遗传学幻灯12

PCR反应混合液四种主要成分： 两个引物（一般为20 bp） 模板DNA 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在 95℃甚至更高温度下活性稳定） 四种脱氧核苷酸。
PCR反应在PCR仪上自动进行
PCR反应从启动到结束称为一个循环， 每个循环包括三个步骤： 1）变性：95℃，DNA
双链分离成单链 2）退火(复性)：55℃ 左右，引物与单链的 模板DNA序列互补结合 3）延伸：72℃左右， Taq酶通过在引物 的3’-OH端增加碱基的 办法使引物延伸
（2）筛选基因库 利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡 核苷酸)作探针(probe)，用放射性同 位素或非放射性同位素标记探针，也 可用抗体作探针，筛选基因库 筛选λ噬菌体构建的库常利用菌落杂 交法：将经重组噬菌体感染的宿主细 菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿 中，培养过夜，形成噬菌斑
图 12-10 菌落杂交技术
从细胞或组织获得DNA并纯化 用限制酶切割DNA 将所得限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制， 产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆 5) 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化 6) 克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分 1) 2) 3) 4)
一类以RNA为 模板来指导 DNA合成的 DNA聚合酶， 故又称依赖于 RNA的DNA聚合酶链式反应(PCR)
PCR是体外快速扩增DNA的方法,由 美国的Mullis(1986)发明, 1993 年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增， 且可用痕量DNA作模板，对DNA纯 度要求也不高,可在几小时内使目 的基因片段扩增到数百万个拷贝
① 在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制 子，有独立的复制起始位点 ② 有限制酶切位点，允许外源基因插入且插 入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增 ③ 有选择标记，便于选择含重组DNA分子的 寄主细胞 ④ 分子量小，多拷贝，易于操作 ⑤ 具有安全性等
（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程
图12-6 质粒PUC18的结构及多克隆位点
Ri质粒
Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似 ，可以分为T区、vir区、ori区和其它 区域等几个部分。 T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括 ①T区的左右边界序列;②TL-DNA区; ③TR-DNA区。
（2）噬菌体载体
1、噬菌体； 2、噬菌体DNA； 3、噬菌体DNA中间 基因簇； 4、将连接物体外包 装后感染细菌，制备 基因库（用于基因库 构建）
酵母人工染色体（YAC） YAC载体可以插 入大片段的DNA （1-2Mb），成为 人类基因组计划 （HGP）的一种 重要工具
三、基因分离方法
一个基因就是编码一条多肽链的
一个DNA片段 包括：启动子、终止)：是一组DNA
和cDNA序列克隆的集合体。从基
图12-15 棉花转基因植株生产过程
2、基因枪法
基因枪法\生物弹法\微粒枪法\微粒 轰击法—金、钨 依赖高速的金属微粒将外源基因导入 活细胞的一种转化技术
优点：无宿主限制，可以对任何基因 型材料进行转化研究
第四节 转基因生物的检测与鉴定
PCR Southern blot Northern blot Western blot 性状(表型)鉴定
→ Vir 区的毒性基因是 T-DNA 转移所 必需的，毒性基因可以顺式及反式 两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒的衍生载体，广泛用作植物基 因工程中的载体： （1）双元载体(binary vectors） 如pBin19载体，具有原核生物卡那霉 素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标 记，真核生物卡那霉素抗性基因 (nos-NptⅡ) 作 为 植 物 选 择 标 记 ， pUC19多克隆位点及α-互补显色标记 （2）共整合载体(integrated vectors)
2
1
3
4 5
6
（3）克隆大片段DNA的载体 黏粒载体 克隆外源 片段的长 度在15～ 45kb之间
细菌人工染色体(BAC) 上述的几种载体都不能携带大于50kb 外源DNA片段， 而很多真核生 物基因长度在 50kb以上。细 菌人工染色体 载体就是为 克隆更大的外 图12-9 细菌人工染色体载体pBAC 源DNA片段而 108L 及其多克隆位点。可插入达300kb 左右的DNA片段 设计构建的
（3）阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆， 还需进一步分析、鉴定，才能得 到目的基因
序列测定、生物信息分析 功能预测、功能鉴定
2、T-DNA标签克隆基因 利用T-DNA插入突变 创造突变体，获取目 标基因或克隆
T-DNA 载体构建
转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA
Ti质粒及其衍生载体 Ti质粒包括五个区域 1. LB与RB之间的T-DNA，这段序列整 合到植物基因组中 2. 质粒转移区(PT) 3. 冠瘿碱代谢区 4. 复制原点 5. 毒性区(Vir)
→T-DNA 区域内的所有基因与转移无 关，所以将致瘤基因全部缺失即卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的 抗性基因或其它序列插入到这个区 域，形成的 T-DNA 仍可将 RB 至 LB 内的 序列转移并整合到植物基因组。
利用侧翼DNA序列作探针从cDNA中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的 野生基因转化突变体，回复功能）
图12-11 T-DNA标签克隆基因的基本原理
3、基于PCR的基因克隆
原理：根据待扩增基因的序列合成引物，使 两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增 ，产生大量的基因拷贝用于研究
4、基因的人工合成
5
,
CCCGGG GGGCCC
, 3,
5
平齐末端
5
,
CCC GGG
GGG CCC
, 3,
5
限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点
2、DNA连接酶
DNA连接酶：重组DNA分子构建必不 可少的工具酶，能催化DNA中相邻 的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形 成磷酸二酯键并把两段DNA连接起 来
3、反转录酶
表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系
循环数 1 5 10 15 20 25 30
PCR产物拷贝数 21 2 25 32 210 1024 215 32768 220 1048576 225 33554432 230 1073741824
二、载体
载体：将外源基因送入受体细胞的工具 载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、 细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等 载体特点：
PCR
Southern blot
Northern blot
Western blot
第五节 基因工程的应用及安全性评价
一、基因工程的应用
1、转基因植物
抗除草剂、抗虫、抗病、 抗逆的优良品系或品种， 很多已经大面积种植推 广。 2013年1.75亿公顷： 大豆、玉米、棉花、 水稻、马铃薯、番茄等

gag pol env , 3 LTR A , 5 LTR

B , 5 LTR
neo r
SV40
hADA , 3 LTR
基因治疗的载体和重组DNA分子
6、环境保护 生物治疗 废物处理 诊断 植物治疗
二、安全性评价
1、外源基因的毒性
2、人体免疫系统潜在过敏反应问题
3、抗生素抗性风险问题 4、“超级杂草”及生物多样性
ห้องสมุดไป่ตู้
5、转基因食品的安全性使用与切割质粒相同的限 制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA 切成许多片段，然后将其连接到载合成cDNA，将其与适当载体连 接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成 的基因库。克隆特定基因
5. 转基因生物的安全性评价
第二节
基因的分离
基因分离（克隆）包括3个步骤： 1. 目标DNA片段（基因）的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中 大量复制
一、工具酶
1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序 列的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能
Ⅱ型酶：基因工程中应用最广泛
Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的
Ⅱ型限制性酶的基本特性： ① 有特异识别和切割的序列部位 ② DNA分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端） ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的
第十二章 基因工程
第一节
基因工程概述
遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程
狭义：基因工程
基因工程概述
基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组 技术的发展应运而生的一门新技术。
→1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 →1985年转基因植物获得成功
离出来用于研究或商业开发。
重组DNA分子
二、植物遗传转化方法
1、农杆菌介导法 （1）根癌农杆菌(Ti质粒) （2）发根农杆菌(Ri质粒) 侵染后使植物细胞产生 许多毛状根(发状根)
1. 共培养
2. 在选择培养基上筛选 3. 筛选获得的抗性愈伤
F
5. 胚萌发成苗
6. 转基因植株移栽大田
4. 抗性愈伤分 化成胚状体
2、转基因动物：羊、牛
3、基因工程工业
1
P
lac Z A chain
P
lac Z B chain
A
B
生产胰岛素等