放射免疫检测技术.
常用免疫学检验检测技术
要点一
总结词
要点二
详细描述
蛋白质分析的常用技术
免疫印迹技术是一种用于分离、检测和识别蛋白质的常用 技术。该技术通过将蛋白质混合物在凝胶上进行电泳分离 ，然后将其转移到膜上，再与特异性抗体结合，最后通过 显色反应检测目标蛋白质。免疫印迹技术具有高灵敏度、 高特异性和可同时检测多个蛋白质的特点，广泛应用于生 物学、医学和生物工程领域。
注意事项
由于放射性同位素具有放射性，操作过程中需要注意安全防护，避免对操作人员和环境造成污染。同 时，由于放射免疫分析需要使用放射性同位素标记的抗原，因此成本较高。
优缺点分析
优点
放射免疫分析具有较高的灵敏度和特异性， 可以用于痕量物质的定量检测；操作简便， 易于自动化；测量结果准确可靠。
缺点
由于使用放射性同位素，操作过程中存在安 全风险；成本较高，需要特殊仪器和实验室 条件；对于某些样品，可能存在交叉反应或 非特异性干扰。
化学发光免疫分析（CLIA）
总结词
快速、高灵敏度的定量检测技术
详细描述
化学发光免疫分析是一种基于化学发光反应 的免疫分析技术，通过测量化学发光反应过 程中释放的光子数量来检测抗原或抗体的浓 度。该技术具有快速、高灵敏度和低背景干 扰的优点，广泛应用于传染病、肿瘤标志物
和激素等生物分子检测领域。
免疫印迹技术（Western Blot）
05
其他常用免疫学检验检测技术
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
总结词
高灵敏度、高特异性的定量检测技术
详细描述
时间分辨荧光免疫分析是一种基于荧光能量共振转移的免疫分析技术，通过测量荧光标 记物的发射光谱来检测抗原或抗体的浓度。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干
放射免疫技术
三、关键技术 抗原抗体反应 分离技术 放射性测定 数据处理
（一）抗原抗体反应
Ag
(待检Ag)
Ab
*
固相
牢固
抗原
的抗
抗体
原抗
复合
体复
物
Ab*
合物
（二）分离技术
固相吸附分离技术
一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预 包被抗体稀释到3μg/ml~10μg/ml，室温过夜， 弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记 物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达 到分离的目的；然后，再加入1%牛血清白 蛋白溶液，封闭、保存备用。
小结
放射免疫技术是应用放射性核素标记抗原或抗 体，通过免疫反应进行定量测定的一种技术。有 两种类型经典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射 分析（IRMA）。
放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体;免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，属于非竞争性免疫结合反应。
放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。但由于放射性核素的放射 性对人体和环境会产生一定的危害和污染，因此 操作时必须加以注意。
• 自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只 适用于RIA的标记抗原。使用时应注意： ①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力 应相同； ②非特异性结合应较小，且计算时应扣除； ③制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤 应相同，特别是B与F分离的条件要一致。
第二节 放射免疫分析
• 放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记 的抗原（Ag*）与未标记抗原（Ag）竞争结 合特异抗体（Ab）来对待检样品中的抗原 进行定量测定的一种技术。
IRMA的缺点 抗体用量较多 抗体的纯化较难
RMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇 的肽类或蛋白质。抗体适用于大分子蛋白质和多 肽类激素的检测分析，如肿瘤标志物CA15-3，人 血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、 降钙素、HBsAg等，某些难以标记的病毒抗原也 可通过IRMA进行检测。
放射免疫测定法
电泳法
分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质
亲和层析法
利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质
高效液相层析法 分离效果好、快速
ConA吸附法
分离标记糖蛋白
二、RIA操作程序
配制已知浓度系列标准抗原（Ag） 加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育 分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F） 用γ计数器测量放射性计数 根据标准曲线或计算机直接算出
一、基本概念
荧光免疫分析技术：是以荧光素标记抗体或抗原，使其
与相应抗原或抗体结合后，借助荧光检测仪察看荧光现 象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的存在、定位 和分布情况或检测受检标本中抗原或抗体的含量。
荧光(fluorescence)：物质在吸收光子后，在极短时间
（10-8~10-9s）内激发分子放出波长比激发光波长为长 的可见光。
－
125I
60天 －
0．035
131I
8.05天
0.608，0.335，0.250
0.364，0.637， 0.722
125I的优点
29种同位素，125I最为常用。 半衰期适中（60天），易于商品化和储存，也利于废物处理； 发射低能35kV γ线易于测量，井型闪烁效率高 不发射β粒子，标记物自分解速度低 标记过程中，标记物免疫损伤小 化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而广泛应用
(一)、液相法
已知放射标记抗原
待检非标记抗原
分离
+
+
抗体
抗原
抗原抗体结合
沉淀物
上清液中
抗原抗体复合物 游离抗原
（二）、固相法
比较几种免疫检测的异同
免疫学课后作业比较几种免疫标记技术的异同。
答：根据标记物种类的不同，免疫标记技术可以分为放射免疫分析、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光标记免疫分析、胶体金标记免疫分析技术，它们之间具有相同点，也有不同之处，现将其归纳如下。
一、相同点主要包括以下几个方面：1、均具有高特异性。
五种免疫标记技术的免疫技术都是采用抗原抗体反应，而抗原与抗体的结合是一一对应、特异性结合的，故它们都具有非常高的特异性。
2、均具有高灵敏性。
由于五种免疫标记技术的标记技术均采用示踪物标记，例如酶、放色性核素、荧光素、胶体金以及致密物质等，当与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，只需测定复合物中的标记物，通过化学或物理的手段使不见的反应放大，转化为可见的、可测知的光、色、电、脉冲等信号，并可借助仪器精密测定，从而间接测出微量的抗原或抗体。
3、检测对象相同。
除了放射免疫技术只能检测抗原外，其他四种免疫标记技术均可检测抗原或者抗体，即通过已知抗原(或抗体)特异性结合待测抗体（或抗原），从而定性或定量地测出抗体或抗原。
4、免疫标记的程序基本相同。
其包括纯化抗原或抗体、确定标记物质（即决定了最终的检测方式）、进行标记、对标记产物分离纯化和分析鉴定等一系列程序。
二、不同点主要包括以下几个方面：1、检测原理不一样。
首先，酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原-抗体反应的特异性和酶催化底物反应高效性和专一性结合起来的一种免疫方法，其对作为标记用的酶具有特定的要求，如活性高、纯度高等；放射免疫标记技术是以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法；免疫荧光技术是以荧光素作为标记物与已知的抗体或抗原结合，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和坚定未知的抗原，其对用于标记的荧光素也有特定的要求，如荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等；发光免疫分析技术是将发光分析与免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，它是使用发光剂标记抗体（或抗原），通过发光检测抗原（或抗体）反应的免疫分析方法；免疫胶体金标记技术则是以胶体金作为示踪标记物，而胶体金在碱性环境中带负电荷，与抗体蛋白质分子的正电荷基团因静电而形成牢固结合应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测方法。
放射免疫技术的名词解释
放射免疫技术的名词解释放射免疫技术是一种广泛应用于医学和生物学领域的技术，它利用放射性同位素进行标记，通过测定同位素放射性衰变释放的放射性能量来检测和研究生物体内的抗原、抗体和其他分子的存在或相互作用。
本文将探讨放射免疫技术的基本原理、应用范围以及未来发展前景。
1. 基本原理放射免疫技术的基本原理是利用放射性同位素的放射性衰变特性进行检测。
首先，将一个抗原、抗体或其他生物分子与放射性同位素结合，形成放射性标记的复合物。
然后，将该放射性标记物与待检测样品接触，使其与目标抗原或抗体发生特异性反应。
最后，通过测量放射性标记物释放的放射能量来确定样品中目标分子的存在或数量。
2. 应用范围放射免疫技术在医学和生物学领域具有广泛的应用范围。
首先，在医学诊断方面，放射免疫技术可以帮助检测血清中特定抗体或抗原的存在，从而诊断某些疾病或监测病情进展。
例如，通过测定甲状腺功能相关的抗体水平可以诊断自身免疫性甲状腺疾病。
此外，放射免疫技术还可以用于肿瘤标记物的检测，辅助癌症的早期诊断和治疗监测。
其次，在生命科学研究中，放射免疫技术被广泛应用于分子生物学、细胞生物学和免疫学领域。
例如，利用放射免疫技术可以测定特定蛋白质、核酸或其他生物分子的合成速率、代谢路径或相互作用方式。
这些研究有助于我们理解细胞信号传导、基因调控以及免疫应答等生物过程的机制。
3. 发展前景尽管放射免疫技术在医学和生物学领域有着广泛应用，但由于潜在的放射性危险和仪器设备的复杂性，人们对其安全性和可行性提出了一些担忧。
因此，在未来的发展中，放射免疫技术需要与其他新兴的生物检测方法相结合，以实现更高的安全性和灵敏度。
一种可能的发展方向是与光学技术的结合。
近年来，光学生物成像技术得到了迅猛发展，如荧光成像和多光子显微镜。
这些技术可以通过标记荧光染料或量子点等光学探针，实现对生物分子的高分辨率成像。
将光学技术与放射免疫技术相结合，可以充分利用两种技术的优势，实现更准确、灵敏和便捷的检测手段。
放射免疫分析
放射免疫分析摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。
由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。
0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。
目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。
关键词：结构，原理，临床应用1检测的基本结构原理、结构及其探测原理核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。
核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。
转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。
液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。
放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。
放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。
测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。
临床常用标记免疫技术及特点
临床常用标记免疫技术及特点1.引言1.1 概述标记免疫技术是现代生物医学领域中常用的一种实验方法，其通过在生物样本中引入特定的标记物，来检测、定量或分析目标物质的存在和性质。
这些标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶或其他具有特异性的物质。
在临床医学中，标记免疫技术具有广泛的应用，可以用于诊断疾病、评估治疗效果、研究疾病机制等方面。
常用的标记免疫技术包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)等。
免疫荧光染色技术是一种利用特异性抗体与标记物结合后发出荧光信号的技术。
通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，可以定位、鉴定并定量分析目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的特点。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种利用特异性抗体与酶结合后，通过酶催化反应来产生可定量的信号的技术。
ELISA技术可以用于检测血清中的免疫球蛋白、抗原、抗体等多种生物分子，并可定量测定其浓度。
ELISA 技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点。
放射免疫测定(RIA)是一种利用放射性同位素标记分子，通过测量放射性同位素放出的射线来定量目标物质的技术。
RIA技术在测定极低浓度物质或微量物质时具有非常高的敏感性和特异性。
然而由于放射性同位素标记物的安全性和环境污染问题，RIA技术在临床实验室中的应用受到了限制。
总之，标记免疫技术在临床医学中具有重要的应用价值，可以帮助医生准确、快速地诊断疾病，评估治疗效果，深入研究疾病的发生机制。
随着科学技术的不断进步，标记免疫技术也在不断发展，将为临床医学带来更多的突破和进展。
1.2文章结构文章结构部分：本篇文章主要介绍临床常用标记免疫技术及其特点。
文章结构如下：第一部分为引言，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，将介绍免疫技术在临床应用中的重要性和广泛应用的背景。
在文章结构部分，将详细说明本篇文章的章节分布和内容安排。
在目的部分，将说明本文的目的和意义，为读者明确文章的目标。
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
放射免疫技术
复发监测：放射免疫技术可用于监 测肿瘤的复发情况及时发现肿瘤的 复发和转移。
放射免疫技术在心血管疾病诊断中的应用
放射免疫技术在心血管疾病 诊断中的应用原理
放射免疫技术在心血管疾病 诊断中的优势
放射免疫技术简介
放射免疫技术在心血管疾病 诊断中的局限性
放射免疫技术在内分泌疾病诊断中的应用
甲状腺功能亢进 症：通过放射免 疫技术检测甲状 腺激素水平有助 于诊断甲状腺功 能亢进症。
结论与展望
结论
放射免疫技术是一种高灵敏度、高特异性的检测方法在生物医学领域得到了广泛应用。
随着技术的发展和研究的深入放射免疫技术将继续发挥重要作用为生物医学研究提供更多有价值的 信息。
未来随着技术的进步和应用需求的增加放射免疫技术有望实现更快速、更准确、更便捷的检测为临 床诊断和治疗提供更好的支持。
放射免疫技术的 安全性与防护措 施
放射免疫技术的安全性
放射性物质的隔 离和处理
操作人员的安全 培训
防护设备和措施
安全监管和监测
放射免疫技术的防护措施
放射性标识：在放射性物质上贴上 明显的放射性标识以警示工作人员 和周围人群。
防护设备：提供适当的防护设备如 手套、口罩、眼镜等以减少工作人 员接触放射性物质的量。
添加项标题
内分泌疾病诊断：放射免疫技术可用于检测内分泌激素及相关抗 体如甲状腺激素、肾上腺皮质激素等。
添加项标题
自身免疫性疾病诊断：放射免疫技术可用于检测自身抗体如抗核 抗体、类风湿因子等辅助诊断自身免疫性疾病。
添加项标题
感染性疾病诊断：放射免疫技术可用于检测感染性疾病相关的抗 原或抗体如乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等。
放射免疫技术
汇报人：
常用的抗原抗体检测方法
常用的抗原抗体检测方法抗原抗体检测是生物医学领域中常见的技术手段，主要用于检测样品中是否含有特定的抗原或抗体。
以下是几种常用的抗原抗体检测方法：1、酶联免疫吸附法（ELISA）：这种方法利用酶作为标记物，与抗原或抗体结合，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而检测抗原或抗体的存在。
ELISA 方法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断、生物制品检测等领域广泛应用。
2、免疫荧光技术：该技术通过荧光物质标记抗原或抗体，利用荧光显微镜观察荧光信号，检测抗原或抗体的存在。
免疫荧光技术具有高灵敏度、高特异性、无放射性等优点，常用于组织切片、细胞表面抗原或抗体的检测。
3、放射免疫分析法：这种方法利用放射性同位素标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，用放射性检测器检测放射信号，从而确定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析法具有较高的灵敏度和特异性，但放射性物质可能对环境和人体健康造成影响，因此使用时需特别注意安全问题。
4、胶体金免疫层析法：该技术利用胶体金标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，利用层析原理将结合物分离并富集，再用光学仪器检测胶体金颗粒的聚集程度，从而判断抗原或抗体的存在。
胶体金免疫层析法具有简便、快速、可视化等优点，常用于临床床快速诊断和食品安全等领域。
5、化学发光免疫分析法：这种方法利用化学发光物质标记抗原或抗体，与样品中的抗原或抗体结合后，利用化学反应产生光信号，通过检测光信号的强度确定抗原或抗体的浓度。
化学发光免疫分析法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断和生物制品检测等领域应用广泛。
这些方法各有特点和使用范围，选择合适的抗原抗体检测方法要根据具体实验条件和要求而定。
同时，为保证检测结果的准确性和可靠性，操作过程中需遵循规范，避免污染和交叉反应等问题的发生。
放射免疫分析RIA
Ag *Ag Ab
Bound
Free
B F B/F
0.67 0.33 2
0.50 0.50 1
0.33 0.67 0.5
0.17 0.83 0.2
竞争放射分析原理示意图
B/F
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
0
B/B0% 100Biblioteka 50510
15 20
剂量-标准抗原浓度
0
0
5
10
15
剂量-标准抗原浓度
要求：
保证与被测物具有相同的免疫活 性和相同介质。
RIA基本试 剂
3、抗体
RIA使用：多克隆抗体 单克隆抗体
衡量抗体质量的指标是：
亲和力:抗体结合的强度
特异性:不受交叉反应物质影响的程度
滴度:抗体的效价——抗体实际应用时
的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量越 少，血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干 扰也少。一般滴度高到1：1000以上，血清 中干扰物质影响就很小。
质量控制的指标
1、稳定性 2、精密度 3、灵敏度 4、准确度
1、稳定性：指RIA实验批间的重复性。
常用指标：
零标准管结合率（B0%）:没有待测物时，标 记抗原与抗体之间能产生的最大结合率（一般 要求在30-50%）
非特异性结合率（NSB%）：没有结合剂 （抗体）的存在下，标记配体（抗原）被分离 试剂结合造成的结合率，（一般要求<5-10%）
实验室间质控
误差的来源：
系统误差 表现为结果呈倾向性偏高或
偏低。常见因素①方法误差：如标准品稀释 不正确，分离效果不好等②仪器和试剂：仪 器状态、量器、试剂纯度等③操作误差：操 作习惯、加错样品等。通过努力系统误差可 以消除。
临床医学检验临床免疫技术：放射免疫技术测试题(强化练习)
临床医学检验临床免疫技术：放射免疫技术测试题（强化练习）1、单选表示单位质量标记物的放射强度的指标是（）A.放射化学纯度B.免疫活性C.比放射性D.交叉反应率E.亲和常数正确答案：C2、单选分离结合态与游离（江南博哥）态放射性标记抗原不完全时会增加（）A.特异性结合量B.非特异性结合量C.敏感度D.精确度E.反应速率正确答案：B3、单选与RIA比较，IRMA的特点不包括（）A.IRMA的反应速度更快B.非竞争结合，使IRMA更易检测微少含量的抗原C.抗体用量大但K值要求不高D.反应参数与待测抗原含量成反比E.具有更高的灵敏度正确答案：D参考解析：IRMA属固相免疫标记测定，抗原与过量的标记抗体在液相反应后加入免疫吸附剂，游离的标记抗体与免疫吸附剂结合被离心除去，然后测定上清液的放射性量。
所以反应参效与待测抗原含量成正比4、单选在放射免疫分析中常用到RIA标准曲线（Standardcurve），其作用是（）A.用来校正计数器（counter）B.用得到的计数率去推算试样中所含样品的浓度或含量C.做质控D.用来追踪试样的变化E.鉴定核素的放射化学纯度正确答案：B5、单选RIA试验中抗原抗体复合物的放射性强度与待测抗原呈（）A.函数关系B.正比关系C.反比关系D.曲线关系E.正弦关系正确答案：C6、单选放射免疫分析常用的放射性核素错误的是（）A.125IB.130IC.3HD.14CE.111I正确答案：E参考解析：放射免疫分析常用的放射性核素有：125I、130I、3H、14C等。
7、单选标记免疫技术实际应用时测定的是（）A.待测抗原与抗体结合后形成的结合物B.待测抗体与抗原结合形成的复合物C.标记物在抗原抗体复合物的信号D.直接测定样品中抗原的含量E.直接测定样品中抗体的含量正确答案：C参考解析：一种定性、定量甚至定位测定技术。
即用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应而检测相应抗原和抗体。
激素的放射免疫测定技术
试剂盒组成
T标准品：0、10、50、100、250、750、2000ng/dl。
抗体：兔抗人T和E2抗体的磷酸盐液体。
125I标记物：含有125I标记的T和E 磷酸盐液体。 2
分离剂：驴抗兔抗体血清和聚乙二醇溶液。
三、测定项目
血浆睾酮（Testosterone, T） 血浆雌二醇（17β-Estradiol, E2） 血浆孕酮（Progesterone, P）
抽吸 将离心 好的试 管中的 液体抽 吸干净 ，不要 抽到底100
15
16 17 18 19 20 21-n
2000ng/dl 50 2000ng/dl 50 100 样品
实验前进行充分的准备工作，除了检查仪器设备、物品外，根 据样品量，准备相应的测定管，编号 实验前，将血清、试剂盒等放在室温下解冻和平衡。 按照样品管编号，将血浆样品加入到试管中，加样顺序按照实 验方案进行。 制备标准曲线：按照改进的方法制备标准曲线，注意标准曲线 点的扩展。
04
但是，与非放射标记方法相比（酶免疫测定），该方法对放射防 护要求较高，必须有专门实验室和放射废物处理条件。
放射性物质的危害
放射源发射出来射线具有一定能量，它可以破坏细胞组 织，从而对人体造成伤害。当人受到大量射线照射时， 会产生诸如头昏乏力、食欲减退、恶心、呕吐等症状， 严重时会导致机体损伤；当人只受到少量射线照射，一 般不会有不适症状发生，也不会伤害身体。
DHP
采用活体或组织对 某一激素的生理学 反应检测激素的存 在和含量，精确性 比较差。
提取激素，然后利用 ELISA 激素结构中某些基团 或化学试剂的特殊反 应，根据反应的特点 3 化学测定法 1 用比色、层析、电泳 2 4 法检测激素含量。这 生物测定法 种方法的灵敏度和特 异性较低，测定步骤 RIA 繁琐
常用免疫学检验技术的基本原理
常用免疫学检验技术的基本原理免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。
由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）.由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体)。
免疫学检测技术的用途非常广泛,它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。
最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。
这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。
单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈,沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比.利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。
免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开.然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。
然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体)的鉴别。
上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限.比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原(或抗体）的含量。
该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
免疫印迹法则首先通过电泳分离标准的已知抗原,然后将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，浸于待测血清中。
放射免疫分析
放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。
放射免疫技术放射免疫分析免疫放射分析放射免疫分析技术的应用放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。
基本类型及原理1.放射免疫分析（RIA）2.免疫放射分析（IRMA）常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。
使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。
标志物制备及鉴定125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
（1）氯胺T（ch-T）法。
（2）乳过氧化物酶标记法。
（3）间接标记法。
放射性标志物的纯化（1）凝胶过滤法：分子筛。
（2）离子交换层析法：极性差异。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：电荷和直径。
（4）高效液相色谱法。
放射性标志物的鉴定1.放射化学纯度：大于95%。
2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。
3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。
方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（1）可靠性。
（2）剂量-反应曲线。
（3）高剂量钩状效应。
放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。
Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag分离结合与游离标志物1.第二抗体沉淀法。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法。
3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。
4.活性炭吸附法。
放射性测量及数据处理可对标记抗原抗体复合物（B）或游离标记抗原（F）进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。
第七章 放射免疫分析
第七章放射免疫分析第一节放射免疫技术一、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。
（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。
二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。
三、放射性标记物制备及鉴定（一）原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。
（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。
常用的方法为：①氯胺 T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。
2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。
该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。
（三）放射标记物的纯化1.凝胶过滤法：分子筛机制。
2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。
4.高效液相色谱法。
（四）放射标记的鉴定1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求＞95%。
该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。
2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。
3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。
四、方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。
借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。
平行性好者可靠。
（二）剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。
放射免疫荧光标记免疫课件
在反应过程中，应保 持恒温、恒湿，避免 外界因素干扰。
确保抗原抗体比例合 适，反应时间充足， 以保证反应的充分进 行。
洗涤与分离
将反应后的抗原抗体复合物进行 洗涤与分离，去除未结合的抗原
或抗体。
洗涤与分离的目的是为了提高实 验的特异性，减少背景干扰。
洗涤与分离时应保证细胞或组织 的完整性，避免过度洗涤导致抗
药物研发
用于药物筛选、药效评价 及药物代谢研究等。
02 放射免疫荧光标记免疫实 验操作流程
实验准备
实验材料
抗原、抗体、荧光标记物 、细胞或组织样本等。
实验试剂
缓冲液、洗涤液、标记液 等。
实验仪器
显微镜、荧光检测仪、离 心机等。
抗原抗体反应
将抗原与抗体按照一 定比例混合，在一定 温度下反应一定时间 。
使用荧光显微镜观察标记的样本，记录荧光信号 的强度和分布。
定量分析
通过测量荧光信号的强度，对样本中的目标分子 进行定量分析。
灵敏度与特异性
评估实验方法的灵敏度和特异性，确保结果的可 靠性。
数据分析与解读
数据处理
对实验数据进行整理、清洗和转换，确保数据的质量 和可用性。
统计分析
运用适当的统计分析方法，对数据进行分析和解释。
物疗效监测等。
临床转化与实际应用
标准化与规范化
建立荧光标记免疫技术的标准化操作流程和质控体系，确保检测 结果的可靠性。
临床验证
开展多中心临床试验，验证荧光标记免疫技术在不同疾病诊断中 的有效性。
普及推广
通过培训和交流，提高医务人员对荧光标记免疫技术的认识和应 用能力，推动其在临床的广泛应用。
04 放射免疫荧光标记免疫实 验注意事项与安全防护
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一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑴放射性核素：是指原子核能自发地产生成分或 能级的变化，在变化时伴有射线的发射（放射 性），然后变成另一种元素的核素。
放射量单位有: ①放射性活度 ②放射性比活度 ③放射性浓度
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑵放射性活度：一定量的放射性核素在 单位时间内的核衰变数，即每秒核衰变 次数。 单位：贝可勒尔(Becquerel，Bq) 1Ci=3.7×1010Bq
放射免疫检测技术
基本内容
一、放射免疫检测技术的基本原理 二、放射免疫分析（RIA） 三、免疫放射分析（IRMA） 四、RIA与IRMA的比较 五、放射免疫分析中造成测量误差的因素 六、核废物的处理 七、应用 八、课堂小结 九、作业
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 2、常用的放射性核素 3、放射性核素的选择原则 4、放射性标记的抗原或抗体的要求 5、制备放射性核素标记物 6、放射性标记物的纯化 7、理想的分离技术 8、免疫复合物分离常用方法 9、核射线探测仪器的探测原理
一、放射免疫检测技术的基本原理
8、免疫复合物分离常用方法
⑴.吸附法 用吸附剂 (如活性炭)吸附小分子的游离。 ⑵.化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀 剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分离B与F。 ⑶.双抗体法 利用抗抗体和※Ag-Ab复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物， 离心沉淀即可分离B与F。 ⑷.PR试剂 将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果 好，适用范围广。 ⑸.固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上， 利用固相抗体或抗原分离B和F，具有简便、快速、适合于自动化分析等 特点，已逐步取代传统的液相分离方法。
废弃物
一、放射免疫检测技术的基本原理
3、放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗 体没损害、容易标记。 4、放射性标记的抗原或抗体的要求 纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫 活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应 率低。
一、放射免疫检测技术的基本原理
5、制备放射性核素标记物 ⑴直接标记法 将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残 基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。 操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨 酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性 。 ⑵间接标记法 先将放射性碘连接到一个小分子载体上 ，再将这个小分子载体与蛋白质结合。
标记方法 对标记化合 物影响 测量方法 测量仪器 半衰期
方法简便，易获得高 比放射性标记物
方法较难，不易获得 高比放射性标记物
标记时以I代替H1改 变物质结构，可影响 抗原免疫学活性 方法简便、效率高
γ 计数器 60.2天 处理容易
不改变抗原结构，一 般不影响抗原免疫活 性 方法复杂，效率低
液体闪烁计数器 约11年 较难
一、放射免疫检测技术的基本原理
9、核射线探测仪器的探测原理 核射线探测器是个能量转化 器，其检测原理是当射线作用于 闪烁体，闪烁体吸收了射线的能 量而引起闪烁体中的原子或分子 激发，当受激的原子或分子退激 时，则发出光子进入光电倍增管 光阴极，转换为光电子，光电子 在光电倍增管电场作用下到达阳 极，形成电脉冲。 转换模式：放射能→光能→电 能→脉冲。
一、放射免疫检测技术的基本原理
2、常用的放射性核素： 放射性核素依据衰变方式分α、β、γ三 种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用 液体闪烁计数器及γ计数器测定。 β型：3H（最常用）、14C和32P。 γ型：125I（最常用）、131I、51Cr和60Co 。
125I和3H标记物特点比较
125I标记物 3H标记物
一、放射免疫检测技术的基本原理
6、放射性标记物的纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、 纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。 理想的放射性标记物： 高放射化学纯度 适当的比放射性 高的免疫活性。
一、放射免疫检测技术的基本原理
7、理想的分离技术
①简便易行，适于大批量样品分析; ②分离效果完全、快速，非特异结合低; ③试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长 期保存; ④不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对 标准品和待测抗原分离效果相同; ⑤适合自动化分析的要求。
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑹放射化学纯度：是指结合于抗原上的放 射强度占总放射强度的百分率。 影响因素: ①被标记物不纯，杂质也被放射性核素标 记； ②标记后的分离纯化不完全； ③标记化合物贮存过程中的碘脱落。
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念
⑺免疫活性：指标记抗原结合于抗体的 放射强度占总放射强度的百分率。 以检查标记后免疫活性损失情况。
二、放射免疫分析（RIA）
1、基本原理 抗原抗体竞争性结合反应，即待测抗原 (Ag)和定量的标记抗原(※Ag)与限量的抗体 (Ab)进行特异性反应，其中Ab的结合位点数 小于Ag＋※Ag的结合位点总数，则Ag和※Ag 与Ab发生竞争性结合。如待测Ag含量多，则 Ag-Ab复合物形成得多，※Ag-Ab复合物 (B) 形成少，游离的※Ag（F）多，反之亦然。
一、放射免疫检测技术的基本原理来自1、7个基本概念 ⑶放射性比活度：是指固体样品的放射 性活度，即单位质量样品中所含放射性 活度，以Bq/g或Bq/mmol表示 。 ⑷放射性浓度：是指液体样品的放射性 活度，即单位体积溶液中所含放射性活 度，以Bq/ml表示。
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑸比活度：是单位质量标记物的放射强度， 单位为Bq/g。 标记抗原的比放射性越高，所需标记 抗原量越少，实验系统的敏感度越高。 但过高的比放射性可能会损伤抗原的 免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为 宜。
二、放射免疫分析（RIA）
二、放射免疫分析（RIA）
2、分类 根据加样顺序不同，RIA可分为2个类型： • ①平衡法 将Ag和※Ag同时与Ab反应，达到平衡后 分离※Ag-Ab和※Ag，方法稳定，但敏感度 稍差； • ②顺序饱和法 先将待测Ag与Ab充分反应，达平衡后再加 入※Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。