发育中，由同一种细胞类群经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同细胞类群的过程。
细胞分化是组织与器官分化的基础。
细胞分化的本质是基因差别表达。
通过组培研究，揭示细胞的分化规律：1）成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。
2）生理生化分化先于形态结构分化。
3）完整植株中，细胞发育途径一旦被决定常不再改变，而离体培养可通过脱分化消除这种决定。
4）极性是植物细胞分化的基本现象，即在器官、组织、细胞中，在不同轴向上存在生理生化和形态结构的梯度差异。
5）由不等分裂导致细胞分化的差异，说明细胞质在起作用。
6）有位置效应，可能与生理状态和激素分布有关，导致基因表达差异。
7）植物生长调节剂对细胞分化有关键调节作用。
8）细胞分化时，常见核内多倍性和多线染色体。
2.脱分化（dedifferentiation）:在组培过程中，已分化的成熟细胞失去原来的结构和功能，恢复为分生状态，经分裂形成愈伤，或只形成未分化细胞特性的过程为~。
分化的逆转。
影响脱分化的因素：1) 脱离母体：损伤是前提，自我调节和修复。
2)生长调节剂：生长素起主要作用。
3) 外植体生理状态：对培养的反应不同，如花器官较易，茎叶较难；幼嫩组织较易，老熟组织较难。
4) 基因型：双子叶易于单子叶，同种植物有差异。
3. 愈伤组织（callus）:在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
4. 再分化/再生 (redifferentiation/regeneration): 由脱分化的愈伤组织或细胞在一定培养条件下重新分化，形成各种组织、器官甚至完整植株的过程。
植物离体再生的途径：1）器官形成 (organogenesis)：从愈伤组织或外植体形成不定芽、不定根，然后形成完整植株。
2）体细胞胚胎发生 (somatic embryogenesis)：从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构（体细胞胚），进一步发育成完整植株。
也可直接由外植体再生体细胞胚。
组织培养的过程：第二节植物组织培养的基本条件一、实验室及其设备1. 准备室主要设备：电冰箱、天平、酸度计、高压灭菌锅、烘箱等。
2. 接种室（无菌操作室）主要设备：超净工作台。
3. 培养室主要设备：培养架、控光温设备、摇床、培养箱。
4. 细胞学实验室主要设备：显微镜。
主要以1——3为主。
二、培养条件1.温度：一般25± 2℃，过高过低抑制生长和分化。
2. 光照：每日光照12~16 h，光强1000~5000 lx。
3. 湿度：室内相对湿度70%～80%, 过低使培养基失分，过高易造成污染。
4. 氧气：封口膜、棉塞、纱布+牛皮纸。
第三节培养基及其配制一、培养基的成分培养基=水+无机＋有机＋激素＋固化剂＋其它1. 水：蒸馏水、自来水（大规模生产）。
2. 无机盐1）大量元素：浓度大于0.5mM或100mg/L。
N：KNO3、NH4NO3，有时添加氨基酸；P：KH 2P04 ；K： KN03 ；Ca: CaCl2 ∙2H2O;Mg, S: MgSO4∙7H202）微量元素：浓度低于0.5 mM 或 100 mg/L, 一般10-7~10-5M，缺少会导致生长、发育异常。
Cu：CuSO4 ;Fe: FeSO4∙7H20 与 Na2EDTA ∙2H20的螯合物；B: H3BO3 ;Mn: MnSO4 ∙H20 ；Mo: Na2MoO4Co: CoCl2 ∙6H20Zn: ZnSO4 ∙7H203. 有机化合物1）糖：常用蔗糖（2%~5%），葡萄糖和果糖等也用，大规模生产用绵白糖/砂糖。
最常用的碳源（Carbon source）是蔗糖（sucrose），葡萄糖和果糖（Glucose and Fructose）也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。
麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖（Maltose, galactose, mannose and lactose）在组织培养中也有应用。
蔗糖使用浓度在2%—5%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。
2）维生素：用量一般 0.1~1.0 mg/L。
常用：VBl (盐酸硫胺素) ：促进愈伤组织的产生和生长；VB6 (盐酸吡哆醇) ：促进根的生长；VB3 (烟酸) ：与代谢和胚的发育有关；Vc ：抗氧化，防止组织褐变。
也用VH (生物素) 、叶酸和VB12 。
3）肌醇：促进组织生长及胚状体、芽和细胞壁的形成。
用量一般 50~100 mg／L。
4）氨基酸及有机添加物：常用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；也用水解酪蛋白 (CH，aa混合物 ) 。
用量10~1000mg／L。
营养丰富，易引起污染，一般不用。
5）天然复合物：椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥、马铃薯泥等，含aa、激素、酶等化合物，促进细胞增殖与分化，但成分复杂，一般不用。
4. 植物生长调节物（plant growth regulator）植物激素：是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。
植物激素包括：生长素，细胞分裂素，赤霉素，乙烯，脱落酸等，1）生长素类 (auxin)：用量0.01~10 mg/L。
在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。
在促进生长方面，根对生长素最敏感。
在极低的浓度下，(105--10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。
2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）:起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。
适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。
2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）；NAA（naphthalene acetic acid，萘乙酸）:在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。
IAA（indo acetic acid，吲哚乙酸）:是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。
IBA（indole butyri acid，吲哚丁酸）:促进发根能力较强的生长调节物质作用强弱：2,4-D＞ NAA＞IBA＞ IAA。
2,4-D 常用于愈伤的诱导，NAA常用于生根。
2）细胞分裂素类 ( cytokinin )：用量 0.1~10 mg/L。
6-BA/BA（6-苄基氨基/腺嘌呤）；BAP (卞氨基嘌呤)；KT（kinetin，激动素）；Zt（zeatin，玉米素）2-ip（异戊烯基腺嘌呤）等。
作用强弱：Zt＞2-ip＞6-BA/BAP＞KT。
6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。
②促进细胞分裂与扩大。
③抑制根的分化。
6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低。
3) 赤霉素（Gibberellins, GA’s）有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。
培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。
4）脱落酸（Abscisic Acid, ABA）促进叶片离体（脱落）和种子休眠在水分胁迫下气孔关闭过程中起主要作用在干旱时促进胚胎形成，确保形成正常的胚胎。
赤霉素和ABA 都可以促进体胚发生。
激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。
如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
高：有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素。
适中：有利于根芽的分化。
低：有利于芽的形成。
5. 固化剂1）琼脂(agar)：用量 6~10g／L。
2）其他：滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
除上述5类外，特殊情况下加抗生素、活性炭。
二、培养基的pH值范围 5.5~6.0，一般 5.8。
pH 值高于6.5时，培养基常变硬；低于5.0时，琼脂不能很好凝固。
高压灭菌会降低pH值约0.2~0.3。
pH值用0.1M的NaOH和HCl来调整。
三、培养基的渗透压培养基中的盐类、蔗糖等影响渗透压，通常1~2个大气压即可。
实际考虑不多。
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。
通常1—2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5—6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。