酶学-2011-2

另外、还有一些辅助基团，起辅助催化基团的
作用。如电子或质子的转移等。A0220001
酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化 作用所必需，故称为必需基团。但在酶活性中心
以外的区域，尚有不和底物直接作用的必需基团，
称为活性中心外的必需基团。
这些基团与维持整个酶分子的空间构象有 关，可使活性中心中各有关基团保持于最 适的空间位置，间接地对酶的催化活性发 挥其必不可少的作用，有人称之为结构基 团（或残基）。
采用对某些化学基团有特异结合作用的化
学修饰剂与酶分子活性中心中的基团共价结合， 导致酶活力丧失，从而推Fra Baidu bibliotek修饰后使酶失活的化
学基团。
其中亲和标记和差别标记法虽能较特异
地修饰或标记活性中心的必需基团，但化学 方法有不少缺点，如只能修饰极性基团，无法 区别被修饰的羧基来自Asp或Glu，氨基是ε还是α-末端氨基，羟基来自Ser或Thr等。如 不知该酶的氨基酸顺序，也难以得知活性基团 的定位（氨基酸序号）。
参与活性中心的化学基团实际上就是酶蛋 白氨基酸残基的侧链，有时尚包括肽链末 端的基团。这些基团在一级结构上并不互 相毗邻，而往往分散在氨基酸残基序列中， 甚至分布在不同的肽链上。
故活性中心和模体不同，模体中的氨基酸 残基一般在一级结构上是顺次相连的，而活性中 心则要依靠酶分子的二、三级结构，即肽链的卷 曲、折叠，包括形成肽链间的二硫键，才使这些 互相隔离的基团靠近，集中在酶分子表面而形成 具有三维结构的特定区域。
如大肠杆菌甘氨酰-tRNA合成酶的β亚基受N-乙 酰亚胺（NEM）修饰后活力丧失和NEM浓度有计量
关系。曾误认为93、395和456的半胱氨酸巯基是
活力所必需的。
后来用蛋白质工程法用Mr相当的丙氨酸取代这
三个半胱氨酸，酶并不失活，可见NEM的修饰
失活是修饰后的半胱氨酸残基立体障碍阻碍了
底物和酶的结合所致。目前蛋白质工程法在国
(2)Glu35-COOH起酸催化作用，把H+传递给糖苷 键的氧原子，使糖苷键断裂，生成产物E糖环。
(3)失去H+的Glu35成为Glu35-COO-，起碱催化 作用，吸引水分子的一个H+，而恢复Glu35-COOH; 水分子失去H+成为OH-，攻击D糖环上的C-l碳原子， 生成另一个产物。
2. 化学法
ATP为底物，但其ATP结合模体为HIGH。
蛋白激酶C（PKC）的N端1/2肽段为调节结
构域，常规型PKC（包括α、βⅠ、βⅡ、γ四
种亚型或同工酶）含有3个与酶活力调节有关的
模体（图-2）：
①假底物模体PS，其中心肽段为RK(或R.Q)GAL
(或I、V、R)R六肽，与被PKC磷酸化的底物的
肽段RXXSXR基本相同，只是第4位的Ser（磷酸
CRR-2模体中的Asn在结合中起重要作用，可增 加CRR-1 与DG或PMA的结合力。DG或PMA和CRR 模体结合后，可引起酶的变构，改变肽链的折 叠状态，解除假底物序列对催化中心的阻断作 用而导致酶的激活。
③钙结合模体CaBS,DG对酶的激活需要 Ca2+的存在，因Ca2+和钙结合区结合后可加强 酶的激活。新型PKC(δ、ε、η、θ、μ亚型)由 于缺乏CaBS模体而不受Ca2+激活，但仍受DG及磷脂 激活。PKC的C端1/2为催化区域，除有ATP结合模 体（图-2中的ABS）外，尚有蛋白质结合模体
（PBS）和催化位点AspPheGly(DFG)。
弗林蛋白酶（Furin）是一种蛋白质前体加
工酶,它借跨膜结构定位于外侧高尔基体网络 (TGN) , 也可存在于细胞膜及胞外基质中。但它 在胞外的停留十分短暂，可通过胞饮作用而重新 返回TGN。
弗林蛋白酶的胞质结构域中有两个分开的四肽 模体和酸性模体，前者是位于762~765位的 YKGL，后者为774~783的CPSDSEEDEG。
如胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ilel6、His57、 Asp102 、 Asp194 和 Ser195 （ 序 号 以 酶 原 为 准），它们在酶原形成时分散在一条肽链上， 但酶原经胰蛋白激活后，形成A，B，C三条 肽链，前三个残基在B链，后两个在C链。
在空间结构上已互相接近，形成Asp102、 His57和Ser195线性排列。在活性中心的基团中， 有的担负和底物结合的作用，称为结合基团，有 的可能参与使底物转变成产物，称为催化基团， 但有时结合基团也参与催化作用。
3. 蛋白质工程
是近年来发展的研究酶
必需基团和活性中心的最先进方法，将酶相应的 互补DNA（cDNA）定点突变，此突变的cDNA表达出 只有一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其
活性就可以知道被置换的氨基酸是否为活力所必
需。本法有上述化学修饰方法无可比拟的优点：
①可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响 其他同类残基； ②可改变疏水残基，使其转变成亲水或 另一疏水残基；
二、酶分子的模体
在蛋白质的结构中模体(motif)是由数 十个氨基酸组成的具有一个相对独立功能的小区， 一个结构域可包括数个模体，如催化结构域可包 括能和几种不同底物相结合的模体，调节结构域 也可含有与不同调节物结合的模体。但有的模体 也可独立存在而不属于某个既定的结构域。
20个氨基酸的一字符：
G,A,V,L,I,P,
化位点）换以Ala，故不能被自身催化而成为
假底物。
但这个假底物序列可和酶催化中心的底物 结合位点相结合而阻断真底物和酶的结合。②两 个富含Cys的模体（CRR-1和CRR-2），CRR-1能和 激活剂甘油二酯（DG）或佛波酯（PMA ） (phorbol esters 强促癌剂刺激细胞增值，生物 大分子的合成，刺激前列腺素的合成。）结合，
③可同时改变活性中心内外的几个氨基酸，研 究这些氨基酸之间的相互关系； ④可人工造成一个或几个氨基酸的缺失或插入， 了解肽链的缩短或延长对酶活力的关系；
⑤可定点改变酶蛋白的磷酸化位点或糖化
位点，研究磷酸化或糖化对酶结构和功能的影响；
⑥不会引起底物和活性中心结合的立体障碍。 化学修饰使被修饰的氨基酸残基变大，可导致底 物和活性中心结合的立体障碍。
氨酸而有半胱氨酸，如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，
称为－SH蛋白酶。
表2-1一引起酶活性中心中的残基或基团
酶 参与活性中心的残基或基团
胰蛋白酶 α-胰凝乳蛋白酶
弹性蛋白酶 羧肽酶A 核糖核酸酶 溶菌酶 乳酸脱氢酶 α-半乳糖苷酶 谷胱甘肽S-转移酶(胎 盘)
His42,Asp87,Ser180 His57,Asp102,Ser195,Asp194,Ile 16 His42,Asp87,Ser180
了解参与酶活性中心的各种化学基团的性质 对研究酶结构和功能的关系具有十分重要的意义。 一般有物理学、化学和蛋白质工程三种方法。
1. 物理学方法 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物
与酶形成的中间复合物中各种基团（包括酶和底
物）的相对位置，如溶菌酶是129个氨基酸组成的 水解细菌壁上肽多糖的酶，肽多糖主要由乙酰氨 基葡 萄糖和乙酰胞壁酸（也称乙酰氨基葡萄糖3-乳酸醚）交替连接的线性多糖和短肽交联合成。
际上已被普遍应用。
（三）组成活性中心的重要化学基团
用化学修饰方法测出在大多数酶的活性中心
上有8种氨基酸的频率最高，即Ser、His、Cys、 Tyr、Try、Asp、Clu、Lys。
蛋白酶和酯酶一般含有Ser和His，如胰蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等，称为丝氨 酸蛋白酶。但也有些蛋白酶的活性中心不含丝
表1列举了一些酶活性中心与催化作用有关 的主要氨基酸残基或基团，其中有些虽和底物结
合有关，但大多数结合基团未罗列在内，如乳酸
脱氢酶和NAD+或NADH结合的基团多达10个以上。
对金属酶类来说，活性中心中还有一些金 属络合的基团也属于必需基团。如羧肽酶 A 中 与 锌 离 子 络 合 的 His69 、 Glu72 和 His156。
发现的另一活力类型的活性中心。
综上所述，酶蛋白分子中的各种氨基酸 残基的作用可以归纳如下：
如最近发现，猪乳酸脱氢酶M（A）亚基就是 DNA螺旋解链蛋白，神经细胞的胆碱酯酶尚有 自身分解的蛋白酶功能，因此对一种酶活力而 言的非贡献残基，对另一种活力（酶或非酶） 也许是必需残基。
（二）酶活性中心化学基团的鉴定
Arg145,Tyr248,Glu270,Zn2+ His12,Lys41,His119 Glu35,Asp52 Asp30,Asp53,Lys58,Tyr85,Arg101 ,Glu140,Arg171,His195,Lys250 Try,His,COOH Cys47,Lys,Arg,His,COOH,Trp
四肽模体在人、鼠、牛来源的弗林蛋白酶 中完全保守，且普遍存在于各种能通过胞饮途 径循环于细胞膜与高尔基体之间的膜蛋白中， 它们都处于相距跨膜结构域20~30氨基酸残基的
胞质区。
酸性模体也可能在酶定位于膜结构中起作
用。因为一些膜蛋白，如运铁蛋白受体、表皮生 长因子受体、低密度脂蛋白受体乃至溶酶体的酸 性磷酸酶中也存在这类酸性模体，说明具有不同 功能的酶只要有某一相同或相似的性能，就可能 存在这类同源性的酸性模体。
然而，在酶的催化域中还存在一些不属于活
性中心或结构基团的残基，称为非必需或非贡献
基团（残基）。例如木瓜蛋白酶中的2/3、烯醇化
酶中的1/5残基属于这一范畴。
这类残基虽对酶的某一催化活性不起作用， 但它们也许在种系发育的物种专一性、作为免 疫原或在细胞内转移和定位、防止降解等方面
起着一定的作用。也可能它们是该酶迄今尚未
另一有趣的例子是磷脂酶A2、磷脂酶C、蛋白 激酶C和GTP酶活化蛋白（GAP）等都可和膜结
合与受钙激活，都含有高度同源的Ca2+依赖性
膜连接模体。
三、酶的活性中心
（一）活性中心必需基团的概念（17501）
酶蛋白的催化结构域中和底物结合并发挥催 化作用的部位，称为酶的活性中心，是酶显示 活性直接相关的区域。
C,M, T,S
D,E Q,N, F,Y,W, H,R,K, Q,W,E,R,T,Y,I,P,A,S,D,F,
G,H,K,L,C,V,N,M
具有相同或类似的酶常含有相同的模体， 如所有以ATP为底物的蛋白激酶在催化结构域中有 一个22~27肽的区段，GXGXXGX15~20K，称为ATP结合
模体。另一类合成酶如氨基酰-tRNA合成酶虽也以
X射线衍射图表明，此酶是一个近似椭圆形 的分子，其表面有一条与分子长轴平行的沟， 其长度恰巧容纳底物分子中6个糖单位，糖单 位与沟壁活性中心的基团如Glu35，Asp52等以 氢键相连，其中第4个糖环形成半椅式构型后 与酶更紧密地结合，酶的催化作用是水解第4 个糖环中的糖苷键水解。
(1)底物与酶分子活性中心结合，图中仅显示 D糖环和部分E糖环。天冬氨酸残基Asp52-COO-和 谷氨酸残基Glu35-COOH分别处于糖链的两侧。