聚合酶链式反应
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
②模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半 保留复制链
5
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可 获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完 成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
13
dNTP的质量和浓度
PCR反应的原料，浓度在50-200μm/L,四 种dNTP要等摩尔配制
小量分装，-20℃冰冻保存
14
缓冲液和盐离子
Mg2+ 1.5-2.0mmol/L为宜，
Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低反应产物减少
K+离子 50mmol/L为宜， 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8)
8
PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 μ l
4种dNTP混合物 各200 μ mol/L
引物
0.1-0.5μmol/L
模板DNA
0.1～2 μ g
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100 μ l
PCR反应体系五要素：㈠引物、 ㈡ 酶、 ㈢ dNTPs、 ㈣模板和㈤Mg2+
9
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，避免5个以上的嘌呤或
嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别
是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要
3
PCR技术发展简史
1971年Korana最早提出核酸体外扩增的 设想
1985年美国Mullis 等发明了具有划时代 意义的聚合酶链反应
1988年Saiki 等利用一种耐热DNA聚合酶， 实现了PCR技术的自动化
各种PCR技术的发展
4
PCR技术的基本原理
①模板DNA的变性：94℃热变性，使DNA双 链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备；
11
其它化学物质对Taq DNA聚合酶活性的影响
变性剂 乙醇 尿素
DMSO DMF 甲酰胺 SDS
浓度 ≤3% 10% ≤0.5mol/L 1.0mol/L 1.5mol/L 2.0mol/L ≤1% 10% 20% ≤5% 10% 20% ≤1% 15% 20% 0.001% 0.01% 0.1%
GTTTGGCTGGTGTGGATC
18
③延伸温度与时间：
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
PCR反应的延伸常用温度为72℃，一般1Kb以 内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
在循环反应结束后，再加一个总延伸时间，约 10min
19
循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环 次数主要取决于模板DNA的浓度。一般 的循环次数选在30左右，循环次数越多， 非特异性产物的量亦随之增多。
20
PCR扩增产物的分析
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼 脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好
求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物5’端可加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有
适宜的酶切位点。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明
显同源性，Blast检索分析。
⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～0.5umol，以最低引物量产
生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性
活百度文库(%)
100
110
100
118
107
82
100
53
11
100
82
17
100
86
39
105
10
〈0.1
12
模板(靶基因)核酸
宜用ng量级的克隆DNA,μg量级 的染色体DNA 或104拷贝的待扩增片段 PCR核酸标本来源广泛:纯培养的细胞或微生物， 血、尿、粪、体腔积液、漱口水，活检组织及石 蜡包埋组织等临床标本、血斑、精斑、毛发等标 本. 模板的纯度
15
PCR反应条件
温度 时间 循环参数
16
①变性温度与时间
93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性， 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因之一。 在循环反应中一般 用 94℃ 30s,进行PCR循环前先94℃ 5min充分变性
17
②退火(复性)温度与时间
引物的复性温度可通过以下公式帮助选 择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
10
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠 菌合成的基因工程酶。
其特性：5’ 3’聚合酶活性， 5’ 3’外切酶活性，无3’ 5’外切酶活性 酶量
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction , PCR
1
PCR定义：指由一对引物介 导的基因或克隆的特定DNA 序列的酶促扩增的反应过程， 是DNA的体外扩增技术，本 质是DNA的体外复制。
2
PCR技术的优点
➢ 特异性强 ➢ 灵敏度高 ➢ 操作简单、省时 ➢ 对待检原始材料质量要求低 ➢ 高效率的基因扩增技术
6
PCR扩增产物
长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引
物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
7
PCR的反应动力学
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效 率，n代表循环次数。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式， 随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段 不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应”,即平台期
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半 保留复制链
5
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可 获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完 成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
13
dNTP的质量和浓度
PCR反应的原料，浓度在50-200μm/L,四 种dNTP要等摩尔配制
小量分装，-20℃冰冻保存
14
缓冲液和盐离子
Mg2+ 1.5-2.0mmol/L为宜，
Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低反应产物减少
K+离子 50mmol/L为宜， 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8)
8
PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 μ l
4种dNTP混合物 各200 μ mol/L
引物
0.1-0.5μmol/L
模板DNA
0.1～2 μ g
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100 μ l
PCR反应体系五要素：㈠引物、 ㈡ 酶、 ㈢ dNTPs、 ㈣模板和㈤Mg2+
9
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，避免5个以上的嘌呤或
嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别
是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要
3
PCR技术发展简史
1971年Korana最早提出核酸体外扩增的 设想
1985年美国Mullis 等发明了具有划时代 意义的聚合酶链反应
1988年Saiki 等利用一种耐热DNA聚合酶， 实现了PCR技术的自动化
各种PCR技术的发展
4
PCR技术的基本原理
①模板DNA的变性：94℃热变性，使DNA双 链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备；
11
其它化学物质对Taq DNA聚合酶活性的影响
变性剂 乙醇 尿素
DMSO DMF 甲酰胺 SDS
浓度 ≤3% 10% ≤0.5mol/L 1.0mol/L 1.5mol/L 2.0mol/L ≤1% 10% 20% ≤5% 10% 20% ≤1% 15% 20% 0.001% 0.01% 0.1%
GTTTGGCTGGTGTGGATC
18
③延伸温度与时间：
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
PCR反应的延伸常用温度为72℃，一般1Kb以 内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
在循环反应结束后，再加一个总延伸时间，约 10min
19
循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环 次数主要取决于模板DNA的浓度。一般 的循环次数选在30左右，循环次数越多， 非特异性产物的量亦随之增多。
20
PCR扩增产物的分析
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼 脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好
求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物5’端可加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有
适宜的酶切位点。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明
显同源性，Blast检索分析。
⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～0.5umol，以最低引物量产
生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性
活百度文库(%)
100
110
100
118
107
82
100
53
11
100
82
17
100
86
39
105
10
〈0.1
12
模板(靶基因)核酸
宜用ng量级的克隆DNA,μg量级 的染色体DNA 或104拷贝的待扩增片段 PCR核酸标本来源广泛:纯培养的细胞或微生物， 血、尿、粪、体腔积液、漱口水，活检组织及石 蜡包埋组织等临床标本、血斑、精斑、毛发等标 本. 模板的纯度
15
PCR反应条件
温度 时间 循环参数
16
①变性温度与时间
93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性， 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因之一。 在循环反应中一般 用 94℃ 30s,进行PCR循环前先94℃ 5min充分变性
17
②退火(复性)温度与时间
引物的复性温度可通过以下公式帮助选 择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
10
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠 菌合成的基因工程酶。
其特性：5’ 3’聚合酶活性， 5’ 3’外切酶活性，无3’ 5’外切酶活性 酶量
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction , PCR
1
PCR定义：指由一对引物介 导的基因或克隆的特定DNA 序列的酶促扩增的反应过程， 是DNA的体外扩增技术，本 质是DNA的体外复制。
2
PCR技术的优点
➢ 特异性强 ➢ 灵敏度高 ➢ 操作简单、省时 ➢ 对待检原始材料质量要求低 ➢ 高效率的基因扩增技术
6
PCR扩增产物
长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引
物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
7
PCR的反应动力学
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效 率，n代表循环次数。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式， 随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段 不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应”,即平台期