Western_blot_试剂配制及实验步骤
Western blot试剂配方
SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 36.33g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS配置量：200ml配制方法： 1.称取2g SDS。
2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。
注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。
30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。
丙烯酰胺58gN-N亚甲基双丙烯酰胺2g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%APS （W/V）组份浓度：10%（W/V）过硫酸铵配置量：1ml配制方法： 1.称取0.1g过硫酸铵。
Western blot 常用试剂配制
Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
Western_blot_试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（MW121.14，PH7.5）1%NP400.5%TritonX-1000.2%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘油调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.671g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3.10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4︒C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4︒C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150μl10%AP 150μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60μl10%AP 60μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western Blot
Western Blot (蛋白质印迹)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
具体步骤如下：一、蛋白样品的制备贴壁细胞总蛋白的提取: 首先弃尽培养液，以4℃的PBS（pH7.2-7.3）清洗细胞三次，再加入RIPA裂解液（PMSF须现加），来回摇晃数次，裂解持续30min，裂解结束后，用刮棒将细胞置于一侧，用移液枪将细胞和裂解液一并吸入离心管中。
（此前的过程均须在冰上进行）于4℃下12000rpm离心5 min，上清转移放于-20℃保存。
组织中总蛋白的提取：将组织尽量剪碎，拌匀，加入RIPA裂解液（PMSF须现加），混匀后置于冰上。
裂解30 min后用移液枪转移入离心管，于4℃下12000 rpm离心5 min，上清转移放于-20℃保存。
二、蛋白含量的测定（Bradford法）考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
Western blot实验所需试剂配制方法
12. 考马斯亮蓝染色脱色液：
名称 冰醋酸 甲醇 去离子水
用量 100ml 100ml 800ml
备注 充分混匀后使用
13. 2%的丽春红贮备液(20mL)：
名称 丽春红 三氯乙酸
用量 5g 0.4g
备注
磺基水杨酸
6g
充分溶解，定容 20ml
精品
.
制胶： 14、 分离胶的制备（pH 8.8）
15、 浓缩胶的制备（5%Acrylamide）
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
精品
.
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
缓冲液配置：
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
名称 Tris Glycine SDS 去离子水
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
精品
. 精品
定容到 1000ml
备注 室温保存
8. 1ⅹ膜转移缓冲液：
名称 Glycine Tris SDS 甲醇 去离子水
用量
2.9g
2.9g
5.8g
5.8g
0g
0.37g
用前加 200ml 甲醇 用前加 200ml 甲醇
定容到 1000ml
定容到 1000ml
备注 室温保存
9. 5×SDS-PAGE Loading Buffer：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
Western blot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western 步骤
Western blot规范化操作步骤1、主要试剂配制2、操作步骤（1）细胞总蛋白提取1）收集细胞，冰预冷PBS洗两遍2）加入适量细胞裂解液（50-100uL），涡旋混匀冰上放置5min3）超声破碎细胞（程序化）4）超声后，在4℃，12000rpm离心10min。
收集上清，即为总蛋白裂解物（2）检测蛋白浓度1）使用BCA法检测蛋白浓度2）调整样品浓度一致3）加入蛋白4×loading buffer，煮沸20min，冷却后-20℃保存（3）SDS-PAGE电泳根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶（根据图1确定分离胶浓度），5%的浓缩胶，蛋白上样量一般为25-40ug（根据目的蛋白表达水平调整上样量）。
电泳以恒压进行，浓缩胶电压80V（约30min），待蛋白进入分离胶后，改变电压至120V。
待溴酚蓝行进至分离胶下缘时停止电泳（1-1.5h）。
（4）湿式转膜1）电泳结束前准备合适大小的PVDF膜（甲醇浸泡2-3min，活化正电基团，肉眼观察膜表面无白色点状或块状区域存在后，置于电转缓冲液至少15min待用）或硝酸纤维素膜（NC膜，浸泡于蒸馏水10min，平衡离子强度）。
准备适合大小的滤纸浸泡于电转缓冲液备用。
电泳结束后，小心撬开玻璃板，用切胶器将上层浓缩胶剥去，将凝胶转移至电转缓冲液中。
2）在电转缓冲液中按照以下顺序制作三明治:海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵（厚海绵，压缩滤纸上下各一块或薄滤纸上下各3层，电转板白色部分在下方），对齐，用玻璃棒赶走气泡。
3）将电转板放入电转槽中(黑色对着黑色面)，浸泡在电转缓冲液中，冰浴中以200mA恒流电转2h（分子量较大的可以延长转移时间）。
电转结束后，将PVDF 膜（或NC膜）放在丽春红染液中染色3-5min，观察蛋白转移情况后，根据蛋白大小在合适位置剪膜（在一抗孵育前，勿把膜完全分离），然后用TBST缓冲液将染料洗去。
（5）封闭将PVDF膜（或NC膜）置于封闭液中（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液），室温晃动1h（85rpm。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
western blot 试剂配制
试剂配制：（一）母液1，1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml2，1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
3，0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
4，0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
5，10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
6，10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
7，1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
8，0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
9，40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml37℃下溶解后，4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
10， 20％Tween20Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4℃保存。
WesternBlot配方和方法
Western Blot 配方和方法Western Blot配液：1.10% SDS 溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH O 1ml2加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH O 1ml2由于过硫胺酸会缓慢分解，最好颖配制，或隔周配制〔也可每 200 微升 EP 分装，4℃保存 4W，-20℃保存 1 月〕3.1× 电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至 1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液〔储存液〕甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH O 400ml2加水至 500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 × 转膜液 1L 配制：10 × 转膜液储存液 100ml，150ml 甲醇，加 DDH O2 750ml，PH 8.5，定容至总量 1L5.1×转膜液〔现配现用〕：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至 1000ml6.10 × TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整 PH 至 7.6 后定容至500ml 7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml温度适当调整〕〔pH6.8〕配胶：先配分别胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最终分别胶先加TEMED 混合后马上灌胶，而积层胶放4℃，等分别胶凝固后再加TEMED 混匀后灌胶。
TEMED 量加大，一般加至原来的2-3倍，依据试验当时的2ml 3ml 5ml 5ml 10% 5ml 5% 5% 8% 10% 两 15% 积 积 分 分 块 分 层 胶 层 胶 离 胶 离 胶胶 离胶超纯水1.42.1 2.3 1.9 2.8 1.1530％Acr/Bic0.3 0.4 1.3 1.7 2.5 2.539551.5mol/L1.3 1.3 0.9 1.3Tris · HCl5 〔pH8.8〕1mol/L 0.2 0.3Tris · HCl 5 75〔为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和10％SDS 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0235575 5 10%APS〔过硫胺0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 酸〕235575 5TEMED 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.002 03 03 02 03 02 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时，SDS- 有效分别范围凝胶浓度〔％〕线性分离范围〔KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分别的蛋白质分子大小选择适宜的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于 60～200kDa 的 SDS变性蛋白质分子的分别，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。
WesternBlot实验步骤
WesternBlot实验步骤Western Blot实验步骤Western Blot操作步骤：（一）蛋白样品制备选TRIZOL 法（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0g ，10.0 g ，20.0 g ，40.0 g。
4、混匀后，室温放置2min。
在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、（2）检测样品蛋白含量1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 l样品含的蛋白量。
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面Western Blot实验步骤快到所需高度时要放慢速度。
western blot 试剂配制
1 制胶材料（试剂配制）（1）浓缩胶缓冲液：称取 6 g Tris溶于40 mL双蒸水中，用l moL /L HCI调至pH 6.8，再加水稀释到100 mL的终体积，即成pH 6.8，0.5 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（2）分离胶缓冲液：称取36.6 g的Tris和48 mL l mol/L HCL混合，加水稀释至100 mL的终体积。
即成pH 8.8，3 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（3）5*SDS-PAGE缓冲液储液：称取15.1 g Tris（0.125M），94 g甘氨酸（1.25M），10 g SDS（0.5M），用蒸馏水溶解至800 mL，加水至1L，即成0.125 moL/L Tris-1.2 5 moL/L甘氨酸-0.5M SDS电泳缓冲储液，室温保存。
临用前稀释5倍。
（4）10% SDS溶液：称取l g SDS溶于10 mL双蒸水中，即成10% SDS溶液。
（5）10% 过硫酸胺：l mL双蒸水加入0.1 g过硫酸胺，宜当天配制，最多不超过一周。
（6）TEMED原溶液。
（7）(样品缓冲液)按下方配制：①pH 6.8，0.5 moL/L Tris-HCL缓冲液液8 mL；②甘油 6.4mL；③10% SDS溶液液12.8 mL；④二疏基乙醇3.2 mL；⑤0.05% 溴酚蓝1.6mL；⑥蒸馏水32 mL，混匀备用。
（8）转膜缓冲液：3 g Tris碱、1g SDS和14.48 g甘氨酸，再加200 mL甲醇，补充蒸馏水定容至1 L。
（9）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.025% NaN3溶于TBS-T缓冲液。
（10）5×TBS缓冲液：12.1 g Tris碱，40 g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调H 值至7.6后，用双蒸水定容至1 L。
（11）TBS-T漂洗液：含0.1% Tween-20的TBS。
（12）30%丙烯酞胺溶液：称取30g丙烯酞胺，溶解于100 mL双蒸水中, 即成30%丙烯酞胺溶液。
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Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml37℃下溶解后，4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4℃保存。
（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100µg/ml PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后，4℃保存。
使用时，加入PMSF至终浓度为100µg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸馏水至 2000mlG250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250： 100mg95％乙醇： 50ml磷酸： 100ml蒸馏水至 1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaClNaCl（MW58.44） 0.877g蒸馏水至100 ml高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，－20℃保存。
制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 4.85ml 3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）2.5ml －0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）－ 1.26ml10％SDS 100 µl 50 µl10%AP（过硫酸胺） 50 µl 25 µlTEMED 5 µl 5 µl加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39gSDS 0.5g溴酚蓝 0.025甘油 2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS）Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8gSDS 0.37g甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸馏水至 1000mlTBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）20％Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5gTBST 100ml溶解后4℃保存。
使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 µl（通风厨里加）SDS 2g0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml超纯水至 100ml配制时，在通风厨内进行。
4℃保存。
可重复使用1次。
显影液（5X）自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔 1.55g亚硫酸钠（无水） 22.5g碳酸钠（无水） 33.75g溴化钾 20.95g补水至 500ml配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。
4℃保存。
使用时用自来水稀释至1倍。
定影液自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g亚硫酸钠（无水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）加水定容至1000ml，室温保存抗体用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml化学发光试剂购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤：（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 µl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 µl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6、于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 µl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、用枪洗干上清后，加100 µl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0µg，2.5µg，5.0µg ，10.0µg ，20.0µg ，40.0µg。