Bacillus subtilis肌苷高产菌株选育及全合成培养基发酵生产肌苷研究
肌苷生产菌育种策略
2.肌苷的用途
1在食品方面，肌苷是5’-肌苷酸的前体,而其可用来做助 鲜剂。
2肌苷可直接透过细胞膜，进入人体细胞内，使处于低能缺 氧状态下的细胞恢复正常水平继续进行新陈代谢，并能活 化丙酮酸氧化酶类，参与人体细胞蛋白质的合成，具有激 活细胞、刺激代谢等良好作用。
肌苷生产菌育种策略
1.肌苷简介 2.肌苷的用途 3.肌苷的生产方法 4.肌苷的生物合成途径 5.肌苷合成的代谢调节机制 6.肌苷产生菌育种思路
1.肌苷
肌苷(1nosine，缩写IR)又称次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物，其 磷酸酯为肌苷酸。肌苷分子式为C10H12N405，相对分子质量268.23，其化学结 构为：
核苷磷酸化酶
肌苷
次黄嘌呤
选育核苷磷酸化酶活力微弱或丧失的突变株，使生成 的肌苷不再分解成次黄嘌呤。
6.3解除菌体自身的反馈调节
通过选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤结构类似物 如8-AG’、6-MF’、8-AX’等 (或)抗磺 胺类药物如SG’、ST’等突变株，造就 肌遗传上解除正常代谢调控的理想菌株。 这是因为一个可能途径是关建梅的结构 基因发生突变，使关键酶的调节部位不 再能和效应物结合，而活性中心部位却 不变，因此当细胞中已有大量最终产物 时仍能继续合成该产物。另—个可能途 径是调节基因发生突变，使阻遏物不再 能和效应物结合.
• 第三，将多种完整的核苷生物合成操纵子导入另—种核昔 生产菌中，构建能同时生成两种甚至多种核苷的工程菌。
Hale Waihona Puke 6.5 构建肌苷工程菌构建工程菌需要满足一下条 件 (1)具有有效的5’-核苷酸酶。 (2)将肌苷分解为次黄嘌呤的 核苷酶活降低下或丧失。 (3)解除菌体自身所受的代谢 调控。 (4)增加前体物，阻断代谢支 路。 因此，肌苷工程菌理想的生 物合成途径应右图所示。
【doc】枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验吴俊罡张秉胜刘吉华秦贵江王梅雪张红霞庚涛(大连翔大生物技术研究中心有限公司)摘要本文从生产实际出发,针对生产用菌种,通过对培养基碳源,氮源等的选择及配比的正交实验,得出最适培养基.关键词:枯草芽孢杆菌芽孢率活菌数培养基前言枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一.其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂.因其制剂是无毒,无残留,无污染的"绿色"添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业,饲料行业广泛应用,显示了巨大的社会效益和生态效益.枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力.这些特性对促进动物营养的消化吸收,提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用.现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长,芽孢形成率低,成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本.材料与方法材料菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),翔大生物技术研究中心有限公司保存.主要试剂牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,葡萄糖,淀粉,硫酸锰,葡萄糖等.主要设备P270普通摇床,303AB一3隔水式培养箱,1600倍微生物显微镜,PHS一25G型酸度计,50升高级发酵罐,电热干燥箱等.检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较.检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%菌种处理安培管菌种活化:用无菌吸管吸取0.3--0.5毫升无菌水滴入安培管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1--0.2毫升菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37℃培养36小时.菌种筛选:挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000毫升,牛肉膏6可克, 蛋白胨5克,琼脂20克,pH7.0～7.2)平皿上,37℃培养20小时左右取出,选大菌落挑到装有4.5毫升无菌水的试管中,震荡均匀后置120oC干燥箱中加热20分钟,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次.最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37℃培养箱培养l3～15 小时拿出放入4~C冰箱保存备用.筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37℃,每分钟195转的摇床上振动培养,每3小时涂片观察一次,培养36小时记录活菌数和芽孢率. 此过程重复3次.培养基选择首先选择四种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况.培养基的配制:①号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+大豆粕1%;②号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?31'+碳酸钙0.01%+大豆粕1%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%.③号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%;④号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%;以上所有各种培养基的pH均调为7.0～7.2.以上每种培基各做三瓶,装液量100毫升/500毫升三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121℃灭菌20分钟,取出备用.摇瓶种子制备:将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37℃,每分钟195转的摇床上振荡培养12小时.接种和培养:培养好的种子液以10%接种量分别接入四种不同培养基中37℃振荡培养,每隔12小时检测一次,36小时结束培养.此过程重复3 次.正交实验:我们将上述摇瓶结果相对较好的②号培养基作为基本培养基,设计了四个因素,三个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36 小时测活菌数).正交实验设计见表1(所用培养基中其它营养成分不变).表1正交实验设计简表发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比.发酵罐培养的有关条件如下:定容30升,加消泡剂3‰,用NaOH溶液调pH值到7.5～8.0(注:因为灭菌后pH约下降0.5～1.0),培养121'112灭菌20分钟,培养温度37'112,搅拌转速200转/分钟,起始气流量比1:0.5.当芽孢率达到80%以上时,发酵结束.此实验重复两次.结果和讨论菌种处理结果从菌种优化的三次结果看:经优化后在相同的培养时间内(36小时)芽孢形成率由原先的约38% 提高到约96%,活菌数也由17.7亿/毫升提高到28.6亿/毫升.菌种处理结果见图1.处理前芽孢形成率(%)菌种处理结果处理后臼活菌数(亿/毫升)摇床实验的结果摇床实验所确定的四种培养配方依据是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方,③号培养基为经验配方,②号和④号培养基配方是在①,③号培养基的基础上分别添加0.3%的淀粉和添加30.8ppm浓度的硫酸锰而成.通过本试验证明锰离子,淀粉对芽孢形成有促进作用.②号培养基配比要明显优于其它三种培养基配比,培养到36小时芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/毫升,故我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交实验.摇床实验的结果见表2.表2摇床实验的结果培养基和检测项目培养时间(小时)122436培养基①芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基②芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基③芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基④芽孢率(%)活菌数(亿魔升)个别芽孢约40约8026.2518.615.4个别芽孢约50约10027.1528.4526.2个别芽孢约50约8015.7519.112.25个别芽孢个别芽孢约2514.3619.2511.75正交实验结果表3显示了正交实验的结果.由表可见,影响因素为:MnSO4>豆粕>淀粉>葡萄糖;适宜条件为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,Mn-SO40.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,.32.国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月∞∞∞∞加0目硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.表3正交实验的结果发酵罐实验结果以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,与肉汤培养基培养的两次比较实验,结果基本稳定.采用优化培养基的培养结果比肉汤培养基有很大提高,主要体现在:①发酵周期缩短了24～26小时,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量;②最终活菌数提高了约54.7%.芽孢形成比率高,菌体死亡率较优化前低24.7%.图2显示了两种培养基两次培养结果的对比.结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,MnS040.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.(参考文献7篇略)一◆l:了||I::||l:||.一-.一一./'一■——一一'———◆..-,一t一▲v..一.一二'.一一一.～.?:::!::,6l014182226303438424648培养时间,时)注:芽孢率1,活茵数1,芽孢率2,活茵数2代表两次肉汤培养基配方发酵培养结果;芽孢率3,活茵数3,芽孢率4,活茵数4代表优化的培养基配方发酵培养结果.图2两种培养基培养结果的对比代邮:257000鲁东营IZl区河滨路东营力大王农畜产公司于勇510000广州天河广汕路高唐科技产业园廖益平我们已将你们买的书寄出,但被邮局退回了,原因是"原写地址不详",希望你们见此通知后速与《国外畜牧学——猪与禽》编辑部联系.谢谢!国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?33?∞舳∞∞∞∞加m0晕。
高产精氨酸菌株选育及发酵培养基优化
菌株 的初步 发酵 和检测产精 氨酸试 验 ， 确定 一株精 氨 酸产 量较 高的生产 菌株 ， 并对 其进行 单 因素和正交 设 计试验 ， 获得 了该高产精氨 酸菌株 的最适 发酵条 件 ， 以 期为氨基酸发酵生 产中高产菌株 的选 育提供相应 的参 考价值 和应 用意义 。
１ 材 料 与方 法
利用 阿须 贝培养 基筛选 固氮 菌的特 点 ， 阿须 贝 对 培养基进 行改 良， 使其 适合于微 生物对无 机氮源 的固 定， 从而进行必须 氨基酸 如精氨酸 的合成 。本 文利 用 改 良阿须贝培养基 筛选 出 ４种产精 氨酸菌 株 ， 其形 态 特征分别为 白色链球状菌株 、 白分散球状 菌株 、 干 金黄 色杆状菌株 、 红色球状 菌株 。通 过对 ４种产精 氨酸 粉
方面也有一定 的 作用
。近 年来 ， 随着人 们对 一 氧
化氮途径 研究 的不断深入 ， 为一氧化氮 合成前 体的 作 精氨酸在心血管 疾病 菌株并优化其发酵工艺有着重要 的意
义 一 。
醇 中结 晶的是无 水精 氨酸 。由于胍基 的存 在 ， 氨酸 精
第２ ８卷第 ４期
２ １ 年 ８月 ０１
生 物 学 杂 志
Ｊ ０ＵＲＮ Ｉ Ｏ ＡＬ ＯＦ Ｂ ＯＬ ＧＹ
Ｖｏ ． Ｎｏ． １２８ ４ Ａｕ ｇ，２ １ ０１
ｄ ｉ ０ ３ ６／．ｓ ．０ ５—１３ ．０ １０ ． ８ ｏ： ．９ ９ｊｉ ｎ２ ９ １ ｓ ７ ６ ２ １ ．４０ ８
Ｋｅ ｗｏ ｄ ：ａｇｎ ｎ ；ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｔ ｉ ｙ ｒ ｓ ｒ ｉ ｉ ｅ ｃ ｅ ｎ ｎ ｆｓ ａ ｎ；ｏ ｔ ｚ ｔ ｎ ｏ ｒ ｎａ ｉｅ ｍｅ ｉ ｍ ｒ ｐｉ ａｉ ｆｆ ｍｅ ｔｔ ｄ ｕ ｍｉ ｏ ｅ ｖ
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。
将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。
菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。
%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。
不同有机氮源对发酵法生产肌苷影响的研究
不同有机氮源对发酵法生产肌苷影响的研究何峰'李科S张晓红S陈亭亭S杨薇S项俊(1.经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北黄冈438000;2.大別山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北黄冈438000)摘要：以枯草芽孢杆菌(Baci此s s U M is)HX1026为研究对象，研究大豆蛋白胨、酵母粉、玉米浆干粉和豆粕水解液4种有机氮源对发酵法生产肌苷产量的影响。
结果表明，以豆桕水解液为有机氮源时，肌苷产量高于其他有机氮源，其中山东1号豆桕水解液摇瓶发酵肌苷产量最高，达到31.2 g/L。
在20 L发酵罐验证实验中，肌苷产量达到51.2 g/L，发酵罐中肌苷晶体的形成过程清晰可见，进一步证实山东1号是最适合Rsubti7fsH X1026发酵生产肌苷的有机氮源。
山东1号的主要技术参数如总氮含量、氨基氮含量、氨基氮/总氮比 值分别是3.22%、2.06%、0.639，可以作为肌苷发酵生产过程中选择有机氮源的标准，以确保肌苷发酵过程的稳定性。
关键词:枯草芽孢杆菌;肌苷产量;有机氮源;豆桕水解液;肌苷晶体中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071 (2018)04-0088-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.04.017 Effects o f dififerent organic nitrogen sources on the production o f inosine by fermentationHE Feng1,2, LI Ke1, ZHANG Xiaohong1, CHEN Tingting1, YA NG W ei1, XIANG Jun1,2*(l.H ubei K ey Laboratory o f E conomic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization，Huanggang 438000, China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation o fDabieMountains, Huanggang438000, China)Abstract：Using Bacillus subt^ilis HX1026 as the research object, the effects o f four organic nitrogen sources such as soybean peptone, yeast powder, corn steep liquor dry powder and soybean meal hydrolysate on the production of inosine by fermentation were investigated. The results showed that when soybean meal hydrolysate was used as organic nitrogen source, the inosine yield was higher than that of using other organic nitrogen sources, among which, the yield o f inosine by Shandong No.1 soybean meal hydrolysate shaker fermentation was the highest, reaching 31.2 g/L. In the 20 L fermenter verification experiments, the inosine yield was up to 51.2 g/L, and the formation o f inosine crystals in fermenter was clearly visible, which was further confirmed that Shandong No. 1was the most suitable organic nitrogen for the production of inosine by B. subtilis HX1026 fermentation. The main technical parameters o f Shandong No. 1such as total nitrogen, amino nitrogen, the ratio o f amino nitrogen and total nitrogen were 3.22%, 2.06%, 0.639, respectively, which could be used as the standard o f organic nitrogen source in the production process o f inosine fermentation to ensure the stability o f the inosine fermentation process.Keywords：Bacillus subtilis; inosine yield; organic nitrogen source; soybean meal hydrolysate; inosine crystals肌苷又名次黄嘌呤核苷(inosine，IR)，学名9-0-D-吠喃 核糖次黄嘌呤核苷，是一类由次黄嘌呤与核糖形成的核苷 类化合物。
发酵工艺学
发酵工艺学发酵工艺概论发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料，生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学，化学工程，基因工程，细胞工程，机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。
现代发酵工程不但生产酒精类饮料，醋酸和面包，而且生产各种食品添加剂：谷氨酸，柠檬酸，苹果酸，核苷酸，多糖等；医疗保健药物如胰岛素，干扰素，生长激素，抗生素和疫苗；农用生产资料：天然杀虫剂，细菌肥料，微生物除草剂；在化学工业上生产AA，酶，维生素和单细胞蛋白等。
Use of microorganisms：适应性强消化能力强繁殖能力强1857年，法国化学家，微生物学家巴斯德提出了著名的发酵理论“一切发酵工程都是微生物作用的结果”。
巴斯德认为：酿酒是发酵，是微生物在起作用。
酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。
可用加热的方法来杀死有害微生物，也可将纯种微生物分离出，获得所需发酵产品。
一、发酵工程（fermentation engineering）1．直接利用微生物的机能将物料加工以提供产品的过程，又称微生物工程。
在最适发酵条件下，大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。
2．发酵工业简介Fermentation Industry发酵食品Fermented Foods有机酸Organic Acids氨基酸Amino Acids核酸类物质Nucleotides酶制剂Enzymes医药工业（抗生素…）Pharmaceutical (Antibiotics…)饲料工业（单细胞蛋白) Feedstuff (eg. SCP)环境工程（废物处理）Environmental Application (Waste Treatment)其它（冶金工业…）Others (eg. Metallurgical industry)二、微生物（一）为什么要利用微生物？微生物繁殖非常迅速微生物培养易于控制微生物本身也容易改造（二）抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为什么能通过微生物发酵来生产？这与微生物的生长和代谢特点有什么关系？1、某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗生素将其他种类的微生物杀死。
一种高产肌苷菌株的选育方法[发明专利]
![一种高产肌苷菌株的选育方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f606a8910129bd64783e0912a216147916117e59.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510287834.X(22)申请日 2015.05.29C12N 13/00(2006.01)C12N 15/01(2006.01)C12N 15/03(2006.01)C12R 1/125(2006.01)(71)申请人上海瑞丰农业科技有限公司地址201106 上海市闵行区北翟路2901号申请人上海市农业科学院(72)发明人彭日荷 姚泉洪 王荣谈 田永生王丽娟 丁卫星 严培兰 王波孙斌(74)专利代理机构上海开祺知识产权代理有限公司 31114代理人费开逵 崔兆慧(54)发明名称一种高产肌苷菌株的选育方法(57)摘要本发明公开了一种高产肌苷菌株的选育方法，包括以下步骤：利用紫外光照射出发菌株，采用梯度平板法从中筛选出抗生素和磺胺胍抗性双抗菌株，对双抗菌株进行摇瓶发酵获取产肌苷能力提高的菌株；利用基因组重排方法将两种或两种以上不同抗生素抗性菌株原生质融合，筛选出多种抗生素抗性菌株，再通过摇瓶发酵筛选出高产肌苷菌株。
本发明大幅度提高了枯草芽孢杆菌肌苷产量，同时保持了菌株的优良特性。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页CN 106282155 A 2017.01.04C N 106282155A1.一种高产肌苷菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用紫外光照射出发菌株，采用梯度平板法从中筛选出抗生素和磺胺胍抗性双抗菌株，对双抗菌株进行摇瓶发酵筛选出产肌苷能力提高的菌株：将出发菌株接种到种子培养液30～45℃培养19～30h后，离心，清洗后再悬浮，取菌液和抗生素溶液等体积混合，紫外灯照射，30～45℃离心处理，之后立即用生理盐水稀释终止反应；取稀释后的菌液涂布于含有磺胺胍和抗生素溶液的营养琼脂平板上，30～45℃培养19～30h，观察不同平板上的菌落生长情况，采用梯度平板法筛选出抗生素和磺胺胍抗性双抗菌株，再经过若干轮筛选得到磺胺胍抗性提高的双抗菌株；再通过摇瓶发酵进行初筛和复筛，筛选出产肌苷能力提高的菌株，且该菌株磺胺胍抗性和肌苷产量形状的遗传表现稳定；2)选取不同的抗生素溶液，重复步骤(1)，得到产肌苷能力提高的不同抗生素抗性菌株；3)利用基因组重排方法将得到的两种或两种以上不同抗生素抗性菌株原生质融合，筛选出多种抗生素抗性菌株；再通过摇瓶发酵从多种抗生素抗性菌株中筛选出产肌苷能力提高的菌株即高产肌苷菌株。
γ-聚谷氨酸高产菌株的筛选及改良酸化植烟土壤效果研究
γ-聚谷氨酸高产菌株的筛选及改良酸化植烟土壤效果研究作者：施河丽彭五星向修志舒照鹤向必坤王雪松上官力尹忠春祁高富谭军来源：《中国烟草科学》2022年第04期摘要：為挖掘具有缓解植烟土壤酸化能力的微生物菌株，采用盆栽试验和大田试验相结合的方法，应用生物形态学和分子生物学筛选鉴定了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）高产菌株并研究其对酸化植烟土壤的改良效果。
结果表明：（1）从黄土高原干旱土壤中筛选得到一株谷氨酸非依赖型γ-PGA高产菌株副地衣芽孢杆菌285-3（Bacillus paralicheniformis）;（2）菌株285-3可有效缓解根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化，土壤pH平均提高0.3个单位以上;（3）菌株285-3配施有机肥，可显著降低酸化植烟土壤可交换酸度，对烟草青枯病的防效达到47.05%，同时提高烟叶产质量。
综上所述，副地衣芽孢杆菌285-3对酸化植烟土壤有较好的改良效果，与有机肥合用具有控病和提高烟叶产质量的作用。
关键词：酸化植烟土壤;副地衣芽孢杆菌;γ-聚谷氨酸;烟草青枯病;烟叶产质量中图分类号：S572.01文献标识码：A文章编号：1007-5119（2022）04-0015-07Screening of Poly-γ-glutamic Acid Producer and its Effect on Improving Acidified Tobacco Planting SoilSHI Heli1，PENG Wuxing1，XIANG Xiuzhi1，SHU Zhaohe1，XIANG Bikun1，WANG Xuesong1，SHANG Guanli1，YIN Zhongchun1，QI Gaofu2*，TAN Jun1*（1. Enshi Prefecture Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation，Enshi，Hubei 445000，China;2. College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）Abstract：In order to explore the microbial strains with the ability to alleviate the acidification of tobacco planting soil，a combination of biomorphology and molecular biology，pot experiment and field experiment were used to screen and identify high-yielding γ-PGA strains and study their improvement effects on acidified tobacco planting soil. The results showed that：（1）Aglutamate-independent γ-PGA producing strain Bacillus paralicheniformis 285-3 was screened from the arid soil of the Loess Plateau. （2）Strain 285-3 effectively alleviated soil acidification caused by root exudates and compound fertilizers，and increased soil pH by more than 0.3 units on average. （3）The combination of strain 285-3 and organic fertilizer significantly reduced the exchangeable acidity of acidified tobacco planting soil，and the control effect of tobacco bacterial wilt reached 47.05%，while improved the yield and quality of tobacco. In conclusion，Bacillus paralicheniformis 285-3 has a good improvement effect on acidified tobacco plating soil，and can control disease and improve yield and quality of tobacco when combined with organic fertilizer.Keywords：acidified tobacco planting soil;Bacillus paralicheniformis;γ-PGA;tobacco bacterial wilt;tobacco yield and quality土壤酸化进程的加速，既受外源氮沉降、酸沉降的影响，又受化学肥料施用、植物选择性吸收、根系呼吸及根系分泌物等影响[1]。
属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法[发明专利]
![属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/889ecdf010a6f524cdbf8558.png)
专利名称：属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法专利类型：发明专利
发明人：富永美佐,岛崎敬士,松野洁,山下穣
申请号：CN200410030235.1
申请日：20040217
公开号：CN1536072A
公开日：
20041013
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：从芽孢杆菌群中筛选出在含有6－乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长的菌株，并从获得的菌株中筛选出表现为肌苷生产能力高的一种菌株，以获得肌苷生产能力改善的芽孢杆菌。
申请人：味之素株式会社
地址：日本东京都中央区
国籍：JP
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
更多信息请下载全文后查看。
从一株肌苷产生菌选育出高产鸟苷菌株的研究
从一株肌苷产生菌选育出高产鸟苷菌株的研究
柏建新;朱晓宏;张一平;杜郭君;王红连;邓崇亮
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2003(029)005
【摘要】将一株只产肌苷的Bacillus.subtilis菌株,用物理、化学诱变剂处理,根据B.subtilis核酸代谢理论精心设计不同筛选模型,先后有序地获得不同的营养缺陷型、关联酶的缺失或回复以及抗代谢类似物的突变株,解除终产物对代谢物的抑制和阻遏,最终得到一株只产鸟苷的新菌株,其鸟苷产量超过20*#g/L.
【总页数】6页(P19-24)
【作者】柏建新;朱晓宏;张一平;杜郭君;王红连;邓崇亮
【作者单位】江苏省微生物研究所,无锡,214063;江苏省微生物研究所,无
锡,214063;江苏省微生物研究所,无锡,214063;江苏省微生物研究所,无锡,214063;
江苏省微生物研究所,无锡,214063;江苏省微生物研究所,无锡,214063
【正文语种】中文
【中图分类】TQ92
【相关文献】
1.微波等离子体溅射ansamitocin产生菌诱变选育高产菌株的研究 [J], 蒋世春;金洪顺
2.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究Ⅲ.诱变株的选育及其产酶条
件的研究 [J],
3.发酵法生产5`—肌苷酸的研究：Ⅰ.高产菌株的选育 [J], 杨志荣;曾英
4.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究──1出发菌株的筛选及产酶条件的研究 [J], 冯清平;沈剑敏;高燕
5.^（60）Coγ射线辐照选育肌苷高产菌株GMI－741的研究 [J], 邱玉棠;施庆珊;李崇;李良秋;林小平
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Bacillus subtilis肌苷高产菌株选育及全合成培养基发酵生产肌苷研究
３ｘ１０１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ２，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｄｏｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒａｔｉｏ
ａｎｄ Ｉｎｏｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｎｔ ｄｏｗｎ ｇｒａｄｕａｌｌｙ；２ｘ１０１４ ｉｏｎｓ／ｃｍ２ Ｗａｓ ｔｈｅ
ｂｅｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｉｏｎ ｄｏｓｅ
ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ，ｔｈｅ
Ｂ６７－１ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｒａｔｅ
ｙｉｅｌｄ ｏｆ
Ｂ１３－１０５，Ｂ１３－５ ａｎｄ
了最适用量分别为３０、２、０．１５ｒａｇ／１００ｍＬ时，平均产苷２．９ＷＥ。优化维生素混合组分
中各单因素配合比例增加了肌苷产量，平均产苷３．２７９／Ｌ；优化碳氮比为８时，平均产
苷４．ＯＷＬ，有效的提高了肌苷产量。
全合成培养基中限制因子Ａｄｅ和Ｔｈｉ分别为４ｒａｇ／１００ｍＬ、０．１５ｍｇ／１００ｍＬ时，有利
１５．３叽ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ
ｉｍｐｌａｎｔｉｏｎ
ｄｏｓｅ ｏｆ
１６．３％ａｎｄ
１９．９７％ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｗａｓ
河南师范大学 硕士学位论文 Bacillus subtilis肌苷高产菌株选育及全合成培养基发酵生产 肌苷研究 姓名：吴飞燕 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：刘国生 20090601
肌苷育种思路
• 写出肌苷生产菌的育种思路。 写出肌苷生产菌的育种思路。
肌苷生产菌的育种思路
因此， 由上述代谢调节机制可知， 由上述代谢调节机制可知，要大 因此，肌苷生产菌的育种思路如 下。 量积累肌苷 ， 就必须满足下 • ⒈ 出发菌株的选择（多为枯 出发菌株的选择（ 列一些条件。 列一些条件。 • ⑴ 具有有效的 5′- 核苷酸酶 。 草芽抱杆菌Bacillus 具有有效的5 核苷酸酶。 subtilis) • ⑵ 将肌苷分解为 Hx 的核苷磷 将肌苷分解为Hx Hx的核苷磷 • ⒉ 增加前体物质 （通过选 酸化酶活力低下或丧失 • ⑶ 解除菌体自身的代谢控制 。 育丧失转酮酶活力的突变株 ） 解除菌体自身的代谢控制。 • ⑷ 增加前体物 ， 切断支路代 • ⒊ 切断支路代谢 增加前体物， • ⑴ 选育Ade-菌株 ； 选育Ade 谢。 • ⑵ 选育 Xan-或 Gu-菌株 • ⑶ 选育 His-菌株 • ⑷ 选育核苷磷酸化酶弱的菌 株
• ⒋ 解除菌体自身的反馈 调节 • ⑴ 选育抗 及Gu结构类 选育抗Ad及 结构类 似物突变株 • ⑵ 选育抗 或Hx的突变 选育抗Ad或 的突变 株 • ⑶ 选育抗磺胺类药物突变 株
• 如磺胺嘧啶 、 磺胺哒嗪和 如磺胺嘧啶、 磺胺胍等抗性突变株。 磺胺胍等抗性突变株 。 由 于磺胺在细菌中阻碍叶酸 的形成， 的形成 ， 因而使之无法再 进行嘌呤的生物合成。 进行嘌呤的生物合成 。 选 育抗磺胺类药物的突变株， 育抗磺胺类药物的突变株 ， 即解除了对嘌呤生物合成 的抑制， 的抑制 ， 有利于促进肌苷 的积累。 的积累。
肌苷育种 Microsoft Word 文档
天津科技大学硕士学位论史摘要本文以代谢控制发酵理论为指导，重点研究了肌苷高产菌的选育及其发酵条件。
主要研究内容和结果如下：1．建立了发酵液中肌苷定量测定的方法——离子交换法，对其最佳分离条件进行了研究，并与纸层析法进行比较，发现该方法准确度和精确度比纸层析方法高，可用于简单条件下对肌苷发酵液中目的产物的测定。
2．以枯草芽孢杆菌TY一21为出发菌株，通过硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育出一株肌苷产生菌TX一3，其遗传标记为腺嘌呤缺陷、硫胺素缺陷、8．氮鸟嘌呤抗性和磺胺胍抗性(Ade。
+TH+8．AG。
+SG。
)。
在未经优化的摇瓶发酵条件下可产肌苷12．41dL。
3．研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TX一3摇瓶发酵生产肌苷的最佳条件。
通过均匀设计和模式识别方法分别研究了肌苷种子和发酵培养基的最佳配比。
在最佳条件下，摇瓶分批发酵产量为18．94∥L。
同时采用流加方式研究了摇瓶补料分批发酵条件，该条件下肌苷产量可达到24．79∥L。
4．利用5 L罐分批发酵数据，对发酵过程进行了代谢流分析。
基于物流平衡原理，初步进行了发酵过程的代谢流分析；结合发酵过程曲线分析了肌苷发酵全程代谢行为；应用TX一3菌株的代谢流量平衡模型计算出了肌苷发酵中后期的代谢流分布并通过MA TLAB软件线性规划得到理想代谢流分布，结’果表明尽量降低EMP途径的代谢通量有利于肌苷的合成，提高肌苷合成途径中各关键酶的活力可有效增加肌昔的生成量，减少副产物的生成和提高发酵过程溶氧水平均可增加肌苷合成代谢流。
关键词：肌苷，枯草芽孢杆菌，诱变育种，发酵，代谢流分析天津科技大学硕士学位论文AbstractAccording to the theory of metabolic control fermentation，the dissertationfocuses on the breeding and fermentation condition of inosine producing strain．The main research contents and results are as follows：(1)The method of ion exchange chromatography was defined to determinateinosine concentration quantitatively in the fermentation broth．The separationconditions of this method was optimized and compared with paperchromatography method．Both accuracy and precision are better than that of paper chromatography．(2)One inosine high—producing strain TX一3(Ade一+Thi++8一AG‘+SG’)wasderived from Bacillus subtilis TY-21 with DES treatment，which could produceinosine 12．41 g／L under the fermentation condition without being optimized．(3)The batch fermentation condition of strain TX一3 in shake flask was studiedin this dissertation．The proportions of seed medium and fermentation mediumwere optimized by pattern recognition and uniform design experiment．The seedculture conditions and fermentation conditions were also studied．Under theoptimum condition，strain TX-3 could produce inosine 18．949／L by shaking flaskbatch fermentation．Meanwhile the fed batch fermentation conditions were studied．The production of inosine under optimized fed batch fermentation was 24．799／L．(4)The metabolic flux analysis was applied in inosine fermentation processbased on the experimental data from batch fermentation in 5-liter fermentor．Basedon the flux balance principle，the metabolic flux analysis method of inosine batch fermentation was defined．The whole metabolic process of inosine was analysedcombined with fermentation process curve．Using metabolic flux balance model ofinosine synthesis by Bacillus subtilis model，the metabolic flux distributionsduring the middle and last period were determination and the optimal fluxdistributions were calculated by linear program of MATLAB software．The fluxanalysis indicated that reducing the metabolic flux of EMP pathway were useful tOlie synthesis；Increasing activities of key enzymes in inosine biosynthesis pathwaywould increase inosine production．Reducing byproduct synthesis were importantfor inosine high producing，as well as the heightening soluble oxygen level．Keywords：Inosine，Bacillus subtili．，，mutagenic breeding，fermentationmetablic flux analysis．天津科技大学硕士学位论文1．前言1．1肌苷的理他性质肌苷(1nosine，缩写IR)又称次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物，其磷酸酯为肌苷酸。
木聚糖酶高产菌株Bacillus pumilus H—101的筛选及产酶条件的研究
木聚糖酶高产菌株Bacillus pumilus H—101的筛选及产酶
条件的研究
孙迅;王宜磊
【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】1997(017)002
【摘要】从３４株细菌中筛选到一株木聚糖酶高产菌株ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＨ－１０１适宜的产酶培养基含２．０％小麦秸半纤维素、０．２％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＮＨ４ＮＯ３、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、０．０２％ＮａＣｌ，０．０２％ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ和１．０％的酵母膏。
在上述培养基中，３２℃振荡培养４８ｈ，总半纤维素酶活力达２３５．６ｕ／ｍｌ，木聚糖酶活力达１１６４．
【总页数】6页(P17-22)
【作者】孙迅;王宜磊
【作者单位】山东省菏泽高等师范专科学校生物系;山东省菏泽高等师范专科学校
生物系
【正文语种】中文
【中图分类】TQ920.1
【相关文献】
1.木聚糖酶高产菌株的筛选及产酶条件研究 [J], 刘德海;王红云;苏辉;安明理;周伏忠;王海鹰
2.木聚糖酶高产菌株的筛选及其产酶营养条件研究 [J], 赵峰;聂小琦;余丽娟;李芳;谌斌;于方明
3.耐碱性木聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件优化及其在麦草浆生物漂白中的应用[J], 包怡红;刘伟丰;毛爱军;董志扬
4.木聚糖酶高产菌株的筛选及产酶条件 [J], 沈进军;王建军;朱逸涵;张顺萍;黄志伟
5.木聚糖酶高产菌株的筛选及其产酶规律研究 [J], 徐君飞;刘正初;冯湘沅;段盛文;郑科;成莉凤;顾佳佳
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腺苷高产菌株Bacillus subtilis DI4-24退化的遗传机制与控制研究
腺苷高产菌株Bacillus subtilis DI4-24退化的遗传机制与控制研究任韶霞;刘磊;常利草;李金鑫;刘国生【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2017(47)2【摘要】The high adenosine-producing strain Bacillus subtilis DI4-24 as an artificial mutant degenerated easily during preservation,consecutive subculture and fermentation.The genetic traits of reverse mutant were analyzed to study the degeneration mechanism,and the effects of physical and chemical factors on reverse mutation were investigated to find the control method.The mutants were screened on selective medium and its genotype was analyzed by growth spectrum method.The red materials accumulated in mutation ceils were measured by spectrophotometry in order to analyze the influence factors of reverse mutation.Histidine typhimurium reverse nutation caused degeneration adenosine production declined dramatically for the reverse mutation strain.It could effectively slow down the recession by preserving culture at low temperature and reducing generations of propagation.During the process of seed preparation,reducing culture temperature by 2 ℃ ～3 ℃,shortening the culture time to 8 h,adjusting medium pH to mildly acidic (6.5),and adding substances such as carotene and folic acid in the seed culture medium could significantly reduce the reverse mutation rate.Under aboveconditions,the seed production performance was improved,and the adenosine production was increased by 9％ if compared with that of the control.%经人工诱变获得的腺苷高产菌株Bacillus subtilis DI4-24很容易发生退化,通过分析回变菌株的遗传性状和考察理化条件对回复突变的影响,研究退化的机制,找到控制的方法.在选择培养基上筛选回变菌株,生长谱法分析其遗传型;于743 nm条件下分光光度法测定回复突变细胞内积累的特有红色物质,研究各理化条件对回复突变的影响.退化原因是由于组氨酸缺陷型发生回复突变所致,突变菌株腺苷产量大幅度下降;降低保藏温度、减少传代次数可以有效地减缓菌种的衰退;种子制备过程中适当降低培养温度2℃～3℃、缩短培养时间(8 h)、降低培养基pH至中性偏酸性(6.5)以及加入胡萝卜素、叶酸等物质都可以有效降低回变率,在此条件下制备的种子生产性能得到提高,其腺苷产量可比对照提高9％.【总页数】5页(P24-28)【作者】任韶霞;刘磊;常利草;李金鑫;刘国生【作者单位】河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;功能微生物绿色转化技术河南省工程实验室;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;功能微生物绿色转化技术河南省工程实验室【正文语种】中文【相关文献】1.拮抗细菌菌株 Bacillus subtilis B5423标记菌株的筛选及其突变体的遗传多态性研究 [J], 李湘民;黄凌洪;吴强2.Bacillus siamensis和Bacillus subtilis中2个β-D-葡萄糖苷酶编码基因克隆、表达及酶学研究 [J], 陈永敢; 谷风林; 蔡莹莹; 徐飞; 朱科学3.Bacillus sphaericus DS11蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis的异源表达及酶学性质研究 [J], 柴金龙; 胡晟源; 陈丽; 王淑军; 焦豫良; 杨杰; 刘姝; 房耀维4.Bacillus subtilis转录因子CtsR蛋白中clpC操纵子结合区域的NMR研究 [J], 陈晓雯;黄碧玲;黄少华;赵玉芬5.葡甘聚糖酶高产菌株Bacillus subtilis的超剂量诱变育种 [J], 张吨;张建新;常绪路;冯军厂;郭祥瑞;贵茜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
３ｘ１０１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ２，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｄｏｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒａｔｉｏ
ａｎｄ Ｉｎｏｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｎｔ ｄｏｗｎ ｇｒａｄｕａｌｌｙ；２ｘ１０１４ ｉｏｎｓ／ｃｍ２ Ｗａｓ ｔｈｅ
ｂｅｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｉｏｎ ｄｏｓｅ
ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
Ⅱ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ旷ｉｏｎ
ＨＳＤ０６０ ａｎｄ ｔｈｅ
ｄｏｓｅｓ ｗｅｒｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ
ａｎ
ｉｎｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ａｎｔｉ－ｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＳＧＩ）ａｎｄ
ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
菌株Ｂ１３．１０５和Ｂ１３．５平均产苷分别达１８．３１９／Ｌ、１７．８５以比出发菌株Ｂ１３分别增产
２３．５％和２０．４％，比及ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨＳＤ０６０分别增产４３．６１％、４０．０％。平板法测定Ｂ１３．１０５
和Ｂ１３．５对磺胺胍抗性和阿拉伯糖利用能力，结果表明其抗性仍然保持原来水平，新获 得了ａｒａ突变标记。离子注入筛选双突变菌株的研究为肌苷菌种的改造开辟了一条新的 途径，并为进一步的选育工作在实验方法和选育条件方面奠定了工作基础。 肌苷发酵天然培养基中酵母粉和玉米浆成分复杂，无法直接设计出合理的合成培养 基配方，故将目前发酵生产所用的优化天然培养配方中的酵母粉和玉米浆成分去除，加 入维生素、碱基、氨基酸混合物，得到全合成培养基，并通过发酵试验进行合成培养基 的优化。混合氨基酸、碱基、维生素按不同的组合方式进行试验，并通过正交试验确定
晟ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＨＳＤ０６０分别增产２３．１４％和４７．７６％。平板法测定Ｂ６７．１对磺胺胍的抗性，其
最高浓度提高到了６００ｍｇ／Ｌ，ａｒａ突变标记仍然存在。Ｂ１３菌株发生ａｒａ突变均为处理强 度较高的ｌｘｌ０１６ｉｏｎｓ／ｃｍ２处理组，２ｘ１０１４ｉｏｎｓ／ｃｍ２处理组未获得ａｔａ突变子。高产双突变
ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ，ｔｈｅ
Ｂ６７－１ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｒａｔｅ
ｙｉｅｌｄ ｏｆ
Ｂ１３－１０５，Ｂ１３－５ ａｎｄ
将混合氨基酸、碱基、维生素中关键成分进行七因素三水平正交试验，当Ⅶ２为
Ｏ．０１，（６．氯嘌呤＋２，６．二氯嘌呤）２，（苯丙氨酸＋组氨酸）３５，粗次黄嘌呤０．１，ＶＨ ０．２， Ｍｎ２＋０．０１，（烟酸＋肌醇＋叶酸）０．２ ｍｇ／１００ｍＬ时，有最大产苷量。以此组合作为最终全 合成培养基配方，进行５个摇瓶重复发酵试验，平均产苷５．０４９／Ｌ，是基础培养基配方
于肌苷积累，产苷达４．２１９／Ｌ。８种必需氨基酸的添加优于８种非必需氨基酸对产苷的影 响；高浓度的苯丙氨酸可代替异亮氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸 和赖氨酸等七种氨基酸促进肌苷积累，全合成培养基中（苯丙氨酸＋组氨酸）浓度为 ５０ｍｇ／１００ｍＬ时，产苷达４．６９９／Ｌ。嘌呤的添加优于嘧啶对产苷的影响；次黄嘌呤适量添 加可作为补救途径积累肌苷，浓度为５ｒａｇ／７１００ｍＬ时，产苷达４．０７９／Ｌ。氨基酸混合液重 要成分对产苷的贡献不同。ＶＢ２浓度为０．ＯＳｍｅｄｌ００ｍＬ时，产苷４．７５９／Ｌ；（叶酸＋肌醇＋ 烟酸）浓度为Ｏ．１５ｍｇ／１００ｍＬ时，产苷４．３４９／Ｌ：ＶＨ浓度为Ｏ．１５ ｍｇ／１００ｍＬ时，产苷４．１４９／Ｌ。 作为肌苷发酵的重要调控因子之一，Ｍｎ２＋限量添加，能保证细胞膜的良好渗透性，对肌 苷发酵有促进作用，Ｍｎ２＋浓度为０．０１ｍｇ／１００ｍＬ时，产苷４．０６９／Ｌ。
ｇ／Ｌ，
比出发菌株产量分别提高了１６．３％和１９．９７％。结果表明３ｘ１０１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ２照射剂量是获得
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨＳＤ０６
ＳＧ‘突变株和产量正变株的最佳剂量，高照射剂量下ＳＧｒ突变率
下降，并且容易导致突变株肌苷产量下降；低处理剂量和较低的致死率，对于筛选阿拉 伯糖利用缺陷正变株更有效，２ｘ１０“ｉｏｎｓ／ｃｍ２左右的诱变剂量是最合适的剂量。 以菌株Ｂ１３和Ｂ６７为处理菌株材料，照射剂量分别采用２ｘ１０１４、ｌｘｌ０１６和８ｘ１０１４、 ３ｘ１０”ｉｏｎｓ／ｃｍ２，分别筛选ａｒａ突变、ＳＧ‘突变，经过复筛得到产量明显提高的双突变株 Ｂ１３．５、Ｂ１３．１０５和Ｂ６７．１。双突变株的筛选结果显示，采用离子束诱变发生ＳＧ‘突变的 频率仍然高于ａｔａ突变率。对于Ｂ６７菌株，３ｘ１０１５ｉｏｎｓ／ｏｎ２处理剂量时发生ＳＧ‘突变的频 率较高。高产双突变菌株Ｂ６７．１平均摇瓶发酵产苷达到１８．８４ ｇ／Ｌ，比出发菌株Ｂ６７和
ｐｅｒｃｅｎｔ．ｔｏ
ｔｈｅ
ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ．Ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｄｉｄ Ｂ１３—１０５ ａｎｄ Ｂ１３－５ ｓｔｉｌｌ ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｌｓｏ ｇｒｏｗ ｔｈｅ
ａｎｔｉ－ｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ｂｕｔ
ｏｎ
ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｏｓｅ ｃａｒｂｏｎ ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｗａｓ ｏｎｌｙ ａｒａｂｉ：ｎｏｓｅ．
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ａｒａ）ｍｕｔａｎｔｓ
ｗｅｒｅ
ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ
ａｎｄ
ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ ｓｃｒｅｅｎｅｄ，ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ
Ｂ１３（ＳＧ。）ａｎｄ Ｂ６７（ａｒａ）ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．
ａｎｄ
Ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅｍ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ １４．８３９／Ｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ
ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＧｒ ｗａｓ ３ｘ１０１５
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ａｒａ．Ｔｏ ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔ
Ｂ６７，ｗｈｅｎ ｔｈｅ
ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ｄｏｓｅ Ｗａｓ ａｔ
ｉｏｎｓ・ｃｍ－２，ＳＧ‘ｈａｄ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｒ
ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ．Ｈｉｇｈ．ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ．Ｓｈａｋｅ
ｍｕｔａｎｔｓ ｒｅｐｅａｔｅｄ
ｔｈｅｉｒ
ｗｅｒｅ ａｌｌ ｆｒｏｍ
ｈｉｇｈｅｒ ｈｉｇｈ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｔｗｏ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ Ｂ１３・１０５ ａｎｄ Ｂ１３－５ ｗｅｒｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ １８．３１９／Ｌ ａｎｄ ｉｎ
１７．８５９化
ａｖｅｒａｇｅ
ｙｉｅｌｄ
ｏｆ ｉｎｏｓｉｎｅ
ｍｉｘｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ
ｖｉｔａｍｉｎ
Ｃ／Ｎ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｉｎｏｓｉｎｅ
Ａｓ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ
ｔｏ
３．２７９／Ｌ ａｎｄ ４．０２９／Ｌ． ｆｏｒ ｉｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ
ｒｏｕｔｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｏｓｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ａ
ａｎｄ ａｎｄ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．
ｃｏｒｎ
ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｉｎｏｓｉｎｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｓｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ＨＩ
ｄｉｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ，ｂａｓｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎｓｔｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｅａｓｔ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ．Ｔｈｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｂａｓｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｗａｙ ｏｆ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ａ
ｈｉｇｈ
Ｉｎｏｓｉｎｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ
ｂｙⅣｉｏｎ
ｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｗａｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｅａｎｓ Ａｓ ｆｏｒ ｙｅａｓｔ
ｄｏａｂｌｅ，ｗｈｉｃｈ ｉｎａｕｇｕｒａｔｅｄ
产苷量（ｏ．４５ ｇ／Ｌ）的５．４倍。研究结果表明用已知维生素、碱基、氨基酸混合物取代发酵
培养基中酵母粉和玉米浆，通过培养基优化，确定合成培养基中每一种已知成分的用量 和比例，实现对肌苷发酵和精确控制，充分发挥高产菌株的生产能力，能大幅度提高肌 苷发酵产量。
关键词：肌苷发酵，磺胺胍抗性，阿拉伯糖利用缺陷，全合成培养基，离子束注入
ｔｈｅ ｓｈａｋｅ
ｆｌａｓｋ ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｔｏ
Ｂ１３，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨＳＤ０６０ Ｂ６７ ｗｅｒｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ Ｂ６７－１ ｓｔｒａｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
４７
ｂｙ
２３．５％，２０．４％ａｎｄ ４３．６１％，４０．０％ｍａｘｉｍｕｍ
ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｕｔａｎｔｓ，ｌｏｗ ｄｏｓｅ ａｎｄ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．
Ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｂ１３ ａｎｄ
ｓｃｒｅｅｎ
Ｂ６７ ｗｅｒｅ ｄｅａｌｔ ｂｙ
２×１０１４，Ｉｘｌ０１６ａｎｄ
８ｘ１０“，３ｘ１０１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ２ Ｎ＋ｉｏｎ ｄｏｓｅｓ ｔｏ
１５．３叽ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ
ｉｍｐｌａｎｔｉｏｎ