肠球菌课件

肠球菌12wenku.baidu.com种及其变异株
粪肠球菌（E.faecalis） 屎肠球菌（E.faecium) 鸟肠球菌(E.avium) 酪黄肠球（E.casseliflavus) 坚忍肠球菌(E.durans) 鸡肠球菌E.galinarum) 芒地肠球菌(E.mundii) 恶臭肠球菌(E.maladoratum) 希拉肠球菌(E.hirae) 孤立肠球菌（E.solitarius） 棉子糖肠球菌(E.raffinosus) 假鸟肠球菌(E.pseudoavium) 粪肠球变异株(E.faecalis var)
卡那霉素七叶苷叠氮盐（KAA）琼脂涂布计数法
➢ Mossel（1978）提出了用七叶苷叠氮卡那霉 素琼脂代替上述培养基，该方法目前被国际食 品微生物和卫生委员会推荐使用。在已制好并 凝固的培养基表面涂布接种0．1mL样品稀释 液，于37℃或42℃培养，使用42℃的培养温 度可增加其选择性。
➢ 肠球菌的菌落较小（直径最大为2mm），白 色或灰色，被大的黑色晕圈所包围。因分解七 叶苷而产生。
检样 稀释
叠氮化钠葡萄糖肉汤管 37℃+1℃，24h+2h或48h+2h
麦芽糖叠氮盐肉汤管 37℃ 48h
混浊不明显
混浊
产酸
不产酸
肠球菌阴性
PSE琼脂平板 37℃+1℃，24h+2h
肠球菌阳性
带棕色环的棕黑色菌落
肠球菌阴性
肠球菌阳性
MPN值法报告肠球菌数/g（mL）
叠氮盐葡萄糖肉汤多管法
（1）根据食品卫生要求或对样品污染情况的估计，选择2-3个 适宜连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1mL稀释液， 接 种 于 叠 氮 化 钠 葡 萄 糖 肉 汤 管 。 接 种 量 为 1 mL 时 ， 使 用 10mL单料管；接种量为10mL时，使用10mL双料管。接 种后的试管置37±1℃培养24h±2h，检查各试管混浊情况。 若混浊不明显，继续培养至48h±2h后记录结果。
生物学性状
肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌， 呈单个，成对或短链状排列，无荚膜。琼 脂平板上生长的细菌呈球杆状，液体培养 基中呈卵圆形、链状排列。少数菌种有稀 疏鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时 呈革兰氏阴性。能分解葡萄糖、乳糖、蔗 糖，能耐受60℃、30 min的加热。
培养特性
兼性厌氧菌，最适生长温度35℃； 大多数菌株在10℃和45℃均能生长。 所有菌株在含6.5%NaCl肉汤中能生长， 在40％胆汁培养基中能分解七叶苷， 不含细胞色素氧化酶和触酶。
菌落计数及报告结果：
肠球菌属细菌在叠氮化柠檬酸盐琼脂平板 上形成蓝色菌落。使用有适当光源的低倍大视 野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器，对 有30-300个菌落的平板进行菌落计数。
最近似值（MPN）法检测食品和水中肠球菌
对于污染程度低的样品，可采用MPN技术， 用麦芽糖叠氮盐肉汤（KF链球菌肉汤）或叠 氮盐葡萄糖肉汤作为液体培养基。此方法适用 于污染程度低的样品，检验含有受损伤的肠球 菌的加工食品及肠球菌菌数≤10g/（mL）的 食品。
检验方法
❖平板计数法 ❖MPN测定法 ❖滤膜法
平板记数法
此方法适用于检验未经加工处理的 生鲜食品及肠球菌菌数>10个/g（mL） 的食品。
25g(mL)+225mL无菌生理盐水 做成几个适当倍数稀释液 选择2-3个适宜连续稀释度，各取1mL分别加入灭菌培养皿内
KF
胆汁七
卡那霉素七
Packu结晶
食品中肠球菌的检验
辽宁出入境检验检疫局技术中心 生物检验科
二00六年四月
Liaoning Inseception and Quarantine Bureau
概述
在细菌分类学上，肠球菌属原归属于 链球菌属D群，肠球菌属内包括12个种及 一个变异株，包括寄生于人类、牛及其他 反刍动物的粪肠球菌和寄生于人类，牛及 其他反刍动物、家禽和猪中的屎肠球菌等。 是粪便中的常见细菌，在外界难以繁殖， 在自然界 的水和土壤中分布较少。
麦芽糖叠氮盐肉汤多管法
食品样品中的低污染浓度肠球菌的检测需 使用多管培养技术，用麦芽糖叠氮盐肉汤作选 择培养基。无菌移取1mL系列稀释液到盛有麦 芽糖叠氮肉汤的试管中，每个稀释度加5个试 管。35℃培养48h后检查产酸情况，试管中产 酸表示有肠球菌存在。通过查阅最大可能值表 得到肠球菌的最大可能数。
➢ 待 混 合 物 凝 固 后 ， 倒 置 平 板 进 行 培 养 ： KF 平 板 置 3 6 ± 1 ℃ 培 养 4 8 ± 2 h； 胆 汁 七 叶 苷 叠 氮 钠 平 板 置 36±1℃培养24±2h。
菌落计数及报告结果：
肠球菌属细菌在KF平板上形成 暗红至粉红色菌落，边缘整齐。琼脂 表面以下菌落常呈椭圆或晶体状；在 胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板形成带棕 色环的棕黑色菌落。对有30-300个菌 落的平板进行菌落计数。
卫生学意义
肠球菌对环境适应性强，营养要求不高， 与大肠杆菌相比，它们对冷冻、高酸和中等热 处理的抵抗力更强。因此，肠球菌在冷冻食品、 果汁及热处理不够彻底的食品常常能被检测出 来，而在这些加工过的食品中大肠杆菌往往已 被杀死。肠球菌生态活动与大肠菌群类似，对 恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力， 作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标 更具有卫生学意义。在国外，肠球菌检测常用 于环境水质和生活饮用水污染状况的评估。有 些国家已经制定了肠球菌污染限量标准，一般 控制在105 个/g范围内。
❖ 肠球菌/100mL=肠球菌菌落数/样品过滤体积 （mL）ⅹ100
危害控制
❖ 加强生产区域的卫生管理，由于粪肠球菌 主要来源于人畜粪便，所以厕所要合理布 局，避免粪便直接污染；生产人员要严格 执行个人卫生制度。
❖ 在加工过程中，严格注意每个关键点的控 制，掌握好诸如温度、水源卫生等要素。
（2）培养24±2h或48±2h之后，对所有呈现混浊的叠氮化 钠葡萄糖肉汤管进行确证试验。用接种环将各管培养物划 线于PSE琼脂平板，倒置平板于37±1℃培养24±2h。琼 脂平板上出现的带棕色环的棕黑色菌落，确证为肠球菌属 细菌。
（3）最近似值（MPN）的估算：根据接种的样品量和确证为 肠球菌属细菌的阳性反应管数，查MPN值表，得出样品中 肠球菌最近似值，报告为肠球菌数/g（mL）。
肠球菌的计数
❖ 肠球菌属细菌在mEI琼脂平板的滤膜上形成带 有蓝色晕轮的菌落，选择生长20-60个带有蓝 色晕轮菌落的滤膜，使用有适当光源的低倍大 视野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器进 行计数。
❖ 选择生长20-60个带有蓝色晕轮菌落的滤膜， 根据所使用的样品量，按照下列公式，计算每 100mL样品中肠球菌菌落数。
柠檬酸叠氮化琼脂平板计数法
➢ 选择2-3个适宜连续稀释度的样液，分别用灭 菌吸管吸取1mL稀释液，接种于每个灭菌的培 养皿中，每个稀释度做两个培养皿。稀释液加 入培养皿后，每个培养皿倾注约10-12 mL， 已灭菌温度保持45℃的叠氮化柠檬酸盐琼脂， 轻轻转动培养皿，混匀。凝固后，再倾注3-4 mL灭菌叠氮化柠檬酸盐琼脂于已凝固的培养 基上作为隔层。待该隔层凝固后，反转制备好 的平板于37±1℃培养48-72h。
的估计，选择适宜稀释度的样液。样品加 样量，以能在滤膜上生长出20-60个菌落为 宜。每个样品至少选择三个样品加样量进 行过滤。用无菌镊子夹取滤膜，将滤膜放 至滤器底部。过滤样品，用20-30mL灭菌 的缓冲清洗液轻洗漏斗边缘至少两次。关 闭真空泵，移走漏斗。
接种与培养
用无菌镊子移取滤膜，将已滤过样液的 滤膜紧贴在mEI琼脂表面上，防止滤膜与琼 脂间产生气泡，如有气泡产生，重新放置 滤膜。倒置平板于41±0.5℃培养24h。
滤膜法检测食品和水中肠球菌
（1）恒温水浴箱 （2）恒温培养箱 （3）菌落计数器 （4）玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器 （5）真空泵 （6）滤膜：直径47mm，微孔直径0.45±0.4um （7）低倍大视野双目解剖镜，也可用效能相当
的其它光学仪器计数。 （8）纯水器
根据食品卫生要求或对样品污染情况
柠檬
琼
叶苷叠
叶苷叠氮盐
紫叠氮盐
酸叠
脂
氮钠琼
（KAA）琼
血琼脂
氮化
脂
脂
琼脂
菌落计数 报告结果
KF琼脂或胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板计数法
➢ 选择2-3个适宜连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸 取1mL稀释液，接种于每个灭菌的培养皿中，每个稀 释度做两个培养皿。
➢ 稀释液加入培养皿后，每个培养皿倾注约12-15mL， 已灭菌温度保持45℃的KF琼脂或胆汁七叶苷叠氮钠琼 脂，轻轻转动培养皿，使样液与培养基充分混合。水 平放置，使琼脂凝固。从制备最初稀释液结束到倾注 培养基于最后一个培养皿所用时间不应超过20min。