第3章 细胞生物学研究方法
细胞生物学研究方法
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6
公司名称
举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
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29
公司名称
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
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› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
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公司名称
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公司名称
› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
细胞生物学细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
细胞生物学研究方法
细胞生物学研究方法细胞生物学是研究细胞结构、功能和过程的科学学科，主要研究对象是细胞的组成、分裂、分化、代谢、运动、增殖和死亡等。
为了深入研究细胞相关问题，细胞生物学采用了多种研究方法。
第一，显微镜观察法。
显微镜是细胞生物学中最常用的工具之一。
通过显微镜观察，可以观察到细胞的形态、结构和各种细胞器的分布情况。
常用的显微镜有光学显微镜和电子显微镜。
光学显微镜适用于观察活细胞，电子显微镜适用于观察细胞内部细节，如细胞核、线粒体和内质网等。
第二，细胞培养法。
细胞培养是指将细胞在无菌条件下培养于含有营养物质的培养基中，使其持续生长和繁殖。
通过细胞培养，可以研究细胞的生长特性、分裂过程以及对外界刺激的反应。
常用的细胞培养方法有原代培养、细胞株培养和三维培养等。
第三，细胞分离和纯化法。
细胞分离和纯化是将不同类型的细胞从混合细胞群中分离出来，以便对某种细胞进行独立的研究。
常用的方法有细胞悬浮液经过离心分离、细胞表面标记技术以及细胞排序等。
第四，分子生物学技术。
分子生物学技术可以用于研究细胞的基因表达、代谢等分子机制。
其中，PCR技术可以复制DNA序列，用于检测细胞内特定基因的存在和表达水平。
原位杂交技术可以检测细胞内特定mRNA的定位和表达情况。
第五，蛋白质分析技术。
蛋白质分析技术主要用于研究细胞内蛋白质的分布、结构和功能。
常用的方法有蛋白质电泳、质谱分析、免疫印迹等。
第六，遗传学方法。
遗传学方法可以用于研究细胞的遗传特征和突变。
如基因敲除和基因敲入技术可以研究基因在细胞中的作用；细胞杂交技术可以研究细胞核酸的互补性和杂交情况。
细胞生物学研究方法的不断更新和发展，使我们对细胞的理解越来越深入。
这些方法的应用使得我们能够更好地揭示细胞的机制和功能，为解决许多重大疾病和生物学问题提供了有力的工具。
第三章细胞生物学技术
构造上，相差显微镜不同于光镜之处：
1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2、相位板（annular phaseplate）在 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制在可见光下其分辨极限只有02m即使在紫外光下最大分辨率也只有01要观察更精细的结构只有借助分辨率更高的电子显微镜
第三章 细胞生物学研究方法
Chapter 3 Techniques in Cell Biology
第一节 显微技术
细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。
Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrulastage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
《细胞生物学》考研习题解析(第三章 细胞生物学研究方法和技术)
第三章细胞生物学研究方法和技术一、名词解释荧光漂白恢复技术：即fluorescence photobleaching recovery，FPR或fluorescence recovery after photobleaching，FRAP。
首先利用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，然后利用高能量的激光束照射被被标记的特定区域，使该区域标记分子的荧光发生不可逆淬灭而被漂白。
因非照射区域荧光标记分子的移动，使得漂白区域逐渐恢复荧光。
该技术可用于研究蛋白质的运动。
酵母双杂交技术：该技术用于研究蛋白质之间的相互作用。
放射自显影技术：利用放射性同位素（如3H、14C等）的电离辐射对乳胶（含AgBr 活AgCl）的感光作用，研究样本中放射性化合物在机体、组织和器官、细胞中的分布、定位、运动等生物学活动。
二、选择题1. 正常细胞培养的培养基中常需要加入血清，主要是因为血清中含有（）。
A 氨基酸；B 核酸；C 生长因子；D 维生素。
【答案及解析】C。
加入血清主要是为培养基增加生长因子。
2. 冰冻蚀刻技术主要用于（）。
A 电子显微镜；B 光学显微镜；C 原子力显微镜；D 激光共聚焦显微镜。
【答案及解析】A。
冰冻蚀刻技术属于电镜制样技术之一，另外还有超薄切片技术、负染色技术、电镜三维重构与低温电镜技术、扫描电镜技术等。
3. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（）A 细胞融合；B 核移植；C 病毒转化；D 基因转移。
【答案及解析】A。
4. 关于光镜的使用下列哪项有误？（）A 观察标本时，应双眼同时睁开，双手并用；B 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作；C 使用油镜时，需要在标本上滴香柏油，将聚光器降至最低，光圈关至最小；D 使用油镜时，不可一边在目镜中观察，一边下降镜筒或上升载物台。
【答案及解析】C。
三、填空题1. 体外培养的细胞，不论原代还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。
第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。
酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。
所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。
2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。
染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。
3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。
4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。
5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。
6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。
7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。
8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。
9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。
其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。
二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。
2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。
3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。
第三章细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一、是非判断1．提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。
2．光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。
3．亚显微结构就是超微结构。
4．电子显微镜的镜筒中是真空的，其目镜与光学显微镜的目镜也有很大区别。
5．在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。
6．为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。
7．生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。
8．透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。
9．CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和CsCl混匀后分装，离心时，样品中不同组分的重力不同，停留在不同区带中。
10．用免疫荧光技术可显示与酶解过程有关的酶是否结合在微管上。
11．用带有标记的特定核酸分子作探针，测定与之互补的染色体DNA区段的位置，称为原位杂交。
12．Western blotting是体外分析RNA的技术。
13．进行流式细胞术时，所用的细胞需染色，而且还需对组织块中的细胞进行分散处理。
二、选择1．要观察肝组织中的细胞类型及排列，应先制备该组织的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片2．小鼠骨髓细胞染色体标本一般制备成细胞的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片3．观察血细胞的种类和形态一般制备成血液( )。
A．滴片D．切片 C．涂片 D．印片4．提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )。
A．利用高折射率的介质(如甘油) B．调节聚光镜，加红色滤光片C．用荧光抗体示踪D．将标本染色5．下列( )与显微镜能达到的分辨率无关。
A．光波波长B．物镜的放大倍数C．标本和透镜之间的物质的折射率D．透镜的数值孔径6．适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是( )。
A．扫描电镜B．荧光显微镜C．相差显微镜D．倒置显微镜7．用于观察活细胞的显微镜是( )。
细胞生物学-3细胞生物学研究方法
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
细胞生物学-第3章-细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
第三章 细胞生物学研究方法
越强。 15. 用 Triton 等去垢剂可以抽提细胞中的微管、微丝等蛋白质结构。 16. 相差显微镜可以用来观察活细胞和未染色的标本。
18. 当前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位最有力的工具是： A. 暗视野显微镜 B．荧光显微镜 C．倒置相差显微镜 D．普通光学显微镜
19. 关于相差显微镜下列说法错误的是： A. 基本原理是以样品密度差别为基础，将光程差转换成振幅差，形成明暗区别 B．样品不需要染色 C．可以观察活细胞 D．可以对细胞的生物大分子进行定位和定性分析
25. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪项技术构建的： A. 细胞融合 B．核移植 C．病毒转化 D．基因转移
三、判断题
1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。 2. 普通光镜的应用原理是：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，形成足够的反差或
产生不同波长的光谱以区分细胞组分。 3. 亚显微结构即超微结构。 4. 经冷冻蚀刻技术处理后的样品，在电子显微镜下所观察到的图像是样品本身所形成的。 5. 经过流式细胞仪分离出来的细胞不能继续培养。 6. 体外培养的细胞一般均保持体内原有的细胞形态。 7. 透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。 8. 扫描隧道显微镜是具有原子显像力的显微镜。 9. 提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。 10. 在光学显微镜下观察到的细胞结构称为亚显微结构，在电子显微镜下观察到的结构称为
细胞生物学的研究方法
第三章细胞生物学的研究方法一、填空题1．透射电子显微镜由、、、三部分所组成。
2.在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为、并且用进行观察和计数。
4.观察贴壁生长的培养动物细胞可用，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用。
5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。
6．用紫外光为光源照射物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。
7．通过或形成的细胞叫细胞株。
9.灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为。
10. 相差显微镜与普通显微镜的不同是用替代可变光阑，用代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
11．倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。
12．若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为，透射电子显微镜的最大分辨率为，扫描电镜的分辨率为。
13. 显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。
14．高压电镜的电压在120kV以上，优点是：、。
16. 细胞培养的突出特点是：可在。
18.贴壁生长的细胞有三个特点：①；②；③。
19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是。
20．超薄切片染色常采用、染色。
21．免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的物质。
22．电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。
23.电子染色是用来增强电子的散射能力。
24．在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。
25．细菌质膜的多功能性主要表现在：具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。
27.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。
28．单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
29. 可用技术来研究质膜结构的不对称性。
31.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。
32．用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。
33．适于观察活细胞的光学显微有、和等。
34．分辨率是指人的肉眼或显微镜在25cm处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。
第三章 细胞生物学研究方法综述
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察
第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养 细胞工程
一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
电镜与光镜的比较
【免费下载】第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2μm电子显微镜分辨率：0.2nm一、光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜光学显微镜的组成：①光学放大系统（目镜和物镜）；②照明系统（光源、折光镜、聚光镜）；③机械和支架系统（保证光学系统的准确配置和灵活调控）缺图分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。
分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。
公式缺图在油镜下可提高介质折射率，从而最大分辨率达到0.2μm。
光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞。
如果要观察生物组织样品，则需要对材料进行固定，包埋，切片，染色。
苏木精可以特性使DNA着色，伊红可以染蛋白质，从而能显示出细胞核细胞质的位置。
（二）相差和微分干涉显微镜光线通过样品的每一个点到达成像系统时所出现的图像是一个个模糊的圆盘，因此两个相邻的像点所显示的图像可能会发生重叠，重叠到一定程度时，就无法分辨两个点了，造成了光学显微镜的分辨极限。
1、相差显微镜缺图原理：相差显微镜可以将光通过不同密度物质时产生的光程差转换成振幅差，而且相差显微镜在物镜后有一块相差板，相差板上的吸光物质增大了两组光线间的相位差，最后经透镜汇聚时便会产生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。
研究对象：由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜不需染色，可观察或细胞，甚至研究细胞器的动态。
2、微分干涉显微镜原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜汇合，从而样品中厚度上微笑的区别就会转化为明暗区别，增加反差，且具有很强的立体感。
研究对象：适合于研究或细胞中较大的细胞器，还可接上录像装置观察动态。
（三）荧光显微镜原理：主要用于检测细胞上的特异荧光染料，为此增加了两套滤光片，第一套为激发光滤片，装载光源和样品之间，只有那些能激发荧光染料发光的特定波长的光才能通过；第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。
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第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养
细胞工程
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一、细胞的培养
动物细胞培养
类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain）
细胞系（cell line）
植物细胞 原生质体培养 （体细胞培养） 类型： 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system）
第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法
细胞培养、细胞工程与显微操作技术
1
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术 (Electro microscopy)
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
原理：
利用一些显色剂与所检测物质中一些
特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞 中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中 的分布和含量。
22
1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀， 借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物 后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染 料。 3. Schiff反应：分子中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变 为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。
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原代培养（primary culture）：也叫初代培养，指直接 从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养 物。一旦已进行传代培养（subculture）的细胞，便不 再称为原代培养，而改称为细胞系。 传代（passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一 个培养瓶即称为传代或传代培养。培养细胞的“一 代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种 到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能 倍增3-6次。
密度梯度离心：
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混 悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分 离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 用于精细组分或生物大分子的分离。 20
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二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法
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电镜与光镜光路图比较
光源 聚光镜 样品 物镜 目镜 直接成像
光学显微镜
电源
聚光镜 样品 物镜
电源
透镜 射线扫描器 透镜Biblioteka 目镜荧光屏上 观察图象
透射电镜
样品
荧光屏上 观察图象
扫描电镜
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电子显微镜的基本构造
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主要电镜制样技术
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备 负染色技术（Negative staining） 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 电镜三维重构技术
流式细胞仪（Flow Cytometry）
主要应用：
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量；
从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；
分离DNA含量不同的中期染色体。
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流式细胞术
流 式 细 胞 术
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其主要工作原理是：经荧光染色的单细胞悬液被高压压入流动室 内，在PBS或生理盐水等壳液(Sheath Fluid)的包裹和推动下形成单 细胞状态，并以每分钟5000—10000个细胞的高速度从流动室内喷 出。在与细胞束呈90°角的方向，受到来自氩离子激光器的激光 束照射而激发荧光。通过各种物镜及滤光片将从不同角度收集的 荧光投射到光电倍管并转换为各种强弱不等的电脉冲信号显示出 来。这些信号输到电子计算机中贮存，经处理和分析便可得到多 种信息参数。进行细胞分类时，根据需要对含细胞的水滴选择性 充电，在带有高电压的偏转板作用下，带正电荷的水滴落入左方 收集管内，带负电荷的水滴落入右方收集管内，不带电荷的水滴 进入中间的收集管。分类主要根据细胞的荧光强度，即单细胞 DNA含量。
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
超薄切片技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 电镜三维重构技术
扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）
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三、 扫描遂道显微镜
原理：量子力学中的隧道效应 特点：（1） 分辨本领高，（侧分辨率为0.1～0.2nm， 纵分辨率可达0.001nm）；
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一、光学显微镜技术（light microscopy
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜（differential-interference microscope）
光 源 可见光 可见光 (波长400 ～700nm)
透 镜
真空
成像原理
利用样本对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
0.1 m
紫外光
玻璃透镜 不要求真空 电磁透镜 1.33×10 -5～ 利用样品对电子的散射 1.33×10-3 Pa 和透射形成明暗反差
电子显微镜 接近 0.1nm
电子束
(波长 0.01 ～ 0.9nm)
率可比普通显微镜高50 倍。
相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。
这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和 活细胞。
电子显微镜与光学显微镜的基本区别
分辨本领 人眼 光学显微镜 100 m 0.2 m
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4. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生 氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝， 进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作 用，形成普鲁士蓝。 6. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 7. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类 显色。 8. 茚三酮反应：显示蛋白质。
平上研究特异蛋白抗原的定位。 – 免疫铁蛋白技术 – 免疫酶标技术 – 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的 分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白 的定位等
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四、细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术:同位素标记或荧光素标记
的探针
电镜水平的原位杂交技术:生物素标记的探针与抗生
实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
步骤：
前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）
———放射自显影
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六．定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术（microspectrophotometry）
利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质
（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法
（2）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；
（3）非破坏性测量。样品的完整外貌。
用途：纳米生物学研究领域中的重要工具
5
普通复式光学显微镜技术
分辨率（即分辨极限, D）是指区分开 两个质点间的最小距离.
习惯说的分辨率高则是指该分辨极限小； 人眼的分辨率：100 m，光学显微镜的最大分别率：0.2 m. 放大倍数: 光学显微镜在用空气作介质时,最大放大倍数 为1000倍,用油镜时为1400倍.
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荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质
等生物大分子的定性定位：
如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
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激光共聚焦扫描显微镜
激光共聚焦扫描显微镜用激 光作扫描光源，逐点、逐行、 逐面快速扫描成像。 统经一次调焦，扫描限制在 样品的一个平面内。调焦深
物素抗体相连的胶体金标记结合
PCR技术
–聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，
PCR）在体外将目标DNA大量扩增,以便分析.
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人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
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五、放射自显影技术
原理及应用：
利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行
定性、定位与半定量研究；
激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
3
二、 电子显微镜技术
1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska用波长比光短得多的电子作 光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了 超微世界。
度不一样时，能显示细胞样
品的立体结构。
暗视野显微镜
暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有 挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本 反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。
利用这种显微镜能见到小至4~200nm 的微粒子，分辨
17
人类血细胞SEM照片 图片来自 /
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第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
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一、 离心分离技术