细胞转染操作方法及各方法比较
293细胞转染操作方法
293细胞转染操作方法一、转染前的细胞培养准备1.1 细胞培养基的准备：使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）混合液，将其预先置于37摄氏度恒温培养箱中加热。
同时，准备冰上的无血清DMEM培养基。
1.2 细胞传代：将293细胞稳定传代到80%的密度，并将细胞分装到培养皿中。
培养皿通常使用直径为6 cm的培养皿。
1.3 细胞接种：将培养皿中的细胞用10 ml DMEM培养基吸取，将细胞均匀分布在一个新的培养皿中。
1.4细胞培养：将新的培养皿放入37摄氏度恒温培养箱中，在5%CO2和95%湿度条件下培养。
二、转染试剂的准备2.1 转染物质的选择：根据实验需求，选择合适的转染试剂，如磷脂体试剂（Lipofectamine 2000）、Calcium Phosphate（CaPO4）沉淀法、聚乙烯亚胺（PEI）等。
2.2转染载体的制备：将所需的转染载体提取并纯化，测定其浓度和纯度。
2.3试剂的稀释：按照转染试剂说明书的要求，将其稀释至适宜浓度。
三、转染操作的步骤3.1细胞处理：在进行转染操作前，需要将细胞从培养皿中用无酶消化的方式将其析出，溶于含血清和无血清的培养基中，计算细胞的数量和体积，用无酶消化的方式将其析出。
3.2细胞分装：将分装的细胞放入每个培养皿中，并用光学显微镜观察细胞的黑暗度和数量。
3.3准备转染混合物：将适量的转染载体与转染试剂混合，置于室温静置15-30分钟，使其相互作用发生。
3.4转染操作：将转染混合物均匀滴加到细胞上，用手轻摇培养皿以均匀涂抹。
转染时间通常为4-6小时。
3.5转染后处理：转染时间结束后，将细胞培养基进行更换，并在体外长时间培养。
四、注意事项4.1转染试剂和转染载体的选择：需要根据实验需求选择合适的试剂和载体，不同的试剂和载体对细胞的转染效率和细胞毒性有所不同。
各种细胞转染方法比较
相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系
Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit)
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞
稳定转染，染瞬转染
不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高），操作简便但重复性差，有些细胞不适用
各种细胞转染方法比较
细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表：
转染方法
原理
主要应用
特点
厂家及产品
DEAE－葡聚糖法
带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine，Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin）
瞬时转染，特定宿主细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
中国科学院典型培养物保藏委员会
Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染的技巧
细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。
本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。
细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。
目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。
一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。
常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。
在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。
2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。
一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。
3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。
过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。
二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。
电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。
在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。
2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。
3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。
三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。
病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
>需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
一、细胞传代1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。
用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。
5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10<sup>6</sup>个细胞加入一个35mm培养皿。
8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。
二、细胞转染1. 转染试剂的准备①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。
常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。
其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。
二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。
2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。
3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。
4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。
5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。
三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。
2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。
3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。
4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。
5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。
若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。
2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。
3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。
4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。
5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。
五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。
实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
PEI细胞转染液使用方法(标准版)
PEI细胞转染液是一种广泛应用于实验室的转染试剂，用于将外源DNA或RNA 转染到细胞中。
以下为PEI细胞转染液的标准使用方法：一、准备工作1. 细胞：选择合适的细胞类型，如HEK293、CHO等。
确保细胞状态良好，密度适中。
2. 转染试剂：PEI细胞转染液。
3. 外源DNA或RNA：需转染的基因或表达载体。
4. 实验器材：离心机、显微镜、培养皿、移液器等。
二、操作步骤1. 细胞培养：将细胞接种于适当的培养皿中，用含适当抗生素的培养基培养细胞。
将培养皿放入37℃、5% CO₂的培养箱中，进行细胞培养。
2. 转染液制备：根据实验要求，将PEI细胞转染液按照一定比例稀释。
一般情况下，可以使用10倍稀释的PEI细胞转染液。
3. 转染操作：（1）将稀释后的PEI细胞转染液与外源DNA或RNA混合均匀。
（2）用移液器将混合液滴加到细胞培养皿中，注意不要直接将液体倒在细胞上，以免破坏细胞。
（3）将培养皿轻轻摇晃，使转染液与细胞充分接触。
然后将培养皿放入培养箱中，继续培养。
4. 转染后处理：转染后的细胞需要继续培养，观察转染效果。
根据实验要求，可使用荧光显微镜、实时定量PCR等方法检测转染效果。
三、注意事项1. 操作过程中，应确保实验器材干净无菌，避免污染。
2. 转染过程中，应控制转染液的浓度和滴加速度，避免对细胞造成过度刺激。
3. 转染后，注意观察细胞状态，如出现异常情况，应立即处理。
4. 实验过程中，应遵循实验室安全规定，确保人身安全。
以上为PEI细胞转染液的标准使用方法。
实际操作过程中，可能因实验条件、细胞类型等因素而有所调整。
在实际应用中，请根据具体情况进行操作。
各种转染方法比较
各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。
以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。
该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。
然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。
2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。
该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。
然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。
3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。
它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。
电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。
此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。
4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。
这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。
然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。
5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。
这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。
它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。
总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。
本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。
二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。
2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。
3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。
4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。
三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。
2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。
3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。
4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。
5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。
四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。
该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。
五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。
本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。
随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
各种细胞转染方法比较
GIBCO BRL，Promega
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染，瞬时转染
转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（>65kb）但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少1-20
Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）
CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）
Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）
阳离子聚合物
带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
瞬时转染，特定宿主细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
中国科学院典型培养物保藏委员会
Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达
瞬时性转染，稳定转染
可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
各种转染方法比较
各种转染方法比较转染是将外源DNA或RNA导入体细胞的一种常用技术，用于研究基因功能、疾病机制、基因治疗等领域。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染和生物矢量直接注射法等。
下面将对这些转染方法进行详细比较。
1.化学法：化学法是最简单、最常用的转染方法之一，主要通过化学试剂与DNA或RNA形成复合物，进而被细胞摄取。
常用的化学试剂有钙磷酸盐、聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、高分子聚合物等。
化学法的优势在于易操作、适用于不同细胞类型，且无需特殊设备。
但其转染效率相对较低，引起细胞毒性的风险较高。
2.电穿孔法：电穿孔法又称为电转染法，通过利用电场作用使细胞膜发生瞬时通透性，使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法可使用电脉冲仪或特殊转染设备进行操作，适用于多种细胞类型。
相比于化学法，电穿孔法的转染效率更高，但对细胞的毒性稍高。
3.病毒载体介导转染：病毒载体介导转染是一种高效的转染方法，常用的病毒载体有腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、逆转录病毒（Retrovirus）和慢病毒（Lentivirus）等。
这些病毒载体不仅能将外源DNA或RNA导入细胞，还能使其在细胞内稳定表达。
病毒载体介导转染的优势在于高转染效率、稳定表达，适用于许多细胞类型。
然而，为了避免潜在的致病性和免疫反应，需要选择无毒性、无致病性的病毒载体。
4.生物矢量直接注射法：生物矢量直接注射法是将外源DNA或RNA直接注射到体内，让其进入目标细胞。
这种方法适用于许多动物模型研究，如小鼠、斑马鱼等。
生物矢量直接注射法的优势在于转染效率高、实验操作简单，但对于人体病理研究等实验要求较高的场景，其应用范围较窄。
根据以上比较，选择适合自己研究需求和细胞类型的转染方法非常重要。
需要考虑的因素包括转染效率、细胞毒性、操作难度、成本等。
在实际应用中，有时也可结合多种方法，例如将化学法与电穿孔法相结合，能够提高转染效率。
细胞转染技术的使用教程
细胞转染技术的使用教程细胞转染技术是生物学研究和生物医学领域中一项重要的实验技术，它能够将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞，从而改变细胞的性状和功能。
本篇文章将介绍细胞转染技术的基本原理、常用的转染方法以及技术操作的注意事项。
一、细胞转染技术的原理细胞转染技术通过物理、化学和生物学方法将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞中。
常见的转染方式包括病毒介导转染、化学物质介导转染、电穿孔等。
病毒介导转染是利用病毒作为基因载体，通过病毒的复制和传播机制将外源基因导入目标细胞。
化学物质介导转染则是利用化学物质改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞。
电穿孔则是利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞。
二、常用的转染方法1. 病毒介导转染病毒介导转染是细胞转染中最常用的方法之一，常见的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）等。
病毒载体能够高效地将外源基因导入目标细胞，并在细胞内稳定表达。
病毒介导转染具有转染效率高、表达时间长等优点，但也存在一些限制，如细胞感染范围狭窄、潜在的免疫反应等。
2. 化学物质介导转染化学物质介导转染常用的试剂有磷脂体（Liposome）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）等。
这些试剂能够与外源基因形成复合物，通过与细胞膜结合而进入细胞。
化学物质介导转染方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但也存在一些缺点，如细胞毒性、细胞内溶酪斑形成等。
3. 电穿孔电穿孔是一种利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞的方法。
通过施加电场，电穿孔能够短暂地增加细胞膜的通透性，使外源基因能够进入细胞质。
电穿孔方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但操作相对复杂，需要专业的设备和技术支持。
三、技术操作的注意事项1. 细胞的选择和培养在进行细胞转染实验之前，需要选择适宜的细胞系进行培养。
慢病毒转染细胞的操作具体方法及步骤
慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
质粒转化细胞转染步骤
质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。
一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。
以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。
一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。
它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。
1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。
通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。
孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。
3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。
4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。
同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。
二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。
常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。
1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。
2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。
3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。
不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。
4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。
根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。
5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。
综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
细胞转染的方法和基本原理
细胞转染的方法和基本原理细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到靶细胞中。
本文将介绍细胞转染的方法和基本原理。
一、细胞转染的方法1. 化学法转染：化学法转染是最常用的细胞转染方法之一。
通过利用化学物质如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体等，将外源DNA或RNA 包裹成复合物，与细胞膜结合后进入细胞。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于多种细胞类型。
但转染效率较低，对细胞有一定毒性。
2. 病毒载体转染：病毒载体转染是一种高效的细胞转染方法。
病毒载体可以将外源基因嵌入病毒基因组中，然后通过感染细胞的方式将基因导入细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
这种方法转染效率高，适用于多种细胞类型，但需要特殊设备和技术，同时也有一定的生物安全风险。
3. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压脉冲作用于细胞膜，破坏细胞膜结构，从而使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法操作简单，转染效率较高，但对细胞有一定的毒性，并且只适用于某些特定的细胞类型。
4. 基因枪法转染：基因枪法是一种生理穿孔法，通过利用高压气体或火药驱动基因枪，将外源DNA或RNA以微粒形式直接射入细胞。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但需要特殊设备和技术，并且对细胞有一定的毒性。
二、细胞转染的基本原理细胞转染的基本原理是通过一定的方法将外源DNA、RNA或蛋白质引入靶细胞，使其在细胞内表达或功能发挥。
转染后的细胞可以用于研究基因功能、蛋白质表达及相互作用等。
细胞转染的基本原理可以分为三个步骤：吸附、内化和表达。
1. 吸附：在化学法转染中，外源DNA或RNA会与载体相结合形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合。
在病毒载体转染中，病毒载体会与细胞膜表面的受体结合。
吸附是转染的第一步，直接影响转染效率。
2. 内化：吸附后，外源DNA、RNA或蛋白质需要进入细胞内部。
在化学法转染中，复合物通过细胞膜的内吞作用或直接渗透进入细胞质。
细胞转染方法比较
细胞转染方法比较
细胞转染方法是指将外源基因转入细胞中的一种技术，是细胞基因学
研究的基础。
它具有非常重要的研究意义，可以将DNA、RNA或蛋白质引
入细胞，从而提高研究的准确性，发展基因治疗技术，还可以实现重组技术，在生物医药方面已经发挥了巨大的作用。
常用的细胞转染方法有电穿孔、热穿孔、化学转染、动力转染、质粒
载体转染等，下面就具体介绍这些方法的优缺点及适用条件。
一、电穿孔
电穿孔是将外源DNA用电压转染到细胞表面的一种方法，采用电穿孔
转染时，首先将目的基因与含有盐的溶液混合，然后在细胞上施加脉冲电压，使基因可以透过电穿孔进入细胞。
优点是转染效率高，可以较快地将
基因转染到细胞中，而不会造成细胞的死亡和损伤，并且不需要昂贵的设备。
缺点是转染的时间短，极易受环境条件的影响，转染率往往显著降低，另外，由于电压的作用，细胞表面可能受到副作用，效果不一定很理想。
二、热穿孔
热穿孔是通过改变细胞温度以及外源基因的溶液温度，使膜的稳定性
得到改变，有助于外源基因进入细胞。
优点是转染效率较高，能够获得比
较好的转染效果，且操作简单，易于掌握。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
转染步骤及经验
转染步骤及经验转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。
本文将介绍转染的步骤及经验，并提供一些实用的技巧，旨在帮助读者顺利完成转染实验。
一、实验准备在进行转染实验前，必须做好充分的实验准备工作。
以下是一些关键准备步骤：1.1 细胞培养与处理- 培养适量的目标细胞，并确保其良好的生长状态。
- 处理细胞，使其处于适宜转染的状态。
例如，对于贴壁细胞，可以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。
1.2 载体准备- 准备带有目标基因的载体。
这可以是质粒、病毒等。
- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。
1.3 转染试剂- 准备合适的转染试剂，如转染剂、离子可溶液等。
不同类型的细胞需要使用不同的试剂。
二、转染步骤转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。
以下是一般的转染步骤：2.1 细胞处理- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。
- 注意不要创建过高的转染细胞密度，以免影响转染效率。
2.2 与载体混合- 将载体与转染试剂混合，形成载体-试剂复合物。
根据实验需要可做不同浓度的复合物。
- 注意操作过程中避免产生气泡，以防止对细胞的损伤。
2.3 加入转染复合物- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中，确保复合物均匀分布在细胞表面。
- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。
2.4 培养细胞- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。
- 在培养期间，根据实验设计进行后续处理，如观察表型、提取蛋白等。
三、经验分享3.1 优化试剂浓度- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同，需要根据实验经验进行优化。
试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。
3.2 选择合适的转染方法- 根据研究目的和所用试剂的特性，选择合适的转染方法。
常见的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。
3.3 控制转染时间和温度- 不同细胞对转染复合物的吸收速度有差异，应该根据细胞类型和试剂特性确定合适的转染时间和温度。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法细胞转染是一种常用的细胞遗传学实验操作方法，通过将外源DNA或RNA导入目标细胞中，来实现对细胞的基因调控或启动特定基因的表达。
细胞转染技术的发展为细胞遗传学研究和生物医学领域的相关研究提供了重要的技术支持。
在实验室中，细胞转染操作方法的掌握对于科研工作者来说十分重要，下面我将详细介绍一下细胞转染操作方法。
首先，进行细胞转染前需要准备一些基本试剂和仪器。
常见的细胞转染试剂包括转染试剂、细胞培养基、DNA或RNA质粒、离心管、离心机等。
在选择细胞转染试剂时，需要根据细胞类型和转染试剂的适用范围来进行选择，不同的细胞类型可能需要不同类型的转染试剂。
此外，质粒的纯度和浓度也是影响转染效率的重要因素，因此在实验进行前需要对DNA或RNA质粒进行纯化和浓缩处理。
其次，在进行细胞转染前需要对目标细胞进行处理，如细胞的培养、传代和检测细胞浓度等。
细胞培养的条件和细胞的状态对细胞转染的效果也有一定的影响，因此在进行细胞转染前需要确保目标细胞的健康状态和适当的浓度。
接着我们来介绍一下最常见的细胞转染方法——化合物转染。
在细胞转染前，首先需要将细胞悬液转移到离心管中，并进行适当的离心处理以获得细胞沉淀。
随后，将细胞上清液抽取出来，再向其中加入预处理好的DNA或RNA质粒和转染试剂。
接着将管子放入适当的装有水的器皿中，并在37保温箱中孵育约5-10分钟。
待转染试剂与细胞充分结合后，将细胞上清液还原至原来培养基的体积，并将其加入到已经贴壁的培养皿中，最后将培养皿置于37的培养箱中进行培养。
此外，还有其它的细胞转染方法，比如电穿孔法、准靶向法、病毒介导转染法等。
电穿孔法是将采用电磁波或是电泳的方法，在细胞膜上形成微孔，通过微孔使DNA或RNA质粒得以进入细胞。
准靶向法是利用胆碱结合复合物促进转染效率，从而达到提高转染效率的目的。
病毒介导转染法是将外源基因载体连接到病毒颗粒上，使细胞内病毒颗粒与外源基因载体共同进入细胞内，并利用病毒的复制和表达机制使外源基因载体表达。
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细胞转染操作方法
转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
一、细胞传代
1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。
用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。
5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
二、细胞转染
1. 转染试剂的准备
①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。
2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。
在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。
加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
三、第二次细胞传代
1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。
3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
转染方法原理主要应用特点
DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核
酸带负电的磷酸骨架相互作用
形成的复合物被细胞内吞
瞬时转染
相对简便、重复比磷酸钙好，但对
细胞有一定的毒副作用，转染时需除
血清且一般只用于BSC-1，CV-1，
COS细胞系
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞
膜被细胞内吞稳定转染，
染瞬转染
不适用于原代细胞（所需的DNA浓
度较高），操作简便但重复性差，有
些细胞不适用
细胞建议用CSCL梯度离心，转染是
拷贝数较多
阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负
电的磷酸基团形成复合物，然
后脂质体上剩余的电核与细胞
膜上的唾液酸残基的负电核结
合；另一种解释是通过细胞是
内吞作用而被进入细胞。
(若
DNA浓度过高，中和脂质体表
面电核，而降低了与细胞的结
合能力)
稳定转染，
瞬时转染，
所有细胞
使用方法简单，可携带大片段
DNA，通用于各种类型的裸露DNA
或RNA，能转染各种类型的细胞，
没有免疫原性。
虽在体外基因转染中
有很高的效率，但在体内，能被血清
清除，并在肺组织内累积，诱发强烈
的抗炎反应，导致高水平的毒性，这
在很大程度上限制了其应用
阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负
电的磷酸基团形成带正电的复
稳定转染，
瞬时转染，
除了具有阳离子脂质体的转染效
率高，操作简单，适用范围广，重复
合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
所有细胞性好等特点外，还具有在体内，转染
效率高，细胞毒性低等特点，是新一
代的转染试剂。
病毒介导法逆转
录病
毒
(RNA)
通过病毒中膜糖蛋白和宿主
细胞表面的受体相互作用而进
入宿主细胞，之后反转入酶启
动合成DNA并随机整合到宿
主基因组中
稳定转染，
特定宿主
细胞
可用于难转染的细胞、原代细胞，
体内细胞等，但携带基因不能太大
（<8kb），细胞需处分裂期，需考
虑安全因素
腺病
毒(双
链
DNA)
先和细胞表面的受体结合，继
而在αv整合素介导下被细胞
内吞
瞬时转染，
特定宿主
细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全
因素
Biolistic
颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）将DNA用显微重金属颗粒沉
淀，再将包被好的颗粒用弹道
装置投射入细胞，DNA在胞内
逐步释放，表达
瞬时性转
染，稳定转
染
可用于：人的表皮细胞，纤维原细
胞，淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法用显微操作将DNA直接注入
靶细胞核
稳定转染，
瞬时转染
转染细胞数有限，多用于工程改造
或转基因动物的胚胎细胞
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，
DNA通过膜上形成的小孔导稳定转染，
瞬时转染，
适用性广，除了质粒外，还可转染
大的基因组（>65kb）但细胞致死率。