双向电泳
双向电泳技术.
溶的目标：
1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液
（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个 多肽的点的强度会下降）
2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、 脂类、 多糖和核酸等物质的去除
3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解 状态
大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 （two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ，是等电聚焦电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI 分离），然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小）， 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋 白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品处理
一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一 步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法 是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失；
4、蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或80度分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。
5、通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗 粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。
6、为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后不要 加热蛋白质样品。当样品中含有尿素时绝 对不要超过37度，升高温度会使尿素水解 成异氰酸盐，使蛋白发生氨甲酰化修饰。
双向电泳的基本原理与流程示意
两性电解质
样品
pH 9 -
等点聚焦 (第一向)
聚丙烯酰胺
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向凝胶电泳技术.
制备原则：
由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种应用在生物和化学实验中的分子电泳技术，它能够将完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
一、双向电泳的概念双向电泳是一种分子技术，它能够将分子分开并且分离出它们内部的活性组分。
利用电泳技术，可以把一些我们有利用价值的分子聚集到集簇中，把其它不要的环境分子分离出去。
通常情况下，电泳是通过具有某种特殊电势的电流来将分子分离的。
由于双向电泳技术，可以利用液相层析原理，将不同的分子聚集到不同的集簇中，从而把其它的不需要的或者有害的分子挤出去。
二、双向电泳的原理双向电泳的原理是利用电流来将分子进行分离，因此在实践过程中，首先需要构建一个体系，在该体系中，利用某种特殊的电流，生成一种能够将分子分解的条件。
首先，将样品加入到某种带有类似电流的环境中，当样品中的分子接触到了这种带有电流的环境，就会形成一种吸引力，从而使分子受到电流的作用，接着分子中的活性组分也会朝着电流的方向而移动。
而由于这种电流的作用，活性组分会被吸引到这种电流的反方向，使得活性组分能够从样品中分离出来，这就是双向电泳的原理。
三、双向电泳的应用双向电泳技术在生物和化学实验中都有广泛的应用，在蛋白质纯化实验、肽段分离实验等实验中，都可以利用双向电泳技术实现分子的精确分离。
此外，双向电泳技术在疾病的早期筛查中也可以发挥着重要的作用，比如癌症的筛查，可以利用双向电泳技术来检测出肿瘤细胞中的活性组分，为早期筛查提供重要的依据。
四、双向电泳的优势双向电泳技术有着诸多优势，首先，双向电泳技术具有准确性高的优势，可以把不同组分的分子成功地分离出来；其次，双向电泳技术操作简单，可以节省大量的实验时间；最后，双向电泳技术可以把活性分子完美的纯净，大大提高了实验的效率。
总之，双向电泳是一种广泛应用的分子技术，它能够把完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
双向电泳技术实用性强，可以应用在生物和化学试验中，为后续实验提供重要的依据和有效的结果。
第七章 双向电泳
3.等电聚焦
等电聚焦的方法如上一章。由于双向电泳用的第 一向凝胶和样品中含有尿素和去污剂，聚焦时的温度 应稍高于通常用的温度，如15-20℃，以防止尿素结 晶。如在凝胶上覆盖一层膜，也可防治尿素结晶，并 克服二氧化碳的影响。由于尿素使蛋白变性，会增加 蛋白质的分子直径。鉴于以上一些原因，应适当的降 低电压和增加聚焦时间。
注：
① 根据样品溶解的需要，尿素浓度可增加至9-9.8mol/L。 ② 可用Triton X-100、 NP-40等非离子或两性离子去污剂代替CHAPS. ③ DTT必须在使用前加. ④ 裂解液最好在使用前配置，如有多余应分装，在-20℃保存。 ⑥ PMSF可替代
Bioinformatics, 2008-2009, Shanxi Agricultural University
2. IPG凝胶干胶条的再水化（泡胀）
为了样品等电聚焦的需要，作为双向电泳第一向的固相PH梯 度凝胶条中必须含尿素，去污剂，还原剂，载体两性电解质等， 不能长期保存，所以干胶条必须用含有这些成分的水化溶液重新 泡胀。
将在-20℃保存的IPG干胶条在室温下平衡一段时间后，用新 鲜配置的泡胀液重新在模具中泡胀过夜。
Bioinformatics, 2008-2009, Shanxi Agricultural University
IPG4-7
IPG4-7
IPG5-6
From Görg
IPG5.5-6.7
Bioinformatics, 2008-2009, Shanxi Agricultural University
Bioinformatics, 2008-2009, Shanxi Agricultural University
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
双向电泳
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
双向电泳资料
双向电泳资料蛋⽩质双相电泳系统⼀. 样品制备1、型号：MicroRotorfor Cell⽣产⼚家：Bio-Rad (美国伯乐公司)除传统的层析⽅法，等电点分离⽅法等样品提取⽅法外，Bio-Rad提供了独特的样品序列抽提⽅案，提⾼了样品处理的灵敏度和分辨率。
⽤途：根据等电聚焦原理对蛋⽩质进⾏纯化，达到样品的去污染、粗分和浓缩。
技术指标分离组分10聚焦槽内径r 13mm样品体积 2.3-2.5ml组分体积200-250ul上样量微克⾄毫克冷却内置式半导体冷却系统2. 电源主要技术参数型号：PowerPac Hv1. 电压:20-5,000V2. 电流:0.01-500mA3. 功率:1-400W4. 输出: 4对电源输出,可同时运⾏4个电泳槽5. 输出⽅式:恒压,恒流⽅式或恒功率,可编程6. 定时:1min-99hr,59min7. 暂停功能:有8. 操作条件:0-40度,湿度0-95%,⽆冷凝⽔9. 安全标准:EN61010,EC10. 安全性能:经空载检测,突变负载检测,超载/短路保护,输⼊线保护,断电保护测试.11. 可编程⽅法:储存9个⽅法,每个最多9个步骤.⼆．第⼀向电泳⼀维等电聚焦系统及⼲胶条型号：Protean IEF Cell⽣产⼚家：Bio-Rad （美国伯乐公司）Protean IEF系统是⼀体化的⼀维等电聚焦系统，它提供了10000V的⾼电压，以及10-25度的精确温控。
同时，IEF可同时容纳12根11，17，18，24cm的胶条,保证了实验的⾼通量。
对于实验室经常进⾏的7cm的预实验（摸索条件等），它可提供每次跑24根胶的⾼通量。
我们提供了不同尺⼨不同的pH值梯度的IPG（immobilized pH gradient）⼲胶条。
从尺⼨分有7，11，17，18cm⼲胶条，并即将推出24cm⼲胶条；从pH值梯度分，有宽梯度：3-10线性，3-10⾮线性；有窄梯度：3-6，4-7，5-8，7-10；有微梯度：3.9-5.1,4.7-5.9,5.5-6.7,6.3-8.3。
双向电泳仪使用注意事项
双向电泳仪使用注意事项双向电泳仪是一种常用的实验仪器，广泛应用于蛋白质分析、基因测序等领域。
正确使用双向电泳仪能够提高实验结果的准确性和可靠性。
下面将介绍一些双向电泳仪的使用注意事项，以帮助读者更好地操作该仪器。
1. 仪器检查和准备在使用双向电泳仪之前，需要进行仪器的检查和准备工作。
首先，确保仪器的电源和连接线路正常无损，并检查仪器的各个部件是否完好。
接下来，检查电泳槽中的缓冲液是否充足，并根据实验需要进行调整。
此外，还需要检查电泳槽的温度控制系统是否正常工作，以及电泳槽内的电极是否安装正确。
只有在仪器检查和准备工作完成后，才能进行实验操作。
2. 样品处理和加载在进行双向电泳实验之前，需要对样品进行处理和加载。
首先，将待测样品进行蛋白质提取或基因提取，并根据实验目的选择相应的电泳胶进行凝胶制备。
凝胶制备完成后，将样品加载到凝胶的适当位置上。
在加载样品之前，可以在凝胶的加载点处加入一定量的标记染料，以便观察电泳进程和结果。
3. 电泳条件设置在进行双向电泳实验时，需要合理设置电泳条件。
首先，根据样品的性质和实验目的选择合适的电泳缓冲液和电泳温度。
然后，根据凝胶的大小和样品的数量设置电场强度和运行时间。
通常情况下，电泳开始时先采用较低的电场强度进行预运行，然后逐渐增加电场强度进行正式运行。
在整个电泳过程中，需要注意保持电场强度和温度的稳定，以确保实验结果的可重复性和准确性。
4. 实验记录和数据分析在进行双向电泳实验时，需要及时记录实验过程和观察结果。
记录的内容包括实验日期、样品名称、电泳条件、实验操作等。
同时，还需要记录凝胶的电泳进程和结果，包括蛋白质或基因的迁移位置和带状图案。
实验记录的完整和准确对于后续的数据分析和结果解释至关重要。
5. 仪器维护和清洁在使用双向电泳仪之后，需要进行仪器的维护和清洁工作。
首先，及时清除电泳槽内的残留凝胶和缓冲液，避免其对仪器产生腐蚀和污染。
其次，对仪器的电极进行清洗和消毒，以保持其表面的洁净。
双向电泳的技术
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③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一 层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用， 但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大， 很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦， 分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔 径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及 检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
8
������
另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分 为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。������ 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定 量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连 续pH电泳。
9
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质的电泳方法。
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浓缩效应
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象及解决办法
1.凝胶未聚合
2.未加水层时凝胶聚合
3.电泳后未能检测出样品 4.样品分离区带宽或拖尾 5.只显一条区带 6.分离区带呈条纹状
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第二节 蛋白质等电聚焦电泳
1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电 解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋 白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位置上， 从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性 好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性 的蛋白。
双向电泳
对重组表达蛋白的初步鉴定 将一维电泳和生物质谱相结合，达到对较简 单蛋白复合物的分离和鉴定
一维电泳在蛋白质组研究中的 应用举例
我们将一维电泳和LC-Ms/MS结合，成功进行如
下研究：
(1)血浆蛋白质组研究
(2)SARS病毒蛋白的分析鉴定,成功鉴定了SARS病
毒的S蛋白、N蛋白和E蛋白，有力推动了我国第
离，去除干扰。此外，也证明该系统对脂多糖和
脂寡糖混合物的分离有效。
12%胶常用的低分子量标准蛋白
名称 磷酸化酶B 牛血清白蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 溶菌酶 来源 兔肌肉 牛 鸡蛋清 牛 大豆 鸡蛋清 分子量 97400 66200 45000 31000 21500 14400
一维凝胶染色
Initially solubilized in 0.5-1% SDS,followed by dilution with at least an eight excess of 2-4% (w/v) NP40, Triton X-100, or CHAPS to reduce the final concentration to <0.25%. This dilution displaces the SDS from the proteins and replaces it with a nonionic or zwitterionic detergent.
对于脂蛋白，膜蛋白的分析， 可以用如下的蛋白质裂解液： 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris base, 65 mMDTE
Presulubilization of protein in (boiling) SDS buffer, followed by dilution with urea lysis buffer.
简述双向电泳的原理
简述双向电泳的原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：双向电泳是一种分离蛋白质或核酸的方法，其原理基于电泳技术。
电泳是一种根据带电粒子在电场中的迁移速度不同而实现分离的方法，双向电泳则是在两个方向上施加电场，使样品能够在水平和垂直方向上进行迁移，以实现更加高效的分离。
双向电泳的原理主要包括以下几个方面：2. 分子大小和电荷：蛋白质或核酸的迁移速度取决于其大小和电荷。
较小的分子会更快地迁移，而带有更多负电荷的分子会受到更大的排斥力，迁移速度更快。
3. 凝胶介质的选择：凝胶是双向电泳中的分离载体，其选择对于分离效果至关重要。
凝胶的孔隙结构和导电性会影响样品的迁移速度和分离效率，因此需要根据样品的特性选择合适的凝胶介质。
4. 蛋白质或核酸的分子量和异质性：在双向电泳中，样品中存在不同分子量和异质性的蛋白质或核酸，这些成分会在电泳过程中以不同速度迁移，最终实现分离。
双向电泳技术的发展为蛋白质组学和基因组学研究提供了重要手段，能够有效实现不同类型的蛋白质或核酸的分离与鉴定。
通过结合其他分析技术，如质谱或序列测定，可以更全面地了解生物样品的组成和功能。
双向电泳在疾病诊断、药物研发和生物学研究等领域具有广泛的应用前景，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具之一。
第二篇示例：双向电泳是一种常用的分离和分析生物分子的方法，它结合了水平电泳和垂直电泳的优点，能够在同一实验中同时进行两个方向上的电泳，从而达到更高的分辨率和更全面的信息提取。
双向电泳的原理基于生物分子在电场中的迁移速度与其电荷量、大小和形状有关。
在双向电泳中，通常先将样品加载在一维电泳胶中，然后将电泳胶直立放置，施加一个水平电场使样品向两侧扩散，形成一个均匀扩散的带状样品。
接下来，在垂直方向上施加另一个电场，使生物分子根据其电荷量、大小和形状不同而向上或向下迁移，从而实现在两个方向上的电泳。
双向电泳需要结合两个方向上的电场来进行，这样可以使得样品在两个维度上都得到分离，从而获得更加准确和直观的结果。
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6）第二向凝胶储备液（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1）：取29g丙烯
酰胺溶于双蒸水后加入1g甲叉双丙烯酰胺，待溶解完全后定容至100ml，置于 棕色瓶内于4℃冰箱保存。
7）分离胶缓冲液（1.5mol Tris-HCI，pH8.8）：取0.86gTris，溶于
400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到8.8，最后定容至500ml。 8）浓缩胶缓冲液（1.0mol Tris-HCI，pH6.8）：取0.56gTris，溶于
(2) 装管和聚合
将废弃的50ml塑料离心管制成7-9cm的圆筒，封住圆筒的一端并垂直放在
一玻璃板上，把制胶玻璃管用橡皮筋扎好，垂直放于圆筒内，在将配制好的 凝胶（按制胶玻璃管所需用量）加入圆筒内，用注射器漫漫向圆筒注入蒸馏 水，直至制胶玻璃管的凝胶达到所需位置(一般为9cm)。用微量注射器缓慢 地在凝胶表面加上70-100l 8M尿素溶液以隔绝空气。静置约1小时，让凝胶
种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋
白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的二硫键，促使 蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS
充分结合。
2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向
IEF-PAGE，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。 在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝 胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由 于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电 泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电 泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDSPAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含-巯基乙醇和SDS 等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向 的电泳分离系统所取代。其中-巯基乙醇使蛋白质组分分子的 二硫键保持还S-PAGE的样品处理，即可进行第二向电泳。
一、实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺 电泳组合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上
进行第二向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白
质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )； 第二项则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把 复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和 质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量
水定容到10ml。用eppendorf 管分装，每管100l，置于－20℃冰箱保存。
2） 第一向凝胶储备液（含28.38%丙烯酰胺、1.62%甲叉双 丙烯酰胺）：取7.09g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入0.405g甲叉双 丙烯酰胺。待溶解完全后定容至25ml，置于棕色瓶内于， 4℃冰 箱保存。 3） 第一向电极母液（临用前稀释10倍）： 正电极母液（0.1mol磷酸）：取6.75ml磷酸，用去离子水定 容至1000ml。 负电极母掖（0.2mol NaOH）：取16g NaOH，用去离子水定容 至2000ml。 4）样品覆盖掖（含8.0mol/L尿素、0.4% Ampholine pH57、0.4% Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、5 mmol/L K2CO3）：取新鲜尿素4.8g，0.1ml Ampholine pH5-7， 0.1ml Ampholine pH6-8，0.1mlAmpholine pH3.5-10，1ml 50 mmol/L K2CO3，用双蒸水定容到10ml。用Eppendorf 管分装， 每管100ul，置于－20℃冰箱保存。
三. 实验报告
附
录
一、第二向电泳缓冲液的配制： 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8 二、染色液的配制 900ml甲醇：900ml蒸馏水：200ml冰醋酸 （内含2.5g 考马斯亮蓝R-250)
要使聚丙烯酰胺双向电泳能够得到较为精确的分离结果， 组成双向电泳的两个单向电泳所依据的分离原理应该有很大的 不同。以蛋白质混合组分得分离为例，如果两个单向电泳所依
5）平衡液(含10%甘油、5%-巯基乙醇、2.3g SDS 、0.625mol /LTris-
HCI、55ml甲醇)：取10ml甘油、5ml -巯基乙醇、0.5ml浓盐酸、2.3g
SDS、0.757gTris，先用20ml双蒸水溶解，然后加入55ml甲醇，最后用双蒸水 定容到100ml。置棕色瓶中于4℃冰箱保存。
采用IEF/SDS-PAGE分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯
酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与
IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别：1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电 泳不同。在进行第一向IEF-PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充
二. 实验步骤
蛋白质提取：称取0.2g花生胚脱脂粉，加入１ml样品裂解液，冰浴中
充分研磨， 4℃、12000g离心10min，上清液置-20℃下备用。
１．试剂配制： 第一向试剂： 1）样品裂解液(内含9.5mol/L尿素、2%非离子型去污剂NP-40、0.8% Ampholine pH5-7、0.8%Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、2% 二硫苏糖醇、5 mmol/L K2CO3)：取5.7g新鲜尿素，2ml 10%非离子型去污剂 NP-40，0.2ml Ampholine pH5-7，0.2ml Ampholine pH6-8，0.1ml Ampholine pH3.5-10，0.2g二硫苏糖醇(DTT)，1ml 50mmol/LK2CO3，用双蒸
8，Ampholine pH 5—7。 3.操作方法:
(1) 等电聚焦凝胶柱的制备(10ml)
试剂 尿素（超级纯） 第一向凝胶贮备液 Ampholine pH 3.5—10 Ampholine pH 5—7 Ampholine pH 6—8 K2CO3 50mmol/L 双蒸水 10% NP-40 TEMED 10%过硫酸铵 用量 5.5g 1.33ml 0.1ml 0.2ml 0.2ml 0.5ml 1.47ml 2.0ml 10 l 12l
心:Australia Proteome AnalysisFacility(APAF)。丹麦、加
拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国,各大药厂 和公司在巨大财力的支持下,也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。
国内从1997年开始开展蛋白质组研究，已建立起基本蛋白 质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研 究中心和军事医学科学院。目前年我国的蛋白质组研究进入了 一个迅速发展的新阶段,其主要标志是国家科技部将蛋白质组研 究确立为“973”和“863”的项目。 蛋白质组学一经出现,就有两种研究策略。一种可称为“竭 泽法”,即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能 多乃至接近所有的蛋白质,这种观点从大规模、系统性的角度来 看待蛋白质组学,也更符合蛋白质组学的本质。但是,由于蛋白 质表达随空间和时间不断变化,要分析生物体内所有的蛋白质是 一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”,即研究不 同 时期细胞蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达, 以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把 蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。
信息。
IEF/SDS-PAGE双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不
同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。采用IEF/SDS-PAGE分离蛋
蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向 SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区 别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEFPAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向 SDS-PAGE的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和 适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两
TEMED
4l
10l
2. 标准蛋白质标记胶制作，用未电泳过的等电聚焦胶条切 成8 mm左右的胶段，放入煮沸过的蛋白质Marker溶液中浸泡 10 min即可。 3. 分离胶及浓缩胶的制作 4. 等电聚焦凝胶柱的包埋 5. 电泳：浓缩胶恒流30 mA、分离胶恒流50-60 mA
6. 剥胶
7. 染色及脱色：用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，脱 色液含7%的冰醋酸和10%的乙醇。 8. 成像
的0.02mol/L NaOH电极液。将电压先恒定至400V电泳15小时，再恒定至
800V1小时。
(5) 剥胶 (6) 固定与平衡：将凝胶柱用双蒸水洗2-3次，放入平衡液(含55% 的甲醇)中 平衡3-5 min，然后换用新鲜的平衡液振荡平衡0.5-1h，最后用不含甲醇的新 鲜平衡液洗1-2次，每次2min。 第二向SDS-PAGE 电泳：与一般SDS-PAGE 电泳相同 1. 分离胶及浓缩胶制备 试剂成分及用量 水 30%丙烯酰胺 1.5mol//l Tris-HCI pH 8.8 10%SDS 10% Ap 分离胶(10ml) 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 浓缩胶(10ml) 6.8 1.7 1.25 1.0mol//l Tris-HCI pH 6.8 0.1 0.1
400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到6.8，最后定容至500ml。
9）SDS-PAGE电极贮存液（临用前稀释5倍）：900ml去离子水中溶解 15.1g Tris和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%(w/v)的电泳级SDS贮存液，用
去离子水定容至1000ml。
10） 两性电解质载体：Ampholine pH 3.5—10，Ampholine pH 6—