猪干扰素研制及应用

猪干扰素基因在腺病毒的表达及应用

崔尚金

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病

研究室, 黑龙江哈尔滨 150001）

多年来，疫苗免疫接种一直是一种预防大范围传染病爆发的最为有效的措施之一。目前被广泛用来进行免疫控制传染病以及自身免疫病和癌症等疾病的治疗。免疫接种的优点是促使先天性免疫细胞产生免疫记忆细胞，从而使机体针对特定的病原体产生持久的免疫保护。疫苗接种不仅可以通过注射灭活苗或弱毒苗实现，还可以通过注射亚单位疫苗(如纯化的类毒素)实现，也可以由其它方式将抗原呈递给免疫系统。

尽管疫苗接种非常成功，但免疫失败也时常出现（例如猪瘟疫苗），而且屡见不鲜，具体原因尚未明确。有些疫苗能够提供短期保护，不能使机体产生免疫记忆；有些疫苗能够使机体产生免疫记忆，但却不能使机体针对抗原产生有效的免疫保护。强烈的免疫反应并不不一定保证形成保护性免疫。例如，呼吸道的感染可以导致保护性免疫失效，而且现在形成了很多综合症，如猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖综合症病毒等都是以综合征来危害动物机体。从疫苗开发的角度来看，在没有保护性免疫的干扰下，产生稳固的免疫应答的感染是一个非常有前景的研究领域。在免疫学领域，一些新的、功能强大的研究工具已经开始广泛使用，这主要归功于在宿主与病原体相互作用方面得到了新的见解，并进一步理解了以细胞和分子为基础的保护性免疫。保护性免疫应答不仅仅是抗原特异性的结果，更是体内环境各种因素、各种因子相互作用、相互影响的综合结果。因此，疫苗开发的重点应当从目前只考虑抗原特异性向抗原特异性和体内环境综合考虑转变，这必定是今后发展的新方向，也是目前大家对自然免疫、天然免疫研究非常火热的最重要的原因之一。新知识和新技术的获得必将使研究人员按照新的方式改造疫苗和体内环境综合考虑来对抗传染病，从而研制更为有效、更容易形成具有选择性保护和持久性的免疫记忆的新的免疫疫苗及相关产品。其中，干扰素作为研究的非常彻底的一种细胞因子，起到了很好的疗效，本文主要介绍猪I型干扰素。

1957 年 Isaac 和 Lindenman 进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中首次发现一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物，故取名为干扰素（ interferon Wheelock 与 Green 分别于 1965 年和 1969 年相继发现免疫活性细胞经丝裂原或抗原刺激后，发生一类对酸敏感的干扰素，称为免疫干扰素。目前依据干扰素对酸的敏感性通常分为 I 型干扰素（酸敏感型）和 II 型干扰素（耐酸型）两类。几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素，根据发生干扰素细胞种类不同，I 型干扰素至今已发现 INF- α、β、ω、κ、τ、δ等 6 种类型，而 II 型干扰素迄今为止仅发现 INF- γ一种（ Domeika, 2003 由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。

1、细胞因子及干扰素概念

细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。

干扰素是在特定的诱导剂作用下，由特定细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，当它再作用于其他细胞时，使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。具有广谱抗病毒活性和调节细胞功能。其分类如下：

2、猪干扰素及其基因结构

目前所发现的猪干扰素包括 INF- α、β、ω、δ和 INF- γ，并且 INF- δ未在其它物种中发现（ Domeika, 2003 猪 INF- α、ω分别是由 12 个和 5 个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这些两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然 INF- α常常是 INF- α、ω功能基因表达产物的混合体，而 INF- β、δ和 INF- γ仅由单一基因编码（ Bonnardiere, et al., 1994 现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括 INF- α、β、ω和 INF- γ等。

3、干扰素作用及机理

干扰素作用见下图。

I型干扰素主要抑制病毒复制，主要是通过诱导细胞合成多种酶（2’-5’寡聚腺苷酸合成酶等）和旁分泌作用实现的。可以抑制细胞的增殖（如肿瘤细胞等）；加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力（NK细胞具有干扰素受体）；改变 MHC 分子的表达，增强MHCⅠ类分子的表达而抑制MHCⅡ类分子的表达。

IFNγ抗病毒活性较Ⅰ型低，但它的免疫调节和抗细胞增殖的作用较强，所以又称免疫干扰素，它是一种强的巨噬细胞、NK细胞、血管内皮细胞活化剂，能激活巨噬细胞并促进其活性；能直接作用于Ｔ和Ｂ淋巴细胞，促进分化；能增强MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达。

IFN具有广谱的抗病毒作用：病毒增殖量减少、传播速度减慢以及感染细胞损伤程度降低。其作用机理是：①通过抑制某些病毒的吸附、脱壳和最初的病毒核酸转录，病毒蛋白合成以及成熟病毒的释放等不同环节；②通过NK、巨噬细胞和CTL杀伤病毒感染细胞。 IFN的抗病毒活性具有相对的种属特异性。IFNγ> IFNα/β；不同病毒对IFN抗病毒作用的敏感性也不同。RNA病毒 > DNA病毒；

IFNγ：病毒长期感染控制。

IFNα/β的免疫调节功能：主要通过对淋巴细胞和巨噬细胞的调节以及诱导MHC I型分子的表达实现。

IFNγ的免疫调节功能：更为强大。显著增加病毒感染细胞和抗原递呈细胞表达MHC II型分子、增强T细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒性T细胞产生的能力。促进NK细胞的杀伤活性。

4、猪干扰素的基因工程研究及抗病毒研究

Lefevre et al.（1990）利用大肠杆菌表达猪α1干扰素，5-10×10^7 U/mg；

Vandenbroeck et al.（1993）利用大肠杆菌表达猪γ干扰素，10^7 U/mg； Cencic et al.（1999）利用RK-13细胞系表达猪γ干扰素，2×10^6 U/mg；郭瀛军等（2001）利用大肠杆菌表达猪γ干扰素，10^7 U/mg；陈涛等（2002）利用大肠杆菌表达GST-IFN α，5200 U/mg；万建青等（2002）利用酵母表达猪γ干扰素，450-540 U/mL，在Marc-145细胞上抵抗PRRSV感染；曹瑞兵等利用酵母表达猪β干扰素，2.5×10^5 U/mL，表达量60μg/mL，比活性4.17 ×10^6 U/mg，在PK-15细胞上显著抑制猪流行性腹泻（PEDV）的增殖。

口蹄疫病毒：Chinsangaram et al.（2002）研究发现大肠杆菌表达的猪α或β干扰素对口蹄疫病毒有抑制作用。Moraes和Mason et al.（2004）将一定剂量的表达PoIFNα的腺病毒第一次接种猪体后16h就可使猪获得对FMDV强毒攻击的保护，在3d内完全保护，在7d内有保护效果。

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS）作用：Buddaert et al.（1998）研究了PRRSV与PoIFNα的相互作用。（1） PoIFNα处理细胞后显著降低PRRSV的增殖；（2）在猪体内证明了PRRSV对PoIFNα的敏感性，给猪注射PRCV（可诱导内源性PoIFNα）后2d再接种PRRSV，其增殖滴度下降1.7-2.9lg TCID50。

Albina et al.（1998）以PRRSV鼻腔接种猪后5d内，猪血清中PoIFNα含量一直较低，大部分猪的肺部分泌物检测不到PoIFNα。 PoIFNα的下调可能与PRRSV 增殖有关。Bautista et al.（1999）研究发现猪γ干扰素可显著抑制PRRSV 在肺泡巨噬细胞上的生长，与剂量和作用时机有关。

抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）作用: Cummins et al.（1995）在TGEV 暴发时，将1-12日龄的仔猪分为4组，分别连续4d口服1U、10U、20U的HuIFNα，口服干扰素的仔猪存活率明显高于对照组。

抗伪狂犬病毒（PRV）作用: Pol et al.（1991）发现， PoIFNα能够抑