PCR技术及其应用(医学分子生物学)课件
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pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
PCR技术及其医学应用(精)
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成 任何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据 产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。
⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过 70 ％。 ⑧如扩增编码区域，引物 3‘ 端不要终止于 密码子的第３位。 目前，国内外已有许多专门用于引 物设计的计算机程序，简化了引物的设 计过程。
三、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称。 在 PCR 循环中，高浓度的 dNTP 可加快反应速 度， 但增加了碱基的错误掺入率和实验成本； 反之，低浓度的 dNTP 会导致反应速度下降， 但可提高实验的精确性。
四、PCR反应缓冲液
用于PCR反应的缓冲液一般都有 Tris-clPH8.38.8) Kcl、NH42SO4, Mgcl2，明胶和甲酰胺。 其中以Mg2+最为关键，它是TaqDNA 聚合酶 所必需的， Mg2+ 浓度可影响酶活性与精确度， 以及产物的特异性等。 Mg2+ 浓度过低时，酶 活力显著降低；过高时则酶催化非特异性扩增。
五、模板DNA PCR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体 外扩增. 核酸标本来源广泛. 注意核酸标本中不要含DNA聚合酶抑制剂。
六、PCR循环数
其它参数选定后，PCR循环次数主要取决于模 板 DNA 的浓度。理论上说 25 次循环后， PCR 产物的积累即达最大值。实际操作中由于每步 反应不可能达 100 ％效率，一般按 75 ％计算， 30次是比较合理的循环次数。
Primers 引物
• PCR primers：about 18 to 30 nt long and with similar G+C contents. • Tm=2(a+t)+4(g+c): determine annealing temperature. If the primer is 18-30 nt, annealing temperature can be Tm5oC
PCR技术的原理和应用
脱氧核苷酸（dNTPs） 反应缓冲体系(reaction buffer)
dATP Primer
PCR促进剂
Taq DNA聚合酶
PCR反应的特点
• 灵敏度高 • 快捷 • 简便 • 对样品纯度要求低 • 可以相对定量
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
PCR原理与特点
PCR: Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
• 一种选择性体外扩增DNA片断的技术 • 广泛应用于生物医学的研究中 • 是分子生物学的主流技术，是所有扩增技术中
应用范围最广的一种技术。
PCR原理与特点
PCR反应过程
1.变性(denature)
加热使双链DNA变成单链DNA
PCR循环
第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制
PCR循环
PCR循环
PCR循环次数与DNA产量关系
循环次数
1
21
2
22
3
23
10 210
20 220
30 230
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
logYn logYn
琼脂糖凝胶电泳图
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
主要PCR类型
1.常规PCR 2.荧光定量PCR 3.原位PCR 4.RT－PCR 5.多重PCR 6.PCR－SSO 和 PCR－SSP
PCR技术的原理及其应用
3
生物制药质量控制
PCR技术可用于生物制药过程中的质量控制，如 检测产品中特定基因序列的存在和表达情况。
06
PCR技术挑战与发展 趋势
灵敏度、特异性及通量提升
灵敏度提升
通过优化反应体系、提高引物设计和使用高效的DNA聚合 酶等手段，可以降低PCR检测的限度，提高灵敏度。
特异性增强
采用更严格的引物设计、使用热启动PCR、增加退火温度 等方法可以减少非特异性扩增，提高PCR的特异性。
应用
实时荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、SNP分型等领域，具有灵敏度高、特异性 强、可定量等优点。
逆转录PCR
原理
逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA逆转录成cDNA，再进行PCR扩增的方法。该技术结合了RNA提取、逆转 录和PCR扩增三个步骤，可用于检测细胞中特定基因的表达情况。
DNA复制特点
DNA复制具有半保留复制、边解旋边复制以及需要引物等特 点。
引物设计与合成
引物设计原则
引物是PCR扩增的关键因素之一 ，设计时需要遵循一定的原则， 如长度适中、GC含量合理、避免 引物二聚体形成等。
引物合成方法
引物可以通过化学合成或生物合 成的方法获得，其中化学合成方 法更为常用，包括固相亚磷酰胺 法和液相合成法。
应用
逆转录PCR广泛应用于基因表达分析、病毒检测、RNA编辑等领域。通过比较不同样本或不同处理条件下的基因 表达差异，可以揭示生物学过程中的调控机制。
其他PCR变种技术
要点一
原理
除了上述常规PCR技术外，还有许多其他PCR变种技术， 如多重PCR、不对称PCR、热启动PCR等。这些技术通过 改进PCR反应条件或引入新的策略，提高了PCR的特异性 、灵敏度和通用性。
PCR技术及其应用ppt课件
2）循环参数
(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链
94℃， 30-60秒 (2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计：
Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2
（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
精品ppt
B.阴性对照
19
C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达 水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量。
25
二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含0.3Kb插入片段的克PCR管
琼脂糖凝胶电泳设备
3、试剂：10XPCR 反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP
10μmol/L 引物1和引物2
精品ppt
26
PCR技术原理及其应用ppt课件
（4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
39
PCR产物的积累规律示意图
40
五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
41
③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
39
PCR产物的积累规律示意图
40
五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
41
③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
PCR技术的应用ppt课件
PCR技术的应用
.
1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
.
二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
.
1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
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二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
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5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR及相关技术PPT课件
DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量；
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
2020/7/28
9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
2020/7/28
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
2020/7/28
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3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
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pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
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6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
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PCR仪
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17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
PCR 技术及应用ppt课件
个体识别与亲子鉴定 GMO
学习交流PPT
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PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
学习交流PPT
33
RT-PCR图解
学习交流PPT
34
• 三、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR)
•
该法的基本原理是在基因未知序列端添加同
聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用
人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，
在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。
学习交流PPT
35
四、反向PCR (inverse PCR, IPCR)
学习交流PPT
18
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
• 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
• 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩 增条带。
• 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
基因工程-7章PCR技术及其应用
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定的基因片段，并将其克 隆到载体中，实现基因的克隆和扩增 。
基因鉴定
利用PCR技术，可以对特定基因进行 鉴定，如亲子鉴定、物种鉴定等。通 过比对基因序列的差异，可以确定个 体或物种的遗传特征。
基因突变检测
点突变检测
PCR技术可以用于检测基因中的点突变，如单核苷酸多态性 （SNP）。通过设计特异引物，能够准确地检测出基因序列中 的单个碱基变异。
个性化医疗与精准医学
精准诊断
基于个体基因组信息，PCR技术可以为患者提供更精准的诊断，有助于早期发现和干预疾病。
预后评估
通过检测特定基因的表达水平或突变情况，可以评估疾病的预后和治疗效果，为患者制定更合理的治疗方案。
07 pcr技术的伦理与法规问 题
技术伦理问题
隐私权问题
PCR技术能够检测个体的基因信息，可能侵犯 个人隐私。
将更加广泛，如病原体检测、肿瘤基因检测等。
03
pcr技术在生物科学研究中的应用
未来pcr技术将继续在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域发挥重
要作用，为生物科学研究提供更多工具和手段。
06 pcr技术在医学领域的应 用
疾病诊断与预防
疾病诊断
PCR技术可以快速、准确地检测出特定 的基因片段，用于诊断遗传病、传染病 等疾病。例如，利用PCR技术检测病毒 DNA或RNA，可确诊病毒感染。
基因工程发展历程
从最早的基因克隆技术到现在的基因编辑技术，基因 工程经历了巨大的发展。
基因工程的应用
基因工程在医学、农业、工业等领域有着广泛的应用。
pcr技术概述
pcr技术定义
PCR技术是一种通过加热和冷却 循环来扩增特定DNA片段的技术。
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定的基因片段，并将其克 隆到载体中，实现基因的克隆和扩增 。
基因鉴定
利用PCR技术，可以对特定基因进行 鉴定，如亲子鉴定、物种鉴定等。通 过比对基因序列的差异，可以确定个 体或物种的遗传特征。
基因突变检测
点突变检测
PCR技术可以用于检测基因中的点突变，如单核苷酸多态性 （SNP）。通过设计特异引物，能够准确地检测出基因序列中 的单个碱基变异。
个性化医疗与精准医学
精准诊断
基于个体基因组信息，PCR技术可以为患者提供更精准的诊断，有助于早期发现和干预疾病。
预后评估
通过检测特定基因的表达水平或突变情况，可以评估疾病的预后和治疗效果，为患者制定更合理的治疗方案。
07 pcr技术的伦理与法规问 题
技术伦理问题
隐私权问题
PCR技术能够检测个体的基因信息，可能侵犯 个人隐私。
将更加广泛，如病原体检测、肿瘤基因检测等。
03
pcr技术在生物科学研究中的应用
未来pcr技术将继续在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域发挥重
要作用，为生物科学研究提供更多工具和手段。
06 pcr技术在医学领域的应 用
疾病诊断与预防
疾病诊断
PCR技术可以快速、准确地检测出特定 的基因片段，用于诊断遗传病、传染病 等疾病。例如，利用PCR技术检测病毒 DNA或RNA，可确诊病毒感染。
基因工程发展历程
从最早的基因克隆技术到现在的基因编辑技术，基因 工程经历了巨大的发展。
基因工程的应用
基因工程在医学、农业、工业等领域有着广泛的应用。
pcr技术概述
pcr技术定义
PCR技术是一种通过加热和冷却 循环来扩增特定DNA片段的技术。
《PCR临床应用》课件
案例二：遗传疾病的pcr诊断
总结词
早期诊断、准确率高
详细描述
PCR技术在遗传性疾病的诊断中具有重要作用。通过对特定基因的扩增和检测，可以在早期发现遗传 性疾病的存在，提高诊断的准确率，为患者及早接受治疗提供依据。
案例三：肿瘤标志物的pcr检测
总结词
灵敏度极高、有助于肿瘤早期发现
详细描述
PCR技术可以用于检测肿瘤标志物，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等。通过对肿瘤标志物的扩增和检测，可以灵敏地发现肿瘤 的存在，有助于肿瘤的早期发现和治疗。
对样品质量要求高
对于某些降解严重或质量差的 样品，PCR可能无法获得理想
的结果。
PCR技术的前景展望
新技术的发展
个性化医疗
随着新技术如数字PCR、实时荧光定量PCR 等的出现，PCR技术的应用将更加广泛和精 确。
随着基因组学的发展，PCR技术有望在个性 化医疗领域发挥重要作用，为患者提供更 加精准的治疗方案。
特点
高灵敏度、高特异性、高扩增效率。
PCR技术原理
双链DNA在高温下解旋为单链，引物与单链DNA模板结合，在DNA聚合酶的作 用下，按照碱基互补配对原则合成新的DNA链。
通过多次循环，使目的DNA片段在短时间内获得极大程度的扩增。
PCR技术的发展历程
1971年
1985年
1988年
1993年
Kary Mullis发现Taq酶 。
PCR技术具有很好的可重复性 ，实验结果稳定可靠。
PCR技术的局限性
成本高
PCR技术需要特定的仪器和试 剂，成本较高，对于一些资源
有限的地方可能难以普及。
易污染
PCR技术对实验操作要求高， 如果操作不慎，容易造成交叉 污染，影响实验结果。
PCR技术及其应用ppt课件
5’-primer: stem-loop structure with high melting temperature
最新版整理ppt
12
Primer Design: avoid failure of amplification High difference between product and primer melting temperatures.
最新版整理ppt
19
Frequently used PCR methods Real-Time PCR (quantitative PCR)
Detect fluorescence for each cycle Quantitaive by amplification curve Quanlity control
最新版整理pptmp; stages
Initialization step Denaturation step
20~40 Cycles
Annealing step
Elongation step
Final elongation
Final hold
最新版整理ppt
Exponential amplification Leveling off stage Plateau
医学分子细胞生物学研究方法
PCR技术在医学中的应用
最新版整理ppt
1
What is PCR Why do PCR How to PCR
最新版整理ppt
2
polymerase chain reaction (PCR)
Developed in 1983 by Kary Mullis
最新版整理19pp9t 3年的诺贝尔化学奖
PCR 技术及应用ppt课件
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2
PCR反应基本原理
Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow 片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进行DNA变 性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一次酶，扩 增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年，Saiki把一种 耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR后，PCR技术 的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司推出了第一台 PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR技术在微 生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中的应用越来越 广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的种类已超过100 多种。
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12
PCR原理
• 3变性
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13
PCR原理
• 3复性
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14
PCR原理
• 3延伸
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15
DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。
循环数 ０
１
２
３
４
５
６
７
总片段（单链） ２
４
８
16
32
64
16
PCR条件的选择
• 进行PCR反应必须具备以下几个条件： • .模板DNA • .人工合成的寡核苷酸引物 • .合适的缓冲体系 • .镁离子 • .4种脱氧核糖核苷三磷酸 • .耐热DNA聚合酶 • .温度及循环参数
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17
PCR条件的选择
• 模板DNA：PCR反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外 扩增，模板DNA的来源及其制备的效率对PCR扩增有重要的 影响。临床检测用模板DNA来源必须根据检测的病原体不同 选择最适部位，以取材方便，待测病原体含量高为原则。
PCR技术的原理及其应用ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
最新课件
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
最新课件
3
1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
最新课件
14
锚定PCR原理示意图
最新课件
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
最新课件
16
不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
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9
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
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3
1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
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14
锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
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不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
分子生物学PCR技术课件
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
14
引物设计基本原则
引物的长度
典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内 引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列 存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上 限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长， 因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶 的最适温度。
4
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
2020/4/17
25
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高 会导致反应的非特异性增加。
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
26
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下 降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
的粗提DNA
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
12
3. PCR反应体系和反应条件
• 反应体系： （五要素）
– 模板（template）
• DNA
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最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热， 使这一过程耗时，费力，且易出错
耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行，随后 PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
目录
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
DNA聚合酶活性
5 核酸外切酶活性
• Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
目录
94℃
55℃
37℃
变性
退火
延伸
目录
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
the double strand DNA open to single stranded DNA
Renaturation：复性
two single stranded DNA form double strand DNA
Semiconservative replication：半保留复制
replication, one make two
目录
Semi-conservative replication
Old
new
DNA的复制 以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原 料，按照碱基互补配对的原则，合成子代DNA 的过程。
目录
复习
5’ 3’
解旋酶类 DNA聚合酶
dNTP
引物
体内DNA的复制
目录
体系组成
模板DNA、DDDP、dNTP、SSB 引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶
它最大的特点就是能不断推出新形式。
——摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
解旋酶解链酶
5’
子链延长
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 3’
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5‘
RNA引物 RNA引物
合成引物
子链延长
5 ‘ 引物酶 AUCGCG 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
目录
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana及其同事提出：经 过 DNA 变性，与合适引物杂交 ，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该 过程便可克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以 及 70 年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana等 的早期设想被人们遗忘了……
40
20
40 50 60 70 80 90 100
Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用 热变性解链DNA模板可行。
目录
(%)
温度(℃)
此酶具有以下特点：
①耐高温； ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再 加新酶，便于自动化； ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩 增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 此酶的发现使PCR得以广泛应用。
目录
一、PCR的基本原理
The polymerase chain reaction is used to amplify a segment of DNA that lies between two regions of known sequence.目录T源自e concepts of PCR
Denaturation: 变性
1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名 为当年的风云分子 (Molecule of the year)
目录
94℃
55℃
72℃
PCR循环
目录
“I do my best thinking while driving”
1993 Nobel prize
目录
本章要讲述的主要内容： 一、PCR的基本原理 二、PCR的体系组成 三、PCR的实施 四、PCR的结果分析及条件优化 五、PCR的类型与应用 六、PCR的相关仪器介绍
PCR技术及其应用
PCR: Polymerase chain reaction 聚合酶链反应，亦称DNA的体外 扩增技术。
目录
PCR ?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利〃穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念 变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术， 后者又上升成为新的概念。 …
目录
Kary B. Mullis（1944－）
目录
引物
DNA聚合酶
Mullis的 构思
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
目录
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶 链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
5’
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 3’ 5‘
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’
5‘
DNA 聚合酶
合成引物
子链延长
3’
AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
1988年Saiki 等从温 泉（ Hot spring）中分 离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
目录
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60