实验五大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；⏹ 3、培养物于冰上放置20min；⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
大肠杆菌感受态的制备
五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞，以便外源DNA 进入，从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。
在低温、低浓度CaCl2的作用下，大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构，细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离，细胞膜的通透性增加，此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂（1）培养基：LB，LA。
（2）溶液：10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液，0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
（3）菌株：E.coli DH5α。
实验操作（1）用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上，放在恒温培养箱37℃培养后，挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中，于37℃摇床、200rpm过夜培养。
（2）按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100～200ml 的LB培养基中，于37℃摇床、200rpm培养3～4h，使菌液的OD600达到0.6～0.8。
（3）冰浴菌液30min，同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷，在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（4）离心后尽量除去培养液，用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体，冰浴25min后，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（5）离心后弃去上清液，重复步骤（4）一次。
（6）弃去上清液后，将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中，按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中，-80℃保存备用。
实验五大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)
（三）试剂 1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液
实验步骤
1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养14hr。
2. 取2mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩 大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5 时，停止培养。
实验五 大肠杆菌感受态的制备 （CaCl2法）
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论
实验目的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是 限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株。
Ep 管中，4℃保存备用。
（如加入
15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。
实验结果与讨论
感受态细胞长时间处在常温状态，会严 重影响到其转化率，因此应尽量减少常 温操作，动作要迅速。
尽量在无菌状态下操作，减少污染的可 能。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通 透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的 载体分子进入的感受态细胞。
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器
（二）材料 大肠杆菌DH 5α。
3. 菌液冰上放置10min，无菌条件下移入50ml Beckman离心管中，4℃，3,500rpm，离心 5min。
4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌 CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放 置5min。
5. 4℃，3,500rpm离心5min。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法二、实验原理遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、转导、转染、转化等方法进行。
转化是指某一细胞由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型与表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为在细菌生长对数期的后期是发展感受态的理想时期。
三、实验材料水浴锅、制冰机、离心机、超净工作台、恒温培养箱、各式移液器、培养皿；大肠杆菌DH5α；LB液体培养基、0.1M CaCl2溶液。
四、实验步骤1、挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃，250r/min，过夜。
2、取150μl过夜培养物接种于15ml LB液体培养基中，37 ℃，250r/min，培养至OD600 ≈0.375（一般为2h左右，呈云雾状，使细菌处于对数早期或中期）。
3、将培养物1.5ml分装到预冷无菌的指形管中，冰上放置5～10min。
4 ℃，2000rpm，10min，弃上清。
4、沉淀用1ml冰冷的CaCl2溶液重悬，4 ℃，2000rpm，10min。
5、重复步骤④。
6、用200μl冰冷的CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min，备用。
五、思考题重组基因的导入方法有哪些?答：（一）大肠杆菌：1、Ca2+诱导转化2、电穿孔转化法3、三亲本杂交接合转化4、重组噬菌体转导（二）植物细胞：1、农杆菌介导的Ti质粒载体转化2、DNA直接转移法（三）动物细胞：1、病毒颗粒转导2、磷酸钙转染法3、DEAE-葡聚糖转染4、显微注射5、脂质体介导6、电穿孔DNA转移。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2法）及转化方法感受态细胞的制备：方案一：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；4）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min；5）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）方案二：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）将培养物连至锥形瓶至于冰上冰浴30min;4）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；5）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）热击转化步骤：1）在制备好的感受态细胞100 μL中，加入10 μl连接产物或1μl 质粒（依照质粒浓度而定）混匀，冰上放置30 min；2) 42 ℃温浴90 s（或者45℃温浴45 s）后迅速置入冰上1 min，加入800 μL LB培养基，37 ℃，180 r/min培养45min-1 h；3) 将孵化好的菌液涂布在相应的抗性平板上倒置，37 ℃培养过夜，PCR鉴定阳性转化子。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
PART A 分子生物学实验实验五大肠杆菌感受态细胞的制备和转化内容提要采用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞，并用质粒pUC19进行转化，利用抗生素来筛选转化子。
本实验要求：1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。
2、能够计算感受态细胞的转化效率。
原理将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。
受体细胞经过一系列处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许质粒分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
与电击法等其它方法相比，CaCl2制备法不但简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，若制备出的感受态细胞暂时不用时，即可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存半年以上，因此CaCl2法是分子生物学研究中最受欢迎的方法。
本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，并将pUC19 质粒转化至感受态细胞。
进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp 的培养基上不能生长。
能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）说明已导入了pUC19。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
2. 实验材料大肠杆菌E.coli DH5a 菌株，pUC19经实验1提取。
3. 试剂⑴. 1 mol/L CaCl217.9g CaCl2·2H2O溶于100ml水中。
⑵. 100mg/ml 氨苄青霉素（ampicillin）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
感受态大肠杆菌制备(CaCl2法)
感受态大肠杆菌制备1.实验原理感受态：即细菌处于易于吸收外源DNA的状态。
当细菌处于0℃的0.1M CaCl2低渗溶液中时，细菌细胞会膨胀成球形。
而当转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌细胞表面时，经42℃水浴短时间热激处理，能促进菌细胞吸收DNA复合物，最终完成DNA 的转化。
2.仪器、材料与试剂2.1 仪器与设备超净工作台；低温离心机；恒温摇床；高压灭菌锅；恒温水浴锅；培养皿2.2 材料与试剂（1）细菌菌种：如DH5α等；（2）溶液：甘油；0.1 mmol/L CaCl2（灭菌）或者0.08 mmol/L MgCl2-0.02 mmol/L CaCl2（灭菌）（3）LB培养基：配制每升培养基时应在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，NaCl 10g，搅拌直至溶解，用5mol/L NaOH溶液（约0.2ml）调节pH值至7.0，再加入去离子水至总体积为1L，高温高压灭菌20min。
（4）LB琼脂培养板：先按上述配方配制液体培养基，在高温高压灭菌前每升培养基加入琼脂粉16g（即16g/L）。
3.实验步骤（1）从负80℃冰箱中拿出菌种；（2）在LB琼脂培养板中“Z字形”划线；（3）将培养皿置于37℃中过夜培养；（4）挑取大肠杆菌单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜（不超过16h）；（5）按1%~2%的接种量将上述菌液接种到20mL LB培养基中，37℃，250rpm 震荡3~4h（菌液OD值约为0.6）；（6）提前对超净工作台，移液枪，枪头，离心管等进行紫外灭菌处理；（7）取10mL培养物，冰浴10min，4℃，3000rpm离心10min；（8）弃上清，倒置1min，尽量将培养基流尽；（9）加5mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（或者0.08 mmol/L MgCl2-0.02 mmol/L CaCl2），轻轻悬浮细菌沉淀，冰上放置30min；（10）4℃，3000rpm离心10min；（11）弃上清，倒置1min，尽量将培养基流尽；（12）加入2mL预冷的0.1mol/L CaCl2-15%甘油溶液，轻轻悬浮细菌沉淀；（13）冰上放置5min，即为感受态细胞悬液；（14）每管50μl分装到1.5mL的离心管中，保存于负80℃冰箱中备用。
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。
传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。
本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。
二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。
（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。
（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。
（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。
（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。
（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。
（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。
（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。
为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。
（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。
大肠杆菌感受态细胞制备
E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。
二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。
注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。
三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。
此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。
四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。
转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。
在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。
注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。
培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。
五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。
2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。
3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态
CaCl2法制备大肠杆菌感受态转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
一. 材料E. c oli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。
二. 试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。
2.Amp母液：配方见第一章。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。
5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
研究生实验五 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选
1 目的基因的获取
1.1 化学合成法：已知序列 1.2 基因组DNA： 将某种生物的基因组DNA切割成一
定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行 克隆。这些存在于所有重组等 反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用
(2)免疫学方法：
如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白 质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。
抗 药直 性接 标选 记择 选法 择
( )
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
α 互 补 的 检 测
未转化的菌不具有抗 性，不生长； 转化了空载体，即未 重组质粒的菌，长成 蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌， 即目的重组菌，长成 白色菌落。
3 实 验 步 骤
弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净
制备受态细菌
沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 μ l，重悬菌体。 取感受态细菌100 l转移到一无菌的1.5 ml的EP管中 每管加入质粒5 l 轻轻旋转EP管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动EP管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出EP管，每管加入LB培养基400 l 置于370C摇床（100~150 rpm），温和震荡30min
3 外源基因与载体的连接
①粘性末端连接： GGATCC CCTAGG
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
板。
2、Amp母液：
称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤 器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞 时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞 可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基 因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表 现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计 转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg) （注：理想值可达5×106～ 2×107转化子/ μg DNA）
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所 有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于 0℃冰箱储存 .
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA 片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖,重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA 分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
大肠杆菌感受态的制备-CaCl2法
大肠杆菌感受态的制备一、准备材料：缓冲液和溶液：CaCl2·2H2O:贮存液浓度为1M，使用浓度0.1M；使用时取10mL加90mL水稀释至100mL；另含15%甘油的0.1MCaCl2也需要配。
MgCl2·6H2O:贮存液浓度为1M，使用浓度0.1M；使用时取10mL加90mL水稀释至100mL。
以上溶液经0.22μm滤膜过滤除菌。
培养基：(新鲜配置)LB:1%蛋白胨(W/V)，0.5%酵母提取物(W/V)，1% NaCl(W/V)；固体培养基加入1.5%琼脂(粉)。
高压灭菌。
仪器和材料：离心机，制冰机，水浴锅；50mL聚丙烯离心管(预冷)等。
——————————————————————————————————方法：(相关操作需在无菌工作台冰上进行)(1). 将于-80℃冰箱保存的DH5α(或其他)菌株，在LB无抗生素平板上划线，37℃培养直至长出单菌落,一般生长16～20h,菌落直径1-2mm。
(2). 挑取单菌落，接种于于含20ml 新配置LB培养液的100mL三角瓶中，37℃培养至OD值0.8-1.6(确保细菌处于对数期，保证其活力)。
(3). 将过夜培养菌液按照0.5-%~1%体积比接种于于含100ml 新LB培养液的500或1L三角瓶中，37℃220rpm培养1～3小时至OD600=0.4-0.6，0.35的时候就可以收取。
(转速不宜高，200-220rpm)(4). 将CaCl2-MgCl2、CaCl2溶液，50mL离心管放在冰浴上预冷。
(5). 时间到，将培养液冰浴10min，分装于两个50mL遇冷的离心管，4℃4000rpm (或者3000g)离心10min，收集菌体，去除上清(倒置扣干1min，以使最后痕量培养液流尽)。
(6). 向离心管中加入20ml冰冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mM MgCl2, 20mM CaCl2)，先后吹吸重悬两个离心管中的菌体最终合并到同一管中。
CaCl2法大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~4ml LB液体培养中，37℃振荡培养~12h左右，直至对数生长期。
将该菌悬液以1:100～1:50转接于3 x 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）取培养液50ml转入50ml离心管中，在冰上冷却30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，用15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10Min；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入~15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。
冰浴10 min 后，0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）加入占总体积10％左右高压灭菌过的甘油，混匀后以200 l为单位分装于0.5ml EP 管中，置于-80℃保存。
大肠杆菌感受态的CaCl2制备方法及问题解答
大肠杆菌感受态的CaCl制备方法:21.受体菌E.coil JM109活化，从-70℃冰箱中取出菌种，在LB培养基上划线，37℃培养过夜。
2.挑取划线平板上的单菌落接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜形成种子菌液。
3.取1mL种子菌液接于50 mL新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床培养2-2.5 h后，大约是对数生长期，取出，以LB液体培养基为空白对照，测菌液的OD 值，OD≈0.6时，停止培养，放置于4℃冰箱冷却半小时。
4.取对数生长期的菌液50 mL转移到无菌离心管中，置于冰上放10min,4℃,6000rpm,离心10 min,在超净台内倒出上清液。
倒置1 min,使最后的痕量培养基流尽。
5.加入10 mL冰上预冷的0.1 M CaCl2重悬，打匀，置于冰上20 min.6.4℃,6000rpm,离心10 min。
7.在超净台上倒出上清，并用灭菌滤纸条吸尽残夜。
8.加入405 uL冰上预冷的0.1 M CaCl2和95 uL 80%甘油，轻轻悬浮混匀，冰浴3min.9.按照每管40 uL分装感受态细胞，液氮速冻后放于-70℃冰箱保存。
常见问题解答：1）转化实验为什么要先用液态的LB后用固态的培养基呢?转化实验用液态的LB是为了让细胞恢复培养，也称之为让其孵育，质粒或其他经在液态LB中恢复培养后再涂布平板（固态培养基），是为了分散开，以培养单克隆。
一般经37℃倒置培养12-16h后，就可以看到有单个克隆长出，就可挑取了2）大肠杆菌感受态细胞制备试验中为什么转化后要在37℃摇床上温育1h？温育就是让感受态恢复一下状态,以及一些相关抗性基因的表达，毕竟从-80℃的环境中取出，需要一段时间适应，然后方可转化。
（建议：国内的研究人员，喜欢做这一步，其实这步完全可以省略，直接涂平板，感受态没问题的话，作出的克隆够你用的了，10000个与1000个，对于你挑的平板来说一样的，关键是节省了时间，国内试验的时间资源太浪费，东西出的慢，这是个小trick,大家可以试一下）3）大肠杆菌感受态制备为什么要冰上操作,0-4℃操作？细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为DNase会消化外源DNA，如形成抗DNase的物质有利外源DNA的生存），从低温突然提高到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量cAMP，而cAMP可改变细胞膜通透性，促使细胞吸收DNA复合物，从而大大提高转化率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4.的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是 限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株。
3. 菌液冰上放置10min，无菌条件下移入50ml Beckman离心管中，4℃，3,500rpm，离心 5min。
4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌 CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放 置5min。
5. 4℃，3,500rpm离心5min。
6. 弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L) 重新悬浮细胞，200μL/份分装到预冷的无菌
（三）试剂 1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液
实验步骤
1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养14hr。
2. 取2mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩 大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5 时，停止培养。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通 透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的 载体分子进入的感受态细胞。
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器
（二）材料 大肠杆菌DH 5α。
Ep 管中，4℃保存备用。
（如加入
15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。
实验结果与讨论
感受态细胞长时间处在常温状态，会严 重影响到其转化率，因此应尽量减少常 温操作，动作要迅速。
为减少对细胞的机械损伤，操作时动作 不能剧烈。
尽量在无菌状态下操作，减少污染的可 能。