地塞米松对K562细胞增殖抑制作用及诱导凋亡机制的研究

培 养 上 清 中 ＮＯ２－ 的 浓 度 间 接 反 映 了 ＮＯ 的 分 泌量。如表 ３ 所示， ５￣８０μｏｍ／Ｌ 地塞米松作用后细 胞培养上清中的 ＮＯ 量均低于对照组， 但与对照组 比较差别没有统计学意义（ Ｐ＞ ０．０５）（ 表 ３） 。
重庆医科大学学报 ２００８ 年第 ３３ 卷第 ８ 期 （ Ｊ ｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅ ｄｉｃａ ｌ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ２００８． Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．８）
增殖抑制及诱导凋亡的机制也鲜有报道。因此， 本 实验通过不同浓度的地塞米松对 Ｋ５６２ 细胞进行体 外作用， 观察了其抑制细胞增殖及诱导凋亡情况， 对药物可能的作用机制进行了初步的探讨。
１ 材料与方法
１．１ 材料 Ｋ５６２ 细胞 由 本 实 验 室 保 存 ， 地 塞 米 松（ 纯 度 ９８％） ， ＭＴＴ
Ｆａｓ 在对照组 Ｋ５６２ 细胞有一定表达， 其阳性表 达率为 １３．３％。经 ５￣８０μｍｏｌ／Ｌ 地塞米松处理后的 Ｋ５６２ 细胞， 其 Ｆａｓ 的表达随药物浓度的增加而上调， 由 ５μｍｏｌ／Ｌ 的 １５．７６％上升到 ８０μｍｏｌ／Ｌ 的２５．３２％。 ５￣８０μｍｏｌ／Ｌ 地 塞 米 松 处 理 组 与 对 照 组 比 较 ， 差 别 具有显著性意义（ Ｐ＜ ０．０５）（ 表 ２） 。 ２．５ 地塞米松对 ＮＯ 产生的影响
能抑制 Ｋ５６２ 细胞的增殖， 降低端粒酶活性， 使 Ｆａｓ 表达上调， 诱导细胞凋亡。但对 ＮＯ 的生成不具有显著性差异。结论： 地塞米
松可能通过抑制端粒酶的活性而诱导 Ｋ５６２ 细胞的凋亡。同时， Ｆａｓ 也可能参与了凋亡的调节。
【关键词】地塞米松； 凋亡； 端粒酶； Ｋ５６２ 细胞
【中国图书分类法分类号】Ｒ７３３．７３
研究资料表明， 在血液系统的恶性肿瘤中， 地塞 米松能抑制人类 Ｔ 淋巴白血病细胞等急性白血病 细胞的生长并诱导其凋亡［４， ５］， 但其诱导细胞凋亡的 机制尚不完全清楚。同时地塞米松对 Ｋ５６２ 细胞的
作者介绍： 刘 畅（ １９８２－ ） ， 女， 硕士， 研究方向： 肿瘤的分子靶向治疗。
通讯作者：刘北忠， 男， 副教授， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｌｉｕｂｅｉｚｈｏｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。 基金项目：国 家 自 然 科 学 基 金（ Ｎｏ．３０３００４４９） ， 国 家 中 医 药 管 理 局 （ Ｎｏ．０２－ ０３ＺＰ５２） ， 重 庆 医 科 大 学 校 级 课 题（ Ｎｏ．ＸＢＹＢ２００７１０４， Ｎｏ． ＸＢＹＢ２００７１０８） 。
（ 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝） ， ＤＭＳＯ（ 二 甲 基 亚 砜） 购 于 美 国 Ｓｉｇｍａ 公 司 ， ＲＰＭＩ１６４０ 培 养 液 ， 小 牛 血 清 购 于 美 国 Ｇｉｂｃｏ 公 司 ， 端 粒 酶 ＴＲＡＰ－ Ｈｙｂ Ｋｉｔ 购于华美生物工程公司， Ｆａｓ 单抗， Ｓ－ Ｐ 试 剂盒购于北京中山试剂公司， Ｇｒｉｅｓｓ 试剂购于 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司。 １．２ 方法 １．２．１ 细胞培养 含用 １０％小牛血清、青霉素、链霉素 ０．１ｍｇ／ ｍｌ 的 ＲＰＭＩ１６４０ 培 养 基 ， 在 ３７℃饱 和 湿 度 、５％ＣＯ２ 培 养 箱 中 常规培养。
白血病是严重危害人类健康的恶性肿瘤， 儿童 尤其多见。地塞米松作为肾上腺皮质激素药物， 能 诱 导 多 种 细 胞 系 及 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 ［１］。 在 白 血 病 治 疗方面， 地塞米松与化疗药物联用， 能增强药物诱 导的白血病细胞的凋亡［２］。如今， 地塞米松已广泛应 用 于 急 性 粒 细 胞 白 血 病 、急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 的 诱 导缓解和诱导缓解后的治疗［３］。
经 ４０μｍｏｌ／Ｌ 的地塞米松处理 ４８ｈ 后的细胞镜 下观察可见细胞生长受抑制， 活细胞数量减少。 ４０μｍｏｌ／Ｌ 的 地 塞 米 松 作 用 组 ， 处 理 ４８ｈ 后 可 就 可 见部分细胞体积缩小， 细胞质凝固， 细胞核内染色 质浓缩成块， 呈现凋亡变化（ 图 １） 。
表 １ 地塞米松对 Ｋ５６２ 细胞增殖抑制作用（ｘ!±ｓ，ｎ ＝５）
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重庆医科大学学报 ２００８ 年第 ３３ 卷第 ８ 期 （ Ｊ ｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅ ｄｉｃａ ｌ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ２００８． Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．８）
１．２．２ ＭＴＴ 实 验 取 对 数 生 长 期 细 胞 ， 离 心 计 数 ， 以 １．０× １０４ 个 接 种 ９６ 孔 培 养 板 ， 每 孔 ２００μｌ， 再 加 入 终 浓 度 分 别 ５、 １０、２０、４０、８０μｍｏｌ／Ｌ 的 地 塞 米 松 ， 并 设 不 加 药 的 阴 性 对 照 孔 ， 以 上 均 行 ５ 个 平 行 复 孔 。 培 养 板 置 ３７℃、饱 和 湿 度 、５％ ＣＯ２ 培养箱中常规培养 ４８ｈ。实验结束前 ４ｈ， 每孔加入 ５ｍｇ／ ｍｌ 的 ＭＴＴ ２０μｌ， 继续培养 ４ｈ。平板离心机 ２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ， 去 上 清 ， 每 孔 加 ＤＭＳＯ １００μｌ 终 止 反 应 ， 振 荡 至 结 晶 完 全 溶 解 ， 酶 标 仪 ４９２ｎｍ 测 吸 光 度 值 Ｄ４９２。 计 算 抑 制 率 ％＝ （ １－ Ａ 处理 ／Ａ 对照） ×１００％。 １．２．３ 细 胞 形 态 学 观 察 收 集 ４０μｍｏｌ／Ｌ 地 塞 米 松 处 理 后 ４８ｈ 的细胞 离 心 ， 涂 片 后 Ｗｒｉｇｈｔ－ Ｇｉｅｍｓａ 染 色 ， 光 学 显 微 镜 下 观察细胞膜， 细胞质及细胞核的各种变化。 １．２．４ 端 粒 酶 活 性 的 检 测 采 用 ＰＣＲ－ ＴＲＡＰ 法 检 测 端 粒 酶 活 性 ， 培 养 细 胞 １．０×１０６ 个 经 ４ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ｍｉｎ， 沉 淀 加入裂解液， 取上清 ２μｌ 做 ＴＲＡＰ 反应模板。在 ＰＣＲ 反应管 中 各 加 入 反 应 混 合 物 ４５μｌ， 混 匀 ， 离 心 ５ｓ， 置 ２５℃ 水 浴 ３０ｍｉｎ。ＰＣＲ 仪扩增， 各孔加入杂交反应液反应， 洗板， 加显色 剂， ３７℃避光显色 １０ｍｉｎ， 加终止液， 在酶标仪上测得 Ｄ４５０／Ｄ５９５ 值， 判断端粒酶活性。 １．２．５ Ｆａｓ 的检测 取对照 组 及 不 同 浓 度 地 塞 米 松 处 理 ４８ｈ 后细胞， 用 ＰＢＳ 洗 ３ 次， 涂片。按照试剂盒进行免疫细胞化学 Ｓ－ Ｐ 染色， 设立不加一抗的阴性对照 ， 镜 下 计 数 阳 性 细 胞 ， 并 计算阳性表达率。 １．２．６ 一 氧 化 氮（ ＮＯ） 水 平 测 定 按 Ｇｒｉｅｓｓ 反 应 原 理 ， 将 地 塞 米 松 处 理 ４８ｈ 细 胞 培 养 上 清 经 离 心 后 １００μｌ 中 加 入 等 量 的 Ｇｒｉｅｓｓ 反 应 液（ １％ 磺 胺 、０．１％ Ｎ－ Ｉ－ 萘 乙 二 胺） 混 匀 ， 室 温 放置 １０ｍｉｎ， 用 酶 标 仪 于 ５４０ｎｍ 处 进 行 吸 光 度 测 定 Ｄ５４０。 以 细胞培养上清液中 ＮＯ２－ 水平反映 ＮＯ 的生成。 １．３ 统计学处理
刘 畅， 金丹婷， 钟 梁， 刘北忠， 王东生， 郝 坡， 王 翀， 王春光
（ 重庆医科大学医学检验系教育部重点实验室， 重庆 ４０００１６）
【摘 要】目的： 研究地塞米松Байду номын сангаас Ｋ５６２ 细胞的增殖抑制作用及诱导细胞凋亡的机制。方法： 用不同浓度的地塞米松对 Ｋ５６２ 细胞
进行处理， 检测细胞增殖抑制率， 观察细胞凋亡的形态学变化， 测定细胞端粒酶活性， Ｆａｓ 表达及 ＮＯ 产生情况。结果： 地塞米松
【文献标识码】Ａ
【收稿日期】２００７－ １１－ ０２
Ｔｈｅ ｉｎｖｅ ｓ ｔｉｇａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅ ｒａ ｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａ ｎｄ ａ ｐｏｐｔｏｓ ｉｓ ｏｆ Ｋ５６２ ｎｉｎｄｕｃｅ ｄ ｂｙ ｄｅ ｘａ ｍｅ ｔｈａ ｓ ｏｎｅ
ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ （ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉ ｖｅ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ｔｒｅａｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓａｇｅｓ ｏｆ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ． Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｆａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＮＯ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｒｅｓｕ ｌｔｓ： Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ， ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｆａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｂｕｔ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｃｏｎ ｃｌｕ ｓｉ ｏｎ ： Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｆａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｙｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ； Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ； Ｋ５６２ ｃｅｌｌ
重庆医科大学学报 ２００８ 年第 ３３ 卷第 ８ 期 （ Ｊ ｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅ ｄｉｃａ ｌ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ２００８． Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．８）