第二章发酵工业微生物菌种制备与培养基

2、 酵母菌（yeast） 酵母菌为单细胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜 、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（ petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。 酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。 母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小， 在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的母细胞。如果子芽不与 母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假 丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing) 、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可 食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。
尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经 初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。 微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生 产的不超过一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见 潜力是很大的。 在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放 线菌。
一、培养基的类型和用途 天然培养基 化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种植物和动 物组织或微生物的浸出物、水解液等物质（例如牛肉膏 、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等） 合成培养基: 使用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。 使用于实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、 生 物测定及选育菌种、遗传分析定量研究工作。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备
平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 物理：紫外，快中子 诱变剂
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的
可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
生产特性要符合工艺要求
三、工业生产常用的微生物
由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类（alga ）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。
对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基 。
孢子培养基：
供制备孢子用的培养基。基质浓度（有机氮） 要低些，否则影响孢子的的形成。无机盐要适量， 否则影响孢子的数量和质量。
常用的有麸皮、大（小）米，无机盐、蛋白胨 等配制的琼脂 斜面培养基。
2、防止菌种衰退的措施
如果菌种已经发生退化，产量下降，则要 进行分离复壮。
菌种的分离: 。
• 对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离 的措施，即用稀释平板法或用平板划线法， 以取得单细胞所长成的菌落（colony），再 通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就 可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好 的菌株（strain）。
5、 担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担 子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物 。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视 ，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药 物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇 的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的 “1，2-β-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗 癌作用。
6、藻类（alga）： 培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大 豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28 倍。 培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋 白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO２转变为 石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重 得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油 、和其他产品。 有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植 的单胞藻暗5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60 吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量 排放CO２造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取 氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢 能。
在液体沉浸培养中由于搅拌器（ agitator）的作用，常常形成短的分支旺盛 的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生 长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生 素（antibiotics）。从微生物中发现的抗生 素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素 、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自以下几个属：链 霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。
半合成培养基：既含有天然成分又含有纯化学试剂 的培养基。
固体培养基：外观呈固体的培养基。 半固体培养基：凝固剂量低于正常量 液体培养基：呈液体状态的培养基。
（生物）鉴别培养基：培养基中加入能与某一菌的无
色代谢物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼区别于该菌 与其他菌。
选择培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其
生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此 交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受 环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或 呈分散生长，或呈菌丝团状生长。
工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红 曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素 (antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素 （steroid hormone） 等。
Hale Waihona Puke 如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用 沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所 剩下的孢子中挑选出最优的菌体。 某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能 达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到 复壮的目的。 如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola) 的产孢子能力下降，可适当提高培养温度， 恢复其能力。 同时通过实验选择一种有利于高产菌株 而不利于低产菌株的培养条件。
3、
霉菌（mould）
霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在 营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的 真菌(fungi)统称为霉菌。 霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、 空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性 环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生， 少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性 孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子 繁殖为主。
二 菌种的复壮
• 通过分离达到复壮: 在琼脂平板划线、涂布或与琼 脂培养基混合培养再分离，达到菌落 纯 采用单细胞或单孢子分离法达 到细胞纯 • 通过寄主体达到复壮: 将菌株接种到寄主细胞进行繁 殖达到复壮。
三 菌种保藏（strain preservation）
基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人工 地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活波状态。 要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽 量使菌种保持原来优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠 体如孢子（ spore）、芽孢 (gemma)等；其次是要 创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、 缺氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动 ，延长其保存期的目的。
工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌(Brevibacterium)
用于生产： 生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（proteinase） 乳酸(lactic acid) 醋酸(acetic acid) 氨基酸(amino acid) 肌苷酸(inosinic acid)
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同 时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保 存方法，以便长期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封 保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。
诱 变 育 种
保藏及扩大试验
第四节种子扩大培养
一、 种子扩大培养的任务
1、提供相当数量的代谢旺盛的种子。接种量大，发酵时 间则短。 2、得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接 种数量足够的培养物。
不同产品的发酵，决定种子扩大培养的级数。
第五节 培养基及其制备
培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种 代谢产物所需要的、按一定比例配制的的多种营养 物质的混合物。 培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、 产品的分离精致、产品的质量和产量都有重要的影 响。 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的 酶，将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等 营养物质分解成小分子化合物，在借助于细胞膜的 渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。
第二节 菌种的衰退、复壮与保藏
一、微生物菌种衰退的原因
1、原因 一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利 的条件，或是失去某些需要的条件； 三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失 新的特征的情况。 连续传代是菌种退化的直接原因。 衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产 能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境 能力降低。
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化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养 基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤 单细胞或孢子悬浮液 自然分离（对照液）活菌计数 诱变处理 诱变处理预备实验