放射免疫分析资料讲解
《放射免疫分析实验》课件
放射免疫分析的灵敏度和准确性。
3
放射免疫分析的操作步骤
深入了解放射免疫分析的操作步骤，包 括离心、反应时间控制和放射性测量。
结果分析与讨论
1 利用放射免疫分析结果进行定量分析
学会如何利用放射免疫分析的结果进行定量数据分析，并研究结果的意义和影响。
2 讨论实验中可能出现的误差，并提出改进方法
探讨实验中可能出现的误差来源，并提出改进方法以提高实验的准确性和可靠性。
《放射免疫分析实验》 PPT课件
欢迎来到《放射免疫分析实验》PPT课件！在这个课程中，我们将介绍放射免 疫分析实验的基本原理、实验步骤以及结果分析与讨论。让我们一起开始探 索这个有趣的领域！
实验介绍
放射免疫分析实验的基本原理
我们将学习放射免疫分析实验的基本原理，了解其在生物医学研究中的应用。
放射性示踪剂的选择和制备方法
探索放射性示踪剂的选择和制备方法，以及如何确保实验结果的准确性和可靠性。
试剂和仪器介绍
了解实验中使用的试剂和仪器，包括其功能、使用方法和常见注意事项。
实验步骤
1
样品准备和标准曲线的制作
学习如何准备样品并制作标准曲线，以
样品基质的处理和分离
2
便后续实验的数据分析和定量计算。
探索如何处理和分离样品基质，以提高
3 分析结果与预期目标的对比
将实验结果与预期目标进行对比，评估实验的成功程度和可行性。
实验应用与展望
实验应用
了解放射免疫分析实验在生物医学研究中的应用， 以及其对人类健康的域中的应用， 以及未来发展的前景。
放射免疫分析技术(1)
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6
一、放射免疫技术－原理及分类
放射免疫
RIA
以标记抗原与反 应系统中未标记 抗原竞争结合特 异性抗体来测定 待检样品中抗原
量。
免疫放射
IRMA
以过量标记抗体 与抗原非竞争结 合，采用固相免 疫吸附载体分离 游离和结合标记
抗体。
其它 ➢放射受体分析 RRA(标记受体检测抗原)
➢放射配体结合 分析RBA
白，沉淀物放射性占待测样品总放射线的百分率）
➢应大于95% ➢也是观察标记物脱碘程度的重要指标
免疫活性
➢标记物与抗体结合的能力 ➢标记物与过量抗体反应，与抗体
结合的标记物的放射性与加入标
记物的总放射线的百分比
➢该值越大, 标记物免疫活性好，应大于
80%
➢完整反版映课被件p标pt 记物免疫活性受损情况
结合率与测值成正比
待测抗原
大小分子
二抗原决定簇
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32
放射免疫分析技术的应用
放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微 量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰 期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取 代。
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33
思考题
1.放射免疫技术的核心是什么？ 2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？ 3.评价125I标记物质量的指标有哪些？ 4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？ 5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的
量变关系？
6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？ 7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？ 8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？ 9.γ闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？ 10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有
《放射免疫分析》课件
药物研发与药效评估
用于药物筛选、药代动力学研究和治 疗效果评估。
THANKS
感谢观看
酶联免疫分析也是常用的免疫分析方法，与放射免疫分析相比，酶联免疫分析不需要使用放射 性同位素，操作更加简便，但灵敏度相对较低。
与化学发光免疫分析的比较
化学发光免疫分析是近年来发展较快的免疫分析方法，具有高灵敏度、高特异性和操作简便等 优点，但成本也相对较高。
放射免疫分析的未来发展与
05
展望
新技术与新方法的探索
02 反应动力学
抗原-抗体反应速度受多种因素影响，如温度、 pH值、离子强度等，通过控制这些因素可以加速 或减缓反应速度。
03 抗原-抗体浓度的关系
在一定范围内，抗原和抗体浓度的比例影响反应 的灵敏度和特异性，因此需要合理选择抗原和抗 体的浓度。
放射免疫分析的分离技术
01
沉淀法
利用抗原和抗体结合后形成的大分子复合物在离心或重力作用下沉降，
溶液。
实验环境
确保实验室环境整洁 、安全，符合实验要
求。
实验人员培训
所有参与实验的人员 都应经过相关培训， 熟悉实验操作流程和
注意事项。
样本处理
01 样本收集
按照规定的程序和方法收 集样本。
03 样本标识
对每个样本进行唯一标识
，确保后续实验结果的准
确对应。
02 样本处理方法
根据实验需求，对样本进 行适当的处理，如离心、 稀释、分离等。
04 样本保存
确保样本在适当的条件下
保存，以保持其有效性。
实验操作步骤
标记抗体
将抗体与放射性物质进行标记，以便后续 的检测。
放射免疫分析
放射免疫分析摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。
由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。
0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。
目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。
关键词：结构，原理，临床应用1检测的基本结构原理、结构及其探测原理核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。
核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。
转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。
液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。
放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。
放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。
测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。
《放射免疫分析》课件
放射免疫分析是一种广泛应用于医学与生物领域的实验技术，结合放射性同 位素和免疫反应，用于检测和定量测量生物样本中的特定分子。
简介
1 什么是“放射免疫分析”
放射免疫分析是一种使用放射性同位素标记的抗体或分子探针进行定量测量的实验技术。
2 有哪些应用场景
放射免疫分析广泛应用于临床诊断、生物学研究和药物开发等领域，特别是在肿瘤标志 物检测、激素水平测量和免疫检测方面。
3 放射免疫分析的过程
放射免疫分析包括样本 前处理、标记试剂制备、 样品配制、反应体系建 立和实验操作步骤等多 个步骤。
实验流程
1
样本前处理
对样本进行处理，使其符合放射免疫
标记试剂制备
2
分析的要求，例如去除干扰物质、浓 缩或稀释样品。
将放射性同位素与特定抗体或分子标
记在一起，以便在免疫反应中检测和
发展趋势
未来，放射免疫分析可能朝 着更高灵敏度、更低辐射和 更简化实验操作的方向发展， 也有望应用于新领域，如点of-care测试和分子影像学。
结论
结合实验结果，总结放 射免疫分析的特点和应 用，并对未来发展进行 展望。
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定量目标分子。
3
样品配制
将待测样品与标记试剂进行适当的混
合与反应，使目标分子与标记试剂发
反应体系建立
4
生特异性的结合。
为免疫反应提供适宜的环境，调整pH
值、温度和离子浓度等参数，以促进
免疫反应的进行。
5
实验操作步骤
按照合适的实验步骤和时间要求，进 行免疫反应、洗涤、分离等操作，以 获得准确的测量结果。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种用于检测和定量分析生物样品中特定抗原或抗体浓度的方法。
它是将放射性同位素标记于抗原或抗体上，在放射性同位素发出的放射线与样品中的抗原或抗体发生特异性结合后进行测定，从而得出相应物质的浓度。
放射免疫分析的基本原理是免疫反应，即抗原与抗体之间的特异性结合。
在RIA中，通常选择具有放射性的同位素标记物作为追踪试剂。
标记物可以是同位素标记的抗原或抗体，其中最常用的是放射性同位素碘-125（^125I）或碘-131（^131I）。
这些放射性同位素会发出特定能量的射线，可以通过辐射探测器测量。
RIA的步骤包括样品预处理、标记物制备、抗体反应和分离、洗涤、放射测定等。
首先，需要将待测物标记为放射性同位素，常见的方法是用碘-125标记。
然后，将标记物与样品中的抗原或抗体进行相互反应，形成抗原-抗体复合物。
接着，通过分离和洗涤步骤，去除未结合的放射性同位素。
最后，使用辐射探测器测量放射性同位素发出的射线，由此可以得到样品中特定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的优势在于其高灵敏度和高特异性，可以检测到极低浓度的物质。
它广泛应用于医学、生物学、生物化学等领域，用于检测和量化各种生物分子，如荷尔蒙、抗体、蛋白质、癌标志物等。
RIA还可以用于研究免疫反应、疾病诊断、药物筛选和治疗监测等方面。
然而，放射免疫分析也存在一些问题。
首先，使用放射性同位素会造成辐射危害，对实验操作人员和环境有一定风险。
其次，放射性同位素的半衰期较短，需要定期更换，增加了实验的复杂性和成本。
此外，由于放射性同位素的使用受到严格的监管和限制，一些实验室可能无法获得所需的放射性同位素。
总体而言，放射免疫分析是一种广泛应用的生物分析技术，具有高灵敏度和高特异性。
随着科技的进步，更多无放射同位素的免疫分析方法被开发出来，如酶免疫分析、荧光免疫分析等，逐渐取代了放射免疫分析的应用。
放射免疫分析的原理
放射免疫分析的原理放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种利用放射性同位素标记抗原或抗体来检测物质浓度的技术。
该技术广泛应用于临床诊断、生物化学研究以及药物筛选等领域，具有高灵敏度和高特异性的特点。
放射免疫分析的原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合。
抗原是一种能够诱导免疫系统产生抗体的物质，而抗体是一种能够特异性结合抗原的免疫蛋白。
在放射免疫分析中，通常选择特异性结合抗原的抗体，并利用放射性同位素标记抗原或抗体，以便测定样品中抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的步骤一般包括抗原标记、抗体固定、分离和计数等几个关键步骤。
首先，将抗原标记上放射性同位素，通常使用的同位素有碘-125（125I）、碘-131（131I）、氘-3（3H）等。
标记后的放射性抗原具有相对稳定的放射性，可用于测定抗原的浓度。
然后，将已标记的抗原与待测样品中的抗原进行特异性结合，并通过添加抗体来固定放射标记的抗原。
接着，利用分离技术（如沉淀法、凝胶层析法等）将游离的抗体或抗原分离出来。
最后，通过放射计数器测定标记抗原或抗体的放射性强度，从而计算出待测样品中抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的原理基于放射性同位素的高灵敏度和稳定性，使得其具有极高的检测灵敏度和特异性。
相对于传统的免疫分析方法，如酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等，放射免疫分析能够在极低的抗原浓度下进行检测，且能够检测复杂样品中的微量物质。
因此，放射免疫分析广泛用于检测激素、生物分子、药物和疾病标志物等各种生物样品中的微量物质。
然而，放射免疫分析也存在一些局限性，主要是由于放射性同位素的使用带来的放射性污染和辐射风险。
为了克服这一局限性，人们提出了许多新的代替技术，如免疫荧光分析（immunofluorescence assay，IFA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等。
放射免疫分析
加样： 1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管 2、Ag* 200ul/每管 3、Ab 100ul/每管 混匀，37℃ 45分钟，加分离剂离心，测定 结合部分放射性。
放射免疫分析的几种标准曲线图：
抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律， 即：
当反应达到平衡时， k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结 合常数，也称亲和常数，则有：
Ag + Ab → AgAb + Ag* ↓ Ag*Ab
式中Ag *代表标记抗原，Ag代表非标 记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag * Ab代 表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标 记抗原抗体复合物。
当反应体系中同时存在Ag、Ag *和Ab， 而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗 原）时，随着Ag的增加，Ag * Ab的量相应减 少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的 量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后， 将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的 标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的 浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量 效应曲线（calibration curve），也称标准曲 线。
3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表 示特定的抗原、抗体之间的结合能力， 常用亲和常数KA来表示。KA越大，表 示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F 值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高 了现代体外分析技术的特异性和亲和力。
（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测 量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外 放射分析法的定量范围一般在10-9-1012mol水平，标记物的用量应等于或小于 被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 高比活度的标记物是确保分析方法灵敏 度的前提。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析（RIA）是一种检测技术，可以用来测定多种体内物质，包括激素、细胞因子、蛋白质和抗原。
它可以应用于动物和人体，并且具有灵敏度高、可操作性好的优点，被广泛应用于临床和科研领域。
放射免疫分析由以下几个步骤构成：首先，将样本中待测物质结合到放射抗体中。
放射抗体是一种特异性抗体，能够特异性结合待测物质，避免其他物质干扰检测结果。
放射抗体可以是膜抗原抗体、非膜抗原抗体或者多肽抗体。
其次，将样本和放射抗体制成滴定曲线，测定放射抗体结合待测物质的含量。
最后，通过计算放射抗体浓度滴定曲线的相关系数来计算样本中的待测物质的含量。
放射免疫分析为临床和科研提供了许多方便，特别是在生理学方面，其应用极为广泛。
它可以用来检测各种激素、蛋白质和细胞因子的表达水平，对疾病的研究有重要意义。
放射免疫分析也可以检测各种抗原，为临床诊断疾病提供有力的支持。
放射免疫分析由于具有高灵敏度和特异性，可以很好地检测微量物质，在临床和科研领域具有重要的应用价值。
近年来，放射免疫分析在药物研发和食品质量检测方面也越来越受到重视，为科学研究和技术创新提供重要的技术支持。
综上所述，放射免疫分析是一种重要的检测技术，它不仅在临床检测中具有重要的应用价值，而且也受到越来越多科学研究和技术创新的重视。
它也可以帮助我们更准确、更早期地诊断疾病，为患者身
体健康提供有力的支撑。
第八章放射免疫分析
（四）双抗体法
第一抗体再作为新的抗原注射入较大的动物（羊、马等），得到第二 抗体，分子量增大而沉淀，而F则留在上清液中。
优点：分离效果好，应用广 缺点：增加了第二抗体制备的时间，产生交叉免疫干扰的可能性增大
三、放射免疫测定的一般步骤
包括：样品处理、B与F分离，绘制标准曲线，放射性测定，结果计算
RIA：非均相免疫分析，需进行B与F的分离过程。
一、荧光标记物
（一）对荧光标记物的要求
1、分子结构中具有强吸收基团，并有较高的荧光量子产率， 发射波长最好在可见区。 2、分子结构中具有与药物连接的活性基团。 3、所标记的药物与抗体结合后，最好能改变其荧光性质。 4、所标记的药物不应该改变原有的抗原性质，因此连接部位 不应掩盖抗原决定簇。 5、理化性质稳定，具有水溶性
（一）样品处理
大多数样品可直接加入免疫反应液中测定，但有些样品则需经前处理， 方法与一般生物样品处理相同。
（二）绘制标准曲线
1、将不同量非标记抗原（待测药物标准品）分别加入含有等体积空白血清 的试管中，使成一定浓度梯度（n=5-8），与样品同时前处理。 2、将定量的标记抗原（标记药物）加入上述各管中。 3、将一定量的已稀释的抗体（抗血清）加入2处理后的管中 4、混匀，温育使免疫反应达到平衡。 5、加入分离剂，使B与F分离 6、测量放射性计数率，以B%（B/T）、B/F等为纵坐标，非标记抗原浓度为 横坐标，绘制标准曲线。
（二）常用的标记酶及标记方法
1、6-磷酸葡萄糖脱氢酶
2、溶菌酶
3、过氧化氢酶
4、β-半乳糖苷酶
等
标记方法与人工抗原的制备方法相同，可利用药物分子上 的羟基、羰基、氨基、酚羟基等与标记酶分子上的氨基、羧基 等连结。如碳化二亚胺法、混合酸酐法、戊二醛法等。
放射免疫分析
放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。
放射免疫技术放射免疫分析免疫放射分析放射免疫分析技术的应用放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。
基本类型及原理1.放射免疫分析（RIA）2.免疫放射分析（IRMA）常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。
使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。
标志物制备及鉴定125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
（1）氯胺T（ch-T）法。
（2）乳过氧化物酶标记法。
（3）间接标记法。
放射性标志物的纯化（1）凝胶过滤法：分子筛。
（2）离子交换层析法：极性差异。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：电荷和直径。
（4）高效液相色谱法。
放射性标志物的鉴定1.放射化学纯度：大于95%。
2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。
3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。
方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（1）可靠性。
（2）剂量-反应曲线。
（3）高剂量钩状效应。
放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。
Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag分离结合与游离标志物1.第二抗体沉淀法。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法。
3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。
4.活性炭吸附法。
放射性测量及数据处理可对标记抗原抗体复合物（B）或游离标记抗原（F）进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。
放射免疫分析
(二)对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性 抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的 纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选 取抗体滴度高的血清，为RIA所用。抗血 清的质量直接影响放射免疫分析方法的 灵活敏度和特异性。检查抗血清质量的 指标主要有亲和常数(K)、免疫交叉反应 率及滴度(或抗体效价)。
10
(三)对标记抗原的要求 标记抗原是放射性测定的依据，对标记 抗原的基本要求： 1、标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准 品必须一致。 2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。 3、标记抗原应具有足够高的放射化学纯度
11
(四)分离B与F的方法 理想分离应满足如下要求： 1、分离B、F完全、快速。 2、不影响免疫反应的平衡条件。 3、不受分离操作时的环境因素(如pH、温 度等)的影响。 4、操作简便，分离试剂的来源丰富且价廉。
第四章
放射免疫分析
目的与要求： 掌握放射免疫分析的基本原理， 实验室配置及质量控制。 内容： 放射免疫分析(RIA)是由Yalow 和Berson于1960年创建的一种体 外放射分析技术。这是检验专业 学生必须掌握和重点。
2
第一节
基本原理
一、必须掌握放免分析的基本原理： 放射免疫分析是在体外条件下，由非 标记抗原与定量的标记抗原对限量的特 异性抗体的竞争性抑制的反应。
14
二、掌握放射免疫分析的设计方法： (一)标讥抗原和抗体用量最佳化设计。 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。 (二)标准抗原剂量设计 1、标准抗原剂量范围 2、标准曲线工作范围 (三)加样顺序设计 (四)反应介质
15
(五)反应容积与温度及时间 1、反应容积 缩小反应容积可相应减少 抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记 抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵 敏度，使反应试剂消耗减少。 2、温育温度和时间 抗原、抗体结合反 应的平衡结合常数K与温度有关必须通过 实验来确定最佳工作条件。 (六)B与F分离方法选择 (七)样品采集与保存
演示文档放射免疫分析.ppt
酶免疫分析 发光免疫分析
化学发光免疫分析 酶放大化学发光免疫分析 电化学放光免疫分析
荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析或解离增强镧系荧光免疫分析 BCPDA强荧光螯合物的时间分辨荧光免疫分析 酶促放荧光免疫分析 微粒子酶荧光免疫分析 荧光偏振免疫分析
金属离子免疫分析
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单位换算
1 g=1000mg 1mg=1000µg 1µg=1000ng 1ng=1000pg
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非放射性体外分析技术
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非同位素标记的条件
灵敏度 结合特性 均一性 稳定性 环境因素的不敏感性 临床应用 安全性 应用性
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非放射性体外分析技术
放射免疫分析
Radioimmunoassay
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1
一、原理：
竞争结合
Ag + Ab +
* Ag
AgAb + Ag
* AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定
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2
+
—6 X100=75%
8
+
—4 X100=50%
8
+
—2 X100=25%
8
+
—1 8
X100=12.5%
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3
结论
测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分 子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓 度为坐标，制作标准曲线
待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度
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5
80 70 610
02 4
8 16 32 64 128
第七章 放射免疫分析
第七章放射免疫分析第一节放射免疫技术一、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。
（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。
二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。
三、放射性标记物制备及鉴定（一）原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。
（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。
常用的方法为：①氯胺 T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。
2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。
该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。
（三）放射标记物的纯化1.凝胶过滤法：分子筛机制。
2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。
4.高效液相色谱法。
（四）放射标记的鉴定1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求＞95%。
该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。
2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。
3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。
四、方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。
借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。
平行性好者可靠。
（二）剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。
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特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价 高，但成本高
沉淀法 聚乙二醇（w=6000）
特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大
常用液相分离技术（续）
吸附法 吸附游离部分，适用于分离小分子 游离抗原。活性炭、纤维素粉末
特点 快速、简便、准确性差
盐析法 饱和硫酸胺、硫酸钠 固相分离技术，按材料不同，可分为试管
法、颗粒、小盘法、纸片法
四、放免分析的优点
灵敏度高 特异性强 精确度高 用血量少 体外测量
单位换算
1 g=1000mg 1mg=1000µg 1µg=1000ng 1ng=1000pg
非放射性体外分析技术
非同位素标记的条件
灵敏度 结合特性 均一性 稳定性 环境因素的不敏感性 临床应用 安全性 应用性
Ag量
二、测量步骤
恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37℃或4 ℃温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分
子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓 度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度
80 70 60 50
%
结 合
40 30 20 10
02 4
8 16 32 64 128
浓度
三、放免分析基本条件
标准品 标记抗原 特异抗体 分离剂——分离结合与游离部分
分离剂要求
快速而完全分离 操作简便、来源容易、价格便宜 不受血清、外界条件及其它试剂的干扰 适用于任何容积的反应液 非特异结合率小
常用液相分离技术
非放射性体外分析技术
酶免疫分析 发光免疫分析
化学发光免疫分析 酶放大化学发光免疫分析 电化学放光免疫分析
荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析或解离增强镧系荧光免疫分析 BCPDA强荧光螯合物的时间分辨荧光免疫分析 酶促放荧光免疫分析 微粒子酶荧光免疫分析 荧光偏振免疫分析
金属离子免疫分析
放射免疫分析
Radioimmunoassay
一、原理：
竞争结合
Ag + Ab +
* Ag
AgAb + Ag
* AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定
+
—6 X100=75%
8
+
—4 X100=50%
8
+
—2 X100=25%
8
+
—1 8
X100=12.5%
结论
* AgAb复合物的量取决于Ag的量 Ag量越大， * AgAb量越少 Ag量越小， * AgAb量越大 测量* AgAb量或测量多余* Ag量可推算出