QRT-PCR引物设计PROTOCOL
qrt-pcr操作流程的技术要点
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qrt-pcr操作流程
qrt-pcr操作流程qRT-PCR操作流程引言qRT-PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction）是一种广泛应用于基因表达研究的技术，通过逆转录将RNA转化为cDNA，再利用聚合酶链反应（PCR）技术进行扩增和检测。
本文将详细介绍qRT-PCR的操作流程。
1. 实验前准备在进行qRT-PCR实验之前，需要准备以下材料和设备：- RNA样本：提取需要研究的组织或细胞中的总RNA。
- 逆转录试剂盒：包括逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
- PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。
- qRT-PCR仪器：包括逆转录仪和实时荧光定量PCR仪。
- 实验耗材：包括离心管、PCR管、PCR板等。
2. RNA逆转录a. 将RNA样本与逆转录试剂混合，并在逆转录仪中进行反应。
通常情况下，逆转录反应体系包括RNA样本、逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
b. 根据逆转录试剂盒的说明书，设置逆转录反应的温度和时间。
一般来说，逆转录反应的温度范围为42-55°C，反应时间为30-60分钟。
3. cDNA合成a. 将逆转录反应得到的cDNA样品与PCR试剂混合，并在PCR仪器中进行扩增反应。
通常情况下，PCR反应体系包括cDNA样品、聚合酶、引物、dNTPs等。
b. 根据PCR试剂盒的说明书，设置PCR反应的温度和时间。
一般来说，PCR反应包括初始变性步骤（95°C，3-5分钟）、循环扩增步骤（95°C，15-30秒；引物退火温度，30-60秒；72°C，15-30秒）、终止步骤（72°C，5-10分钟）等。
c. 根据所需的扩增产物大小，设置PCR反应的循环次数。
一般来说，循环次数在25-40次之间。
4. 实时荧光定量PCRa. 将PCR反应产物与实时荧光定量PCR试剂混合，并将混合物加入PCR板中。
【实验资源】qRT-PCR原理与应用-早期科普
模板浓度与Ct值关系 线性关系
qRT-PCR实验
1.模板制备 2.引物检验 3.定量检测 4.结果分析
模板制备RNA-cDNA
RNA提取 Trizol法（异硫氰酸胍），盐酸胍，CTAB法 ······
RNA逆转录
裂解材料
核酸分离
沉淀、纯化
特异性，二级结构，长度，GC含量，Tm值 ······ 核心原则：高特异性+高扩增效率
引物质量评价：评价“高效+特异”
软件打分
PCR验证
qPCR扩增曲线+融解曲线
定量检测
程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。
也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆转 录与定量。
qRT-PCR原理
从PCR到qPCR
qPCR原理
荧光标记 Ct值
Taqman探针：探针两端分别接荧光基团与 荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，分离
荧光基团，使之荧光不被淬灭
染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合
扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就
mRNA/Lnc
miR特异性序列+茎环结构，每 个目标序列需要逆转录一次
利用ploy A
随机引物
添加ploy A
一步到位，无Biblioteka 异性逆转录全部RNA为cDNAmiR
茎环法
5’-端引物在逆转 录与qPCR间通用， 3’-端随机
qRT-PCR
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
94℃
模板DNA
50-65℃ 72℃
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
Taq酶
引物1
72℃
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件 94℃ PCR过程 PCR的特点
引物设计
引物长度：17-25bp GC%: 40-60%
Tm:60℃（Primer Premier 5.0）
产物长度：80-300bp,100-200bp最佳
DNA水平
基因
RNA水平
mRNA
蛋白水平
蛋白质多肽链
RT-PCR基本原理
mRNA
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription
mRNA
cDNA
AAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTT
RT-PCR一般步骤
1、RNA提取
RNA质量的检测 一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度 完整性检测（1%琼脂糖胶电泳） 纯度检测（OD260/280）
Ct值（ threshold value ） 每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数被称为 Ct 值。 研究表明，各模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系，起 始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。
定量PCR的数学原理
荧光定量PCR的解析方法
相对定量
qRTpcr实时荧光定量结果数据统计与分析和引物设计
• 显著性差异分析
• 1.在分析界面选择 分析-比较均值-单因素ANOVA 进行分析 • 2.设置因子及因变变量。样本序号为因子，表达量为因变量。
• 显著性差异分析
• 继续设置分析参数及选项 • 设置完成后点击确定，软件开始
统计运算。
• 显著性差异分析
• 运算结果如右图显示。 • 如图中所示，样本1-4中，
• 利用模板分析（以各组织分析为例）
• 将整理好的数据复制进 模板绿色区域
• 模板制作样本设置为18 个样本（组织），若样 本不到18个（组织）， 则删除绿色区域其他数 据
• 利用模板分析（以各组织分析为例）
• 数据导入后模板自动运算， 初步获得柱状图，包括均 值，标准误等。
• 显著性差异分析需利用 IBM SPSS Statistics 20计算。
样本1和其他3个样本不在 同一列，表明样本1与其他 样本有显著差异。
• 显著性差异带入图表后， 如右柱状图所示
样本名称
显著差异
• 显著性差异分析
• 如样本较多，显著性差异标注复杂， 可利用模板下方区域自动标注。
• 将SPSS Statistics 输出结果，复制 进模板指定区域（纯文本模式复 制）。模板会自动将显著性差异进 行标注。
• 导入primer3网址，自动设计引物，选取给出的最优引物。
• 确定序列引物设计范围
• 选取合适范围，例 如图中选择范围 1300-2100 bp区域， 导入primer3在线引 物设计网站中。
• 截取序列模板：蓝色 区域输入原始序列， 红色区域输入起始终 止位置，黄色区域为 导出的范围，直接复 制进引物设计网站。
• 定量结果数据分析
结果数据初步整理
• 将导出ct值数据进行整理， 删除其他列，转换为右侧 所示。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
qRT-PCR protocol
Total RNA was extracted from maize leaves or protoplasts and N. benthamiana leaves using TRIzol reagent (Invitrogen) and treated with 5 U of RNase-free DNAase I (T aKaRa) at 37o C for 30 min. The DNase I-treated total RNAs were recovered by ethanol precipitation. About 0.5 µg total RNA was converted into cDNA (RT product) with the SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) using primers oligo (dT) and random 6 mers (TaKaRa) according to the manufacturers’instructions, yielding 20 μl of cDNA solutions. The R T products were individually diluted 10-fold in the Easy Dilution buffer (TaKaRa) to be used as templates for the subsequent R T-PCR analysis. The maize ubiquitin gene (U29159) was amplified with primers P9 and P10 and used as an internal control for both semi-quantitative and QR T-PCR analyses. Primers P11 and P12 were used for both semi-quantitative and QRT-PCR detection of SCMV infection. For SCMV detection, PCR amplification was conducted with 1 μl of RT product in a 25μl rea ction at the following conditions: 94o C for 2 min followed by 30 cycles at 94o C for 30 s, 60o C for 30 s, 72o C for 20 s, and then 72o C for 10 min. The PCR products were visualized in a 1% agarose gel after staining with 1% (W/V) ethidium bromide and analyzed by an AlphaImager 2200 (Apha Innotech Corp, San Leandro, CA, USA). For PVX infection analysis, primer pair P13/P14, P15/P16, P17/P18 were used to detect expression of ZmRop1s-GFP fusion proteins, accumulation of tobacco (N. benthamiana) NbRbcS mRNA (served as an internal control) and PVX genomic RNA, respectively. PCR amplification conditions were 94o C for 2 min followed by 30 cycles at 94o C for 30 s, 58o C for 30 s and 72o C for 30 s, and a final 72o C for 10 min.The QRT-PCR was repeated three times for each sample and conducted on a DNA Engine Opticon TM2 system (Bio-Rad) following the manufacturer’s recommendations. The experimentwas independently conducted at least three times with different RNA preparations for each treatment. The reactions contained 1 μl of 10-fold diluted cDNA template, 1 μl of 10 mM dNTPs, 200 nM each of the gene-specific primer pairs (P19 and P20 for ZmRop1, P21 and P22 for ZmRop4, P23 and P24 for ZmRop8, P25 and P26 for ZmRop9;P11 and P12 for SCMV mRNA, Sango), 0.4 μl ROX Dye II, and 10 μl of 2× SYBR Premix Ex Taq , in a total volume of 20 μl mixture as instructed by the manufactures (TaKaRa). Thermal cycling conditions consisted of 2 min at 50o C, 10 min at 94o C, and followed by 40 cycles of 94o C for 15 s; 60o C for 15 s; 72o C for 15 s, and 1 s at 80.5o C for plate reading. After the cycling protocol, the final step was applied to all reactions by continuously monitoring fluorescence through the dissociation temperature of the PCR product at a temperature transition rate of 0.1o C/s to generate a melting curve. Quantification was conducted according to the 2−ΔCt method (Pfaffl, 2001). The sequences of primers used in the real-time RT-PCR experiments were listed in Table 1.。
QRT-PCR引物设计PROTOCOL
QRT-PCR引物设计概述：在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA 污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。
下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！要求：1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
2. GC=30-80%；3. 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.5.6.7.8. PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响；至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的；关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
设计方案：I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I）1. 上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染；FPII．跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计）1. 上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，<8bp左右）。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。
PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。
因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。
以下是PCR引物设计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。
引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。
较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。
引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。
此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。
引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。
引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。
在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。
4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。
qrt引物设计原则
qrt引物设计原则
1.选择合适的引物长度：引物的长度应该在18-24个碱基对之间，过短的引物可能会导致引物与非特异性DNA结合，而过长的引物则可能会导致非特异性杂交。
2. 避免引物的自身互补性：引物的5'端和3'端不应该互补，这会导致引物形成二聚体或发生自身杂交，从而影响PCR反应的特异性和效率。
3. 避免引物与非特异性DNA结合：引物序列中应该避免含有重
复序列、富含AT或GC序列等易于结合非特异性DNA的元素，从而避免PCR反应的非特异性扩增。
4. 引物序列应该足够特异性：引物序列应该仅与目标DNA序列
互补，避免与其他DNA序列发生杂交，从而保证PCR反应的特异性。
5. 引物序列应该尽量避免SNP位点：引物序列中的SNP位点可
能会导致引物与非特异性DNA结合或与目标DNA序列不完全匹配，从而影响PCR反应的特异性和效率。
6. 引物的熔点应该适当：引物的熔点应该在50-60℃之间，过
高或过低的熔点会影响PCR反应的特异性和效率。
7. 引物应该避免含有修饰基团：带有修饰基团的引物可能会影
响PCR反应的特异性和效率，因此应该避免使用含有修饰基团的引物。
- 1 -。
不谈原理谈技术：qRT-PCR怎样才能做到“三线合一”
不谈原理谈技术：qRT-PCR怎样才能做到“三线合一”实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是分子实验室家喻户晓的基因表达定量技术。
无论是刚入实验室的菜鸟，还是久经沙场的老手，都需要时不时用一下这个高大上的技术来进行转基因的检测、突变体的鉴定、组织表达的定量或标记基因的表达。
对于大多数老手而言，qRT-PCR不过是配一板PCR体系丢到机器里去，静等两个小时结果出来的一个小实验。
然而对于刚进实验室不久的生物小白们，花了两周时间从各大平台和课本中好不容易掌握了SYBR Green的发光原理、Ct值的定义、甚至可以根据ΔΔCt公式手算定量结果，真正开展实验时，却发现自己面对的唯有一机器、一酶、一PCR板、一移液枪而已。
所以说，qRT-PCR的体系究竟要怎么配置？和普通的PCR有何区别？如何选择合适的酶？如何加样才能避免污染？怎么配体系才能做到“三线合一”？配完体系后有又如何进行程序及参数设定？你是不是掌握了qRT-PCR所有原理但操作起来还是无从下手？如果你并不知道这些实验干货，赶紧搬好小板凳，拿出记录本，这篇文章就是为你而准备的。
1FqRT-PCR的引物设计注意事项qRT-PCR有自己的引物标准。
我们在之前的文章《绝不骗你！RT-qPCR引物设计5秒就够了！》讲过快速设计qPCR引物的方法，简单而言，引物设计要用专门的软件，包括内参基因与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。
扩增片段的长度以200-300 bp为宜。
除此之外，还需要注意以下法则：1）用于突变体的基因表达量鉴定时，引物最好设在两个外显子之间，横跨中间的内含子，这样可以避免DNA的污染；2）用于过表达基因表达量时，需找出该家族所有同源基因并进行比对，并在保守性最差的区域设计引物；3）用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。
除此之外，内参基因的选择也需要稍微走下心。
以模式植物拟南芥为例，常用的内参基因Actin2和Actin7虽然在营养组织有稳定的高表达，但在花粉、胚胎及种子部位几乎无表达。
mRNA的qRT-PCR检测方法
mRNA的qRT-PCR检测方法（1）选择内参基因：一般为actin 、tublin、5S、EF1-a，最好选择两个内参为参照（两个内参结果更加可靠）。
（2）引物设计：所选基因使用Bencon Designer 软件进行引物设计。
此软件会把输入的序列和NBCI上的基因做对比，选出特异性的区域自动设计引物，而Primer 5只在本序列上设计引物，这样设计可能会有非特异性扩增。
Bencon Designer 软件使用步骤如下:打开Bencon Designer--File--New Sequence--粘贴序列--Add--在此方框中选择SYBR Green Design。
单击符号BLAST Search Sequence--Eukaryotic Genome BLAST--Search（等一会自动生成一个对比结果，可以不用看）--单击Primer Search--Primer Parameters（Tm和Ta为55±5℃、Length 18 to 24bp、Amplicon Length 75 to 200 bp、Alternate Primer Pairs 5）--Search--OK（自动生成Sense和Anti Sense序列，直接可以送公司合成序列）。
（OD260/OD280在1.8-2.2（3）RNA提取：Trizol法提取植物总RNA，跑1%的琼脂糖凝胶电泳。
之间，OD260/OD230在2.0-2.2之间）。
（4）RNA反转录：mRNA的qRT-PCR用普通的反转录即可（反转录出来的产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，有弥散的带表明反转录效果好）。
（5）以反转录产物为模板稀释5倍、10倍、20倍、40倍，每个倍数做2管，qRT-PCT选择合适的稀释倍数。
（6）选择一个合适的稀释倍数，Ct值在20-30之间，溶解曲线要为单峰。
在此阶段最好把处理和对照的内参基因的Ct值都调于接近，这样两者最后做出来的数值可比性数值结果更强。
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反响退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，〔1〕设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率〔2〕尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染〔3〕两条引物的Tm值不要相差太大〔4〕产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上〔一般T m=80以下的峰都是引物二聚体〕，对于水稻等GC含量比拟高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。
如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。
〔3〕相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大〔当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在一样位置或者比产物峰还高的错配就死了〕，引物的3'端不要有错配。
〔5〕一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右适宜的位置手动搜索有没有适宜和它配对的评分也比拟高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5'端的300-400bp 区域，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。
实时荧光定量PCR的方法学建立
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。
一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。
2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。
于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。
用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。
3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。
于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。
4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。
5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。
qRT-PCR原理与应用
引物质量评价：评价“高效+特异”
软件打分
PCR验证
qPCR扩增曲线+融解曲线
定量检测
程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。
也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆 转录与定量。
荧光值到模板量
结果与图片
数据分析
绝对定量-标准曲线
标准品 梯度稀释
PCR-Ct扩增曲线
模板浓度 C0-Ct标曲
结果图片展示
扩增与融解曲线
相对定量-ΔΔCt法 内参基因 扩增曲线 Δ数学关系
表达量柱状图
mRNA/Lnc
miR特异性序列+茎环结构，每 个目标序列需要逆转录一次
利用ploy A
随机引物
添加ploy A
一步到位，无特异性逆转录全部RNA为cDNA
miR
茎环法
5’-端引物在逆转 录与qPCR间通用， 3’-端随机
模板质量评价
电泳
光度
梯度模板下qPCR扩增曲线
引物设计与检验
qPCR引物设计原则
原理 qRT-PCR
从PCR到qPCR
qPCR原理
荧光标记 Ct值
Taqman探针：探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，
分离荧光基团，使之荧光不被淬灭
染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合
扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值
qRT-PCR和WesternBlot常见问题解决-李晔——【RT-PCR技术】
Quantion 3 显影时无条带或条带较浅
单白未转到膜上 确保转膜过程中胶与膜完全接触，转印夹层排布正确，适当调整转膜的时间和电流优化转印时
间和电流。
蛋白未完全结合到膜上 在转膜缓冲液中加入 20% 的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使
用小孔径的膜进行。
一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗
找到CDS序列并复制，不同 转录本CDS序列位置不同
将CDS序列复制到引物设计 软件Primer5
根据CDS序列设计引物，Tm值为60至64， GC含量40% 到60%，且found少或没有， 长下游扩增长度为100到150。
引物设计完后BLAST预测引物特异性
预测引物是否跨内含子
定量结果分析：扩增曲线
Quantion 2
扩增效率低，反应条件不够优化。
1
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；
增加镁离子浓度等。
CT值出现过晚
2
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3
PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Quantion 3 标准曲线的线性关系不佳
1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
扩增曲线 样品放置
定量结果分析：扩增曲线
率先到达CT值得RNA浓度较高，模板较好，内参的CT值一般为10到16之间。
定量结果分析：溶解曲线
出现杂峰引物需要重新设计
单一峰引物特异性较好
qRT-PCR常见问题解决
Quantion 1
无CT值（信号）出现
1.反应循环数不够。 一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（45cycles）， 但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2.检测荧光信号的步骤有误。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或 延伸结束采集信号。 3.引物或探针降解。 可通过PAGE电泳检测其完整性。 4.引物或探针的设计。 探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。 5、模板量不足。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结 束时或延伸结束采集信号。 6.模板降解。 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
qPCR引物设计
荧光实时定量PCR引物设计I．靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相对物种较多PrimerBank (/primerbank/index.html) 人，鼠Real Time PCR Primer Sets () 人，mouse，rat如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer()B.DIY的软件Primer ExpressC.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:/products/probe_design.asp您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI 的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
pcr引物设计操作流程
pcr引物设计操作流程
PCR引物设计是PCR技术中非常重要的一步，引物的设计质量直接影响到PCR反应的效果和结果。
下面是PCR引物设计的操作流程：
1. 确定目标序列：首先需要确定要扩增的目标序列，这个序列可以是基因、DNA片段或RNA序列等。
2. 选择引物设计工具：选择合适的引物设计工具，比如NCBI Primer-BLAST、Primer3等在线工具或者专业的引物设计软件。
3. 设定引物设计参数：根据实验需求设定引物设计的参数，比如引物长度、GC含量、Tm值等。
4. 引物设计：根据目标序列和设定的参数，使用引物设计工具进行引物设计。
通常需要设计一对引物，一个用于扩增目标序列的前端，一个用于扩增目标序列的后端。
5. 引物评估：对设计出的引物进行评估，包括检查引物的特异性、二聚性、自身互补性等。
6. 引物合成：将设计好的引物提交给引物合成公司进行合成。
通常引物的长度在18-25个碱基对之间。
7. PCR反应：将合成好的引物与DNA模板、PCR反应缓冲液、
DNA聚合酶等混合，进行PCR反应。
根据引物的设计，可以选择不同的PCR条件进行扩增。
8. PCR产物分析：对PCR反应产物进行分析，比如琼脂糖凝胶电泳、测序等，确认扩增的目标序列是否正确。
总的来说，PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一步，需要仔细设计和评估引物，确保PCR反应的准确性和可靠性。
通过以上的操作流程，可以有效地设计出高质量的引物，为PCR实验的成功提供保障。
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QRT-PCR引物设计
概述：
在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA 污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。
下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！
要求：
1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
2. GC=30-80%；
3. 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
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5.
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8. PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响；至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的；关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；
9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
设计方案：
I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I）
1. 上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染；
FP
II．跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计）
1. 上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，<8bp左右）。