化学发光免疫分析CLIA
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化学发光免疫分析（CLIA）
荧光免疫分析（FIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 颗粒计数免疫分析（PACIA） ……
主 要 内 容
一 . 二 .
概述 放射免疫分析（RIA）
基本试剂 操作过程 质量控制 基本原理 分离技术
三．免疫放射分析（IRMA） 四. 非放射性标记免疫分析技术
酶免疫分析（EIA） 化学发光免疫分析（CLIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）
放射免疫分析（RIA)
（Radioimmunoassay RIA）
RIA主要内容
基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制
♣ ♣♣ ♣♣ ♣
RIA定义
是利用标记抗原和非标记抗原竞争结合
其特异抗体，给予充分的时间，使反应达
125I的特性：
碘元素共有 29 种同位素，其中 23 种放 射性核素，125I最为常用，优点：
半衰期适中（60天），易于商品化和储存， 也利于废物处理； 只发射28keV χ线和35keV γ射线（无β）， 容易测量，辐射自分解少，标记物足够稳定； 化学性质活泼，标记容易，可得到多种标记 物而广泛应用。
基 本 定 义
半抗原---分子量小于5000的肽类，
需与载体蛋白结合才能引起免疫应 答. 抗体（Antibody,Ab）是由B细胞识 别抗原后增殖分化为浆细胞所产生 的一类能和相应抗原特异性结合的 具有免疫功能的球蛋白。
主 要 内 容
一 . 二 .
概述 放射免疫分析（RIA）
基本试剂 操作过程 质量控制 基本原理 分离技术
到平衡，然后分离并分别测定结合的抗原 抗体复合物放射性（B）和游离抗原放射性 （F）来计算出非标记抗原含量的一种超微 量分析技术。
♣ ♣♣ ♣♣ ♣
RIA基本试剂
1、Hale Waihona Puke Baidu记抗原
125I 3H
多数 γ闪 价廉 少数 液闪 费用高
*Ag的质量要求：
标记后不改变原有抗原的生物活性； 标记的放射性核素的t1/2不能太短； 比活度和放化纯度足够高，保证分析 的灵敏度。
抗原的概念
基 本 定 义
抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免
疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应 答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发 生特异性结合的物质。 抗原的两种特性：免疫原性和抗原性 免疫原性（immunogenicity),能刺激机体 发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞 的能力。 抗原性（antigenicity),能与相应抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。
的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量越 少，血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干 扰也少。一般滴度高到1：1000以上，血清 中干扰物质影响就很小。
RIA基本原理
最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗 体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的 基础上的。 Ag ＋ Ab AgAb ＋ *Ag *AgAb 动态平衡体系中，*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结 合反应能力，当*Ag和Ab的量恒定，且Ag+ *Ag的分 子数〉抗体的分子数 ，*Ag与Ag相互竞争同Ab结合， 彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系。
1.
2. 3.
样品或标准品 标记物 分离剂 抗血清
混匀 温浴
混匀 立即
1. 加样
2. 加分离剂
3. 离心
4. 去上清分离 5. 测量
RIA分离技术
目的：将游离*Ag 和*AgAb有效分离。 小分子
活性炭吸附法
大分子
沉淀法
Ab
固相法
聚乙二醇
三．免疫放射分析（IRMA） 四. 非放射性标记免疫分析技术
酶免疫分析（EIA） 化学发光免疫分析（CLIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）
概
述
1.历史回顾
1959年Berson、Yalow开创了放射免疫分析。 于1977年荣获诺贝尔生物医学奖。
1960年Ekins建立了竞争蛋白结合分析法。 1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析。 近年来化学发光、电子化学发光、荧光时间 分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先 后问世，检测灵敏度提高到了10–15g。
RIA基本试剂
2、标准抗原（标准品）
是已知含量并呈梯度浓度的系列 标准抗原，作标准曲线用。 要求： 保证与被测物具有相同的免疫活 性和相同介质。
RIA基本试剂
3、抗体
RIA使用：多克隆抗体 单克隆抗体
衡量抗体质量的指标是：
亲和力:抗体结合的强度
特异性:不受交叉反应物质影响的程度 滴度:抗体的效价——抗体实际应用时
体外放射分析
山西医科医科大学第一医院核医学科
基 本 定 义
定义：全称体外放射配体结合分 析---指在体外条件下，以放射性核素
标记的配体为示踪剂，以结合反应为基 础，以放射性测量为定量手段，对微量 活性物质进行定量分析的一类检测技术 的总称。
配体---能与结构上某一部位起互补结
合的分子或化合物，如抗体、抗原，受 体、蛋白激素
待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系
RIA操作过程
配制已知浓度系列标准抗原（Ag）---现
多由厂家提供已配置好的标准品
加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育 分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F） 用γ计数器测量放射性计数 根据标准曲线或计算机直接算出
Ag
*Ag
Ab
Bound
Free
B
0.67
F
0.33
B/F
2
0.50
0.50
1
0.33
0.67
0.5
0.17
0.83
0.2
竞争放射分析原理示意图
B/F
B/B0% 100
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 0 0 5 10 15 50
剂量-标准抗原浓度
剂量-标准抗原浓度
概
述
2.类型：（据特异性结合试剂的不同分类）
放射免疫分析（RIA） 1959 竞争性蛋白结合分析（CPBA） 1963 免疫放射分析（IRMA） 1968 放射受体分析（RRA ） 70年代 放射酶学分析 70年代 放射微生物分析
概
述
酶免疫分析（EIA）
其他非放射性标记免疫分析：
荧光免疫分析（FIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 颗粒计数免疫分析（PACIA） ……
主 要 内 容
一 . 二 .
概述 放射免疫分析（RIA）
基本试剂 操作过程 质量控制 基本原理 分离技术
三．免疫放射分析（IRMA） 四. 非放射性标记免疫分析技术
酶免疫分析（EIA） 化学发光免疫分析（CLIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）
放射免疫分析（RIA)
（Radioimmunoassay RIA）
RIA主要内容
基本试剂 基本原理 操作过程 分离技术 质量控制
♣ ♣♣ ♣♣ ♣
RIA定义
是利用标记抗原和非标记抗原竞争结合
其特异抗体，给予充分的时间，使反应达
125I的特性：
碘元素共有 29 种同位素，其中 23 种放 射性核素，125I最为常用，优点：
半衰期适中（60天），易于商品化和储存， 也利于废物处理； 只发射28keV χ线和35keV γ射线（无β）， 容易测量，辐射自分解少，标记物足够稳定； 化学性质活泼，标记容易，可得到多种标记 物而广泛应用。
基 本 定 义
半抗原---分子量小于5000的肽类，
需与载体蛋白结合才能引起免疫应 答. 抗体（Antibody,Ab）是由B细胞识 别抗原后增殖分化为浆细胞所产生 的一类能和相应抗原特异性结合的 具有免疫功能的球蛋白。
主 要 内 容
一 . 二 .
概述 放射免疫分析（RIA）
基本试剂 操作过程 质量控制 基本原理 分离技术
到平衡，然后分离并分别测定结合的抗原 抗体复合物放射性（B）和游离抗原放射性 （F）来计算出非标记抗原含量的一种超微 量分析技术。
♣ ♣♣ ♣♣ ♣
RIA基本试剂
1、Hale Waihona Puke Baidu记抗原
125I 3H
多数 γ闪 价廉 少数 液闪 费用高
*Ag的质量要求：
标记后不改变原有抗原的生物活性； 标记的放射性核素的t1/2不能太短； 比活度和放化纯度足够高，保证分析 的灵敏度。
抗原的概念
基 本 定 义
抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免
疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应 答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发 生特异性结合的物质。 抗原的两种特性：免疫原性和抗原性 免疫原性（immunogenicity),能刺激机体 发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞 的能力。 抗原性（antigenicity),能与相应抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。
的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量越 少，血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干 扰也少。一般滴度高到1：1000以上，血清 中干扰物质影响就很小。
RIA基本原理
最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗 体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的 基础上的。 Ag ＋ Ab AgAb ＋ *Ag *AgAb 动态平衡体系中，*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结 合反应能力，当*Ag和Ab的量恒定，且Ag+ *Ag的分 子数〉抗体的分子数 ，*Ag与Ag相互竞争同Ab结合， 彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系。
1.
2. 3.
样品或标准品 标记物 分离剂 抗血清
混匀 温浴
混匀 立即
1. 加样
2. 加分离剂
3. 离心
4. 去上清分离 5. 测量
RIA分离技术
目的：将游离*Ag 和*AgAb有效分离。 小分子
活性炭吸附法
大分子
沉淀法
Ab
固相法
聚乙二醇
三．免疫放射分析（IRMA） 四. 非放射性标记免疫分析技术
酶免疫分析（EIA） 化学发光免疫分析（CLIA） 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）
概
述
1.历史回顾
1959年Berson、Yalow开创了放射免疫分析。 于1977年荣获诺贝尔生物医学奖。
1960年Ekins建立了竞争蛋白结合分析法。 1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析。 近年来化学发光、电子化学发光、荧光时间 分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先 后问世，检测灵敏度提高到了10–15g。
RIA基本试剂
2、标准抗原（标准品）
是已知含量并呈梯度浓度的系列 标准抗原，作标准曲线用。 要求： 保证与被测物具有相同的免疫活 性和相同介质。
RIA基本试剂
3、抗体
RIA使用：多克隆抗体 单克隆抗体
衡量抗体质量的指标是：
亲和力:抗体结合的强度
特异性:不受交叉反应物质影响的程度 滴度:抗体的效价——抗体实际应用时
体外放射分析
山西医科医科大学第一医院核医学科
基 本 定 义
定义：全称体外放射配体结合分 析---指在体外条件下，以放射性核素
标记的配体为示踪剂，以结合反应为基 础，以放射性测量为定量手段，对微量 活性物质进行定量分析的一类检测技术 的总称。
配体---能与结构上某一部位起互补结
合的分子或化合物，如抗体、抗原，受 体、蛋白激素
待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系
RIA操作过程
配制已知浓度系列标准抗原（Ag）---现
多由厂家提供已配置好的标准品
加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育 分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F） 用γ计数器测量放射性计数 根据标准曲线或计算机直接算出
Ag
*Ag
Ab
Bound
Free
B
0.67
F
0.33
B/F
2
0.50
0.50
1
0.33
0.67
0.5
0.17
0.83
0.2
竞争放射分析原理示意图
B/F
B/B0% 100
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 0 0 5 10 15 50
剂量-标准抗原浓度
剂量-标准抗原浓度
概
述
2.类型：（据特异性结合试剂的不同分类）
放射免疫分析（RIA） 1959 竞争性蛋白结合分析（CPBA） 1963 免疫放射分析（IRMA） 1968 放射受体分析（RRA ） 70年代 放射酶学分析 70年代 放射微生物分析
概
述
酶免疫分析（EIA）
其他非放射性标记免疫分析：