细胞因子诱导的杀伤细胞体外培养技术的评价
CIK细胞治疗乳腺癌的临床疗效评估
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ｔｍｏ． ｔｏ ｓ Ａ ｔｔｌ ｆ３ ａｉｎｓｗ ｔ ｒａｔ ｌｉｎ ｎ ｉｓｗｅｅｒｃ ｒ ｅ ｉ Ｉ ｃ ｌｔ ｅａ ｙｆ ｍ ｕｙ２ ０ ｕ ｒ Ｍｅ｝ ｄ ａ ５ｐ ｔ ｔ ｉ ｂ ｅ ｓ ｌ ｏ ｏ ｅ ｈ ｍａ ｇ ａ ｃｅ ｒ ｅ ｏｄ ｄ ｗ ｔ Ｃ Ｋ ｅｌ ｒｐ ｏ Ｊ ｌ ０ ７ ｈ ｈ ｒ ｔ ｒｈ ２ ．Ｐ ｒｐ ｅａ ｌｏ ｎ ｎ ｃｅ ｒｃ ｉ Ｐ ＭＣ ｒｍ ａｉｎｓｗｉ ｔｎ ａｄ ｔｅ ｔ ｎ ｒｔｃ ｌ ｗ ｒ ｏ Ｍａｃ ０１ ｅｉｈ ｒ ｂｏ ｄ ｍｏ ｏ ｕ ｌａ ｅｌ ｆ Ｂ １ｆｏ ｐ ｔ ｔ ｔ ｓａ ｄ ｒ ｒａｍｅ ｔｐ ｏｏ ｏｓ ｅｅ ０ ｌ ｓ ｅ ｈ
３ ５例患者中 ，完全缓解 ２ 例 ，部分缓解 ６例 ，病情稳定 １ ，近期有效率 ４ 例
效 、免疫学活性及副反应 。 方法
细胞培养后 ，观察 ＣＫ细胞表 型 ，用 Ｍ 法测体外细胞毒活性 ；所有患者均接受一定剂量的 Ｃ Ｋ细胞过继免疫治疗 ，观察 Ｉ Ｔｒ Ｉ 其近期临床疗效 、免疫反应 、不 良反应。 结果 为 ８．１ ５ ％，疾病控制率为 ８ ．７ ７ ８ ％，无肿瘤进展时间为 ２～３ 个月 ，中位无肿瘤进展时 间为 ｌ 个 月。 细胞毒 活性 检测结果 ５ １ ５
Ｔ ｅｃｉｉａ ｅｅ ｒｈ ｏ ｙｏ ｉ ｅ ｉｄ ｃ ｄｋｌ ｒｅ Ｈ ｎｔ ｅｃ ｎｃ ｈ ｌ ｃ ｌ ｓ ａｃ ｆｃ ｔｋｎ — ｎ ｕ ｅ ｉ ｅ ｅ ｓｏ ｌ ｉａ ｉ ｎ ｒ ｌ ｈ ｉ ｌ ｍｍｔ ｔｅａ ｙｆｒｂ ｅ ｓ ｍｏ． ｍｏｈ ｒｐ ｒａ ｔ ｕ ｒ姗 ｏ ｔ
细胞因子诱导的杀伤细胞影响肿瘤微环境的研究
ＫＥ Ｙ Ｗ ＯＲＤＳ Ｃｙ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｋ ｉ ｌ ｌ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， Ｔｕ ｍｏ ｒ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ， Ｌｙ ｍ ｐ ｈ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｕ ｂ ｓ ｅ ｔ ｓ
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具有细胞伤害性的生物活性测定法
具有细胞伤害性的生物活性测定法一、生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1、细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生zhang因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生zhang、IL-3 ci激肥大细胞生zhang、IL-6 ci 激浆细胞生zhang等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株(简称依赖株)。
这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外zhang期培养。
在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2、靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。
通常靶细胞多选择体外zhang期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3、细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可ci激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。
通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4、细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
细胞因子诱导杀伤细胞治疗肿瘤的临床免疫学评价体系
综述细胞因子诱导杀伤细胞治疗肿瘤的临床免疫学评价体系庞云王子健韩润林竺青细胞治疗作为抗肿瘤的新型模式已在临床广泛开展。
细胞因子诱导杀伤(cyto k i ne i nduced killer ,CIK)细胞具有较强增殖、杀伤和提高机体免疫反应的作用,其治疗技术成为细胞治疗领域的先导。
CI K 细胞临床应用研究的进一步深入迫切需要一套综合、系统的临床评价体系。
临床免疫学检测对于CIK 细胞治疗技术的改进和完善具有重要的指导意义,也为客观评估这一技术的有效性和安全性以及制定医疗规范标准提供必要的参考依据。
恶性肿瘤升为人类第一死亡原因,寻找有效的抗肿瘤疗法是当前临床研究的重要课题。
由于很多患者不能承受常规手术和放化疗治疗或对这些方法无效,利用免疫机制清除肿瘤、提高生存期和生活质量成为一个令人期待的理想途径。
然而,恶性肿瘤细胞通常抑制免疫细胞对其进行攻击的能力,机体免疫系统故而受到不同程度损害,C I K 细胞含量常低于正常人的1%~5%,造成免疫低下,无法达到有效杀伤肿瘤细胞的临床效果。
一、C I K 细胞作用机制及应用CI K 临床应用的研究建立在过继性细胞免疫疗法(adopti ve cell i m munot herapy ,ACI)的机制基础上,旨在消除肿瘤免疫抑制影响,增加C I K 数量和细胞毒效应,其发展经历了从自然杀伤细胞(nat ura l k ill er ce l,l N K )疗法[1]到C I K 细胞以及树突状细胞(dendr iti c ce l,l DC )与CIK 联合使用[23]的过程。
常规的方法是从患者外周血提取单核淋巴细胞(pe ri phe ra l blood m o nonuclear cells ,PB MC),在体外接受干扰素(i nterfero n ,IFN )、白介素2(i nterleuk i n 2,IL 2)和抗CD3抗体等诱导刺激,成为具有免疫活性C I K 细胞。
CIK 细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展
CIK 细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展cik细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）是一种非MHC限制的高效细胞毒性T细胞。
1986年，拉尼尔首次发现了这种细胞（CD3+CD56+细胞）。
外周血淋巴细胞中CD3+CD56+细胞的比例为1%～5%。
经过大量扩增，具有肿瘤杀伤活性。
它是最新最有效的肿瘤免疫治疗手段。
现将近年来CIK的研究进展综述如下。
1cik的来源1.1cik亚型早在1986年，Lanier等人就观察到CD3+T细胞同时表达CD56，即CD3+CD56+T细胞群。
根据细胞受体（TCR）+αβT细胞和CD3+CD56+γδT细胞的不同，这些双阳性T细胞进一步分为CD3+CD56两个亚群。
人cik在肝脏中最多［占肝内t细胞的（23.6±4.1%）］，其次为外周血（<5%），但在人的骨髓细胞中至今未发现cik存在，说明人体具有天然杀伤细胞表面标志的t细胞在肝脏与骨髓是不同的细胞系。
关于人cik的起源目前尚未完全清楚，从一些健康供者的去单核细胞的外周血淋巴细胞［m（-）pbl］中加入il.2与il.12，可诱导出cd4+cd56+αβt细胞，提示cik可以被归入原始t细胞。
白细胞介素-白细胞介素（白细胞介素，简称白细胞介素，是指白细胞或免疫细胞之间相互作用的细胞因子。
它与血细胞生长因子属于同一种细胞因子。
它们相互协调和相互作用，共同完成造血和免疫调节的功能。
白细胞介素传递信息，激活和调节immune细胞介导T细胞和B细胞的活化、增殖和分化以及炎症反应，在免疫调节中起重要作用。
白介素2（il-2）分子量为1.5万的糖蛋白，对t细胞激活及生长有作用。
il-2主要由cd4＋和cd8＋t细胞产生，il-2主要以自分泌或旁分泌方式发挥效应。
不同种属间，il-2沿种系谱向上有约束性，向下无约束性。
il-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应。
细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞的临床应用
注到患者体 内。临床上常采用 连续 ３ｄ分 批 回输 ， 回输途径
以静 脉 为主 ， 也有 腔 内注射 、 入应 用 的报告 。Ｃ Ｋ细胞疗 介 Ｉ
效取决 于其在 体内的杀瘤活性 ， 而细胞在体 内发挥作 用受许
多 因素的影 响 ， 中一个重要 因素就是免疫 效应细胞 能否到 其 达靶器官 ， 实现 与肿瘤 细胞 的直 接接 触。因此 ， 了解 免 疫活
好获益 。
体 ＣＫ细胞 为主体 的肿瘤 过继 免疫 治疗 已逐渐 成为 肿瘤生 Ｉ
物治疗 中最活跃的应用与研究领域 之一 ， 国内外 关注 的焦 是
点。 １ 自体 Ｃ Ｋ 细 胞 的 制 备 与 临床 应 用 Ｉ
目前 ， Ｉ ＣＫ细胞治疗肿瘤在 临床 实际应 用 中还有 一些 问
２ Ｃ Ｋ 治 疗 的 疗 效 和 适 应 证 的选 择 Ｉ
性细胞在 活体 内的分布迁徙规律对 于其发挥调节 免疫 、 杀伤
肿 瘤 作 用 来 说 非 常 重 ： 。 文 献 报 告 ， ， Ｉ 要 ２ Ｃ Ｋ细 胞 在 体 外 培 Ｊ
养 ｌ １ ｄ ， 数量 达高 峰 ， 时 Ｃ ； Ｄ６ ４— ８ 时 细胞 此 Ｄ Ｃ￣ Ｔ细胞 的数
胞分离再 回输 ， 临床 已有报道 ， 实际运用 不多 ， 但 这项技术 还
有待进一步改进 ； 有文献提出采用父系血液 的 Ｃ Ｋ细胞 的回 Ｉ 输方法也 尚待进 一 步 研 究 和 探讨 ； 外 ， 否 进 一 步 改 进 此 能 ＣＫ细胞 的培养方法 、 Ｉ 提高 ＣＫ细胞 的活性 和数量 以满足 临 Ｉ 床应 用的要求 ， 也是 目前面临 的问题和研究方 向之一 。 关于 Ｃ Ｋ细胞治疗疗 程 ， Ｉ 文献 资料 提示 ， 多疗 程治疗
细胞因子诱导的杀伤细胞体外研究及临床应用进展
细 胞 因子 诱 导 的 杀伤 细胞 体 外 研 究及 临床 应 用 进 展
梁顺 嗣 综述 ， 娄世锋△， 云 审校 （ 罗 重庆 医科 大 学附属 第二 医院血 液 内科
【 键 词 】 杀伤 细胞 ； 过 继 免 疫 治 疗 ； 肿 瘤 关 Ｄ Ｉ１ ． ９ ９ｊｉ ｎ １ ７－４ ５ ２ １ ．４ ０ ９ 文 献 标 志 码 ： Ｏ ：０３ ６ ／． ｓ ．６ ２９５ ．０ ２ １ ． ３ ｓ Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ９ ５ （ ０ ２ １： ７ ７０ １ ７ — ４ ５ ２ １ ） １ ５ — ３ 一
８ ５ ５ ２ ５ ３ （ ）： １ － １ ．
［Ｏ Ｓ ｈ ｌ ． ｕ ｇｐｏｅｔ ｅｍｅｈ ｎｃｌｖｎｉｔ ｎ ｗ ｔ １ ］ ｃ ｕｔ ＭＪ Ｌ ｎ —ｒｔｃｉ ｃａ ｉ ｅ ｔａｉ ｉ ｚ ｖ ａ ｌ ｏ ｈ
ｌ ｗ ｅ ｉ ｌｖ ｕｍ ｅ ｎ ｐａ ｉｎｔ ｔ ｓ ｆｅ ｉｇ ｒ ｍ ｃ ｅ ｏ ｒｔｄａ ｏｌ ｓ ｉ ｔｅ ｓ ｎｏ ｕ ｆ ｒｎ ｆｏ ａ ｕｔ
Ｈ ｙｐ ｅ ｉ Ｒｅ ｐｉａ ｏｒ Ｆａ ｌ ｅ Ｐａ ｔ ２ Ｎ ｏ ｎ ｉａ ｏｒ ｏｘ ｍ ｃ ｓ ｒｔ ｙ ｉｕｒ ｒ － ｖｅ ｔｌｔ ｙ
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ｔ ｎｓｗ ｔｏ ｔｌｎ ｉ ａｅ Ｊ ． ｒ ａｅ ２ １ ， ４ ２ ： ｉ ｔ ｉ ｕ ｕ ｇ ｄｓ ｓ ［ ］ Ｃ ｉ Ｃ ｒ， ０ ０ １ （ ） ｈ ｅ ｔ
Ｒ３９ ．
［４ １ ］陈 淑 萍 ， 湘 友 ． Ｌ ／ ＲＤ 于 Ａ ＩＡ Ｓ患 者 机 械 通 气 时 最 佳 Ｐ Ｅ Ｅ Ｐ 选 择 的 研 究 进 展 ［］ 中 国 呼 吸 与 危 重 病 监 护 杂 志 ，０ ９ Ｊ． ２０ ，
细胞因子诱导的杀伤细胞治疗癌症的基础与临床
细胞因子诱导的杀伤细胞治疗癌症的基础与临床近年来，应用细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）进行实体瘤治疗的临床试验在国内外陆续开展，该疗法在临床治疗中表现出明显优于其他过继性免疫治疗手段的强大优势，因而被越来越广泛地被应用到临床肿瘤的过继免疫治疗中。
CIK可作为单独的治疗方法，也可与外科手术、放疗、化疗结合进行综合治疗。
本文追踪国内外的研究进展，对CIK的来源及表型、活化及扩增、抗肿瘤作用机制、CIK的临床应用、新的技术方法、副作用的处理、疗效评价等诸方面作以简略介绍，对目前治疗当中存在的问题和发展方向等做了有益探索。
标签：细胞因子诱导的杀伤细胞；肿瘤；细胞免疫治疗过继性细胞免疫治疗（adoptive immunotherapy，AIT）是指通过输注自身或同种特异性或非特异性“抗肿瘤免疫效应细胞”直接杀伤肿瘤细胞或纠正机体低下的细胞免疫功能来达到治疗肿瘤的目的。
伴随细胞生物学，分子免疫学及生物工程技术的发展及相互交叉渗透，细胞介导的过继免疫治疗发展迅速，已成为肿瘤手术、放化疗后进行综合治疗的手段之一。
有研究人员报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced kill cell，CIK），由4种细胞因子活化，具有比淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）细胞更强的肿瘤杀伤活性[1-3]。
在血液系统疾病，恶性肿瘤临床治疗中表现出明显优于其他过继性免疫治疗手段的强大优势，因而被越来越广泛地被应用到临床过继免疫治疗中。
目前国内外有关CIK细胞的研究日趋活跃，笔者仅就近年来国内外CIK细胞治疗恶性肿瘤的基础和应用研究做以简要推介，期望对从事此领域的同行有所借鉴及帮助。
1 CIK的表型及膜标志CIK细胞主要存在于外周血和肝脏，而以后者分布较多，外周血淋巴细胞中可找到大量的CIK前体细胞。
研究证实，CIK细胞是一种异质细胞，是一个混合的细胞群体。
CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞是其主要成分[4]。
不同冻存条件对细胞因子诱导的杀伤细胞的细胞表型及杀伤活性的影响
不同冻存条件对细胞因子诱导的杀伤细胞的细胞表型及杀伤活性的影响王晓辉;马俊;张俊;惠玲【摘要】目的探讨不同冻存条件下细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞表型的变化及对K562细胞杀伤活性的影响.方法收集培养12 d的CIK细胞,分别冻存于-80℃冰箱及液氮中,于冻存后4、12、24周复苏,通过流式细胞仪检测CIK细胞表型变化,CCK-8法测定其对K562细胞的杀伤活性,并与未冻存CIK细胞进行比较.结果液氮冻存4、12、24周及-80℃冻存4周后复苏培养的CIK细胞增殖、细胞存活率、免疫细胞表型及对K562的杀伤活性与未冻存组比较差异无统计学意义(P＞0.05).-80℃冻存12周及24后复苏培养的CIK细胞与未冻存组比较,细胞增殖明显抑制,细胞存活率低,CD3+、CD3 +/CD4+、CD3 +/CD8+、CD3 +/CD56+细胞比例显著降低,对K562细胞杀伤活性显著抑制(P＜0.05).结论临床治疗中CIK细胞应尽量冻存于液氮中,如冻存于-80℃时冻存时间应≤4周.%Objective To investigate effects of different cryopreservation conditions on cell phenotype and cell killing activity on K562 cells of cytokine induced kill (CIK) cell.Methods CIK cells were collected after in vitro culture for 12 days,and the cells were respectively frozen in-80℃ refrigerator and liquid nitrogen.The cells were recovered after cryopreservation for 4,12 and 24 weeks respectively.Phenotype changes and killing activity on K562 cells of CIK cells were detected by flow cytometry and CCK-8 assay respectively,and the results were compared with those of CIK cells without cryopreservation.Results Cell proliferation,cell survival rate,immunocyte phenotype and killing activity on K562 cells of recovery CIK cells afterliquid nitrogen cryopreservation for 4,12 and 24 weeks and-80℃ frozen for 4 weeks showed no significant differences compared with those in CIK cells without cryopreservation (P ＞ 0.05).In CIK cells without cryopreservation,cell proliferation was significantly inhibited,cell survival rate was decreased,and proportion values of CD3 +,CD3 +/CD4 +,CD3+/CD8 + and CD3 +/CD56 + were significantly decreased,and cell killing activity on K562 cells was significantly inhibited compared with those in recovery CIK cells after-80℃ frozen for 12 and 24 weeks (P ＜0.05).Conclusion CIK cells should be frozen in liquid nitrogen as far as possible in clinical treatment,and the frozen storage time should be not more than 4 weeks if short-term frozen in-80℃.【期刊名称】《解放军医药杂志》【年(卷),期】2017(029)001【总页数】5页(P58-62)【关键词】细胞因子诱导杀伤细胞;低温保存;细胞表型;杀伤活性【作者】王晓辉;马俊;张俊;惠玲【作者单位】730050 兰州,兰州军区兰州总医院医学实验科甘肃省干细胞与基因药物重点实验室;730050 兰州,兰州军区兰州总医院医学实验科甘肃省干细胞与基因药物重点实验室;730050 兰州,兰州军区兰州总医院医学实验科甘肃省干细胞与基因药物重点实验室;730050 兰州,兰州军区兰州总医院医学实验科甘肃省干细胞与基因药物重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R392.12细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer cells, CIK)是利用多种细胞因子刺激诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)而获取的一类具有CD3+/CD56+表型特点的异质性细胞群，CIK细胞同时具有T淋巴细胞的杀瘤活性和自然杀伤细胞无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制的杀瘤效应，是介导细胞毒活性强免疫效应细胞，具有培养方法及条件简单、增殖速度快、杀瘤活性高、应用范围广、临床使用安全等特点，广泛地应用于各类肿瘤的过继免疫生物治疗中[1-4]。
细胞因子诱导杀伤细胞抗淋巴瘤细胞作用的研究
实用 医学 杂志 ２ １ ０ ０年第 ２ ６卷第 １ ８期
细胞 因子诱 导 杀 伤 细 胞抗 淋 巴瘤 细胞 作 用 的研 究
拾莉 任 思坡 韩光宇 谭昆 耿跃春 杨钦 湘 王健
摘 要 目的 ： 讨体 外 细胞 因 子诱 导 杀 伤 （ Ｉ 细胞 对 淋 巴瘤 细胞 的 杀 伤 作 用 。方 法 ： 集 健 康 人 外 周血 探 Ｃ Ｋ） 采 单 个 核 细胞 （ Ｂ Ｐ ＭＣ） 经 Ｉ一 、 Ｄ ＭｃＡ】Ｉ一、Ｆ 一 ， Ｌ２ Ｃ ３ — ｌ Ｌ １ＩＮ 诱 导 ， 备 ＣＫ 细 胞 ， 时 以 淋 巴 因子 激 活 的 杀 伤 细胞 、 制 Ｉ 同
伤作 用强 于 Ｌ Ｋ细胞 ． Ａ 具有较 强的抗淋 巴瘤细胞 活性 ， 是肿 瘤过 继免 疫治疗中更为有效 的杀瘤效应细胞。
关 键 词 淋 巴瘤 ： 细 胞 因子 诱 导 杀伤 细胞 ： 过 继免 疫 治 疗
Ｔｈ ｙｔ ｔ ｘｉ ｆｅ ｔｏ Ｋ ｅｌ ｎ ｙｍ ｐｈｏ ａ ｅｌ ｎ ｉｒ Ｓ ＩＬｉ ＲＥＮ － ｅ ｃ ｏ ｏ ｃ ｅ ｃ ｆＣＩ ｃ ｌｓ ｏ ｌ ｍ ｃ ｌｓｉ ｖｔｏ Ｈ ， Ｓｉ ｐｏ， Ｎ ａ ｇ－ Ｇｕ ｎ ｙｕ， Ｔ ＡＮ Ｋｕｎ，
Ｃ Ｋ ｃ ｌ ｅ ｅ ｐ ｅ ａ ｅ ｙ ｉ ｄ ｃｉ ｎ ｏ ｕ ｎ ｐ ｒ ｈ ｒ ｌ ｂｏ ｄ ｍｏ ｏ ｕ ｌａ ｅ ｌ Ｉ ｅｌ ｗ ｒ ｒｐ ｒ ｄ ｂ ｎ ｕ ｔ ｆ ｈ ｍａ ｅ ｉ ｅ ａ ｌｏ ｎ ｎ ｃｅ ｒ ｃ ｌ ｓ ｏ ｐ ｓ
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CIK与DC-CIK培养特性及体外存活时间的比较
现， 肿瘤患者 FIB 和 D - D 普遍增高， 尤其是 D - D 增高
DOI： 10. 3969 / j. issn. 1671 - 4695. 2014. 19. 008
CIK 与 DC - CIK 培养特性及体外存活时间的比较
马聪 邱伟 袁红霞 （ 海肿瘤住院患者 50 例， 分为 CIK 组和 DC - CIK 组， 采血前检测患者
CIK 细胞的表面标志 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD56 的表达， 收获后胎盘蓝染色法检测细胞在室温下放置不同时间存活率的变
CD8 + 、 CD3 + CD8 + 和 CD3 + CD56 + T 细胞比例 DC - CIK 组显著高于 CIK 组， 两组细胞活率随时间延长而降低， 2 h 细胞 胞比 CIK 细胞增殖更快， 效应细胞比例更高， 因而具有更高的生物活性。收获后细胞在室温下放置， 随时间延长活率逐 渐下降， 所以细胞收获后应尽快回输给患者。 【 关键词】 恶性肿瘤 细胞因子激活的杀伤细胞 树突状细胞 表面标志 存活率 活率与初始有显著性差异， 4 h 细胞活率低于 95％ 。相同时间两组间细胞活率比较差异无显著性。 结论 DC - CIK 细
on outside the incubator. Both CIK cells or DC - CIK cells should transfuse to patients as quickly as possible.
第 13 卷
第 19 期
· 1587·
中 2 例血栓形成， 需要拔管。另 2 例经 1 周期化疗后肿 阻引起。其余患者也均经血管彩超证实无血栓形成， 局 部红肿感染者经抗炎、 换药等处理后均好转。
动物模型
C3H小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为 小鼠：
85%~100%。 85% 100%。 100%
A系小鼠： 经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30% 80%。 系小鼠： 经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30% 80%。 30%~80% CBA小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为60% 65%。 雌鼠自发性乳腺癌发生率为60% 65%。 60%~65%
9
肿瘤体积变化对时间作出生长曲线 变化对时间作出生长曲线, 将肿瘤体积变化对时间作出生
8.摘 要：目的建立结肠癌肝转移的动物模型，用于肿瘤转移防治的实验方法，对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，经脾脏注入指数生长期的的小鼠结肠腺癌细胞（ＣＴ２６）悬液０．１ｍｌ，含细胞１＊１０＾６个，保留脾脏。观察接种后小鼠的生存期，小鼠分别于接种后第７、１０、１５天及自然死亡后剖腹、观察腹腔内肿瘤生长情况，留标本作病理检查和流式细胞术（ＦＣＭ）倍体检测。结果小鼠平均自然生存时间为（１８．２±１．８）天，尸解发现接种动物的肝
4.【摘要】 目的建立并对比两种异位种植结肠癌肝转移小鼠模型。方法以1×106个/mL小鼠结肠癌细胞株(CT26)0.2mL对BALB/c小鼠分别行肝门静脉注射法,脾脏种植切除脾脏法构建结肠癌异位种植肝转移动物模型。术后待小鼠自然死亡,比较两种动物模型的肝转移率和成瘤效果、肺转移率以及小鼠生存期的差异。结果肝门静脉注射法与脾脏种植切除脾脏法相比,前者在肝转移率、肝脏成瘤效果和肺转移率方面高于后者,后者在小鼠生存时间和操作难易程度方面优于前者。结论本研究建立并对比了两种具有高转移率的结肠癌肝转移小鼠模型,肝门静脉法在肝转移率和肝脏成瘤效果方面更具优势,适合对肝转移率和取材要求较高的实验研究;而脾脏种植切除脾脏法则更适合验证周期较长的药物实验。
细胞因子诱导的杀伤细胞基本特性及抗肿瘤效应研究
细胞因子诱导的杀伤细胞基本特性及抗肿瘤效应研究程民;沈干;胡世莲;陈稳;毛菊;王静;程翠;沈国栋;卞庚;徐婷娟;徐维平【摘要】目的：建立培养细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞方法，并评价其基本特点、体内外抗肿瘤活性及安全性。
方法使用抗CD3单克隆抗体、rhIL-2及rhIFN-γ刺激PBMC细胞，使其在体外大量扩增，利用流式细胞术、体外杀伤实验及荷人卵巢癌小鼠模型检测CIK细胞的特点及抗肿瘤活性；并检测CIK细胞中外源性因子污染情况及其急性毒性作用。
结果体外培养21 d后，CIK细胞总数可达1010以上，其主要成分为CD3＋CD8＋T细胞及CD3＋CD56＋NKT细胞，CIK 细胞在体外对Ho8910、A549、K562及HepG2细胞均有较高的杀伤活性，并对荷瘤小鼠具有治疗作用。
同时在CIK细胞中未检测到外源性病原体污染。
结论 CIK 细胞在体内外均具有较高的抗肿瘤活性且无毒性作用。
%Objective To establish the methods of cytokine-induced killer (CIK)cells and evaluate the characteristics,anti-tumor activity in vitro and in vivo and thesafety.Methods Anti-CD3 mAb,recombinant human interleukin 2 (rhIL-2 )and recombinant human interferon-γ(rhIFN-γ)were used to induce the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)proliferation abundantly in vitro.Flow cytometry assay (FACS),in vitro cytotoxicity as-say and tumor mouse model xenografted with Ho-8910 (human ovarian cancer cell line)were used to detect the char-acteristics and the anti-tumor activityof CIK cells.Additionally,the contamination of exogenous agents and the acute toxicity effect of CIK cells were also determined.Results After 21 days in vitro culture,the total number of CIK cells were more than 1010,among which there were mainly CD3 +CD8 +T cells and CD3 +CD56 +NKTcells.CIK cells dis-played high cytotoxicity against Ho8910,A549,K562 and HepG2 cells in vitro,and they also showed therapeutic effects in tumor xenografted mice.Additionally,no acute toxicity was observed in CIK cells-treated mice,and there was also no contamination ofbacteria,fungus,mycoplasma and virus in CIK cells.Conclusion CIK cells have high anti-tumor activity without any toxic side effects.【期刊名称】《中国临床保健杂志》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P280-283,337)【关键词】免疫疗法;细胞培养技术;细胞因子诱导杀伤细胞;卵巢肿瘤;疾病模型,动物【作者】程民;沈干;胡世莲;陈稳;毛菊;王静;程翠;沈国栋;卞庚;徐婷娟;徐维平【作者单位】安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室;安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥230001; 安徽省老年医学研究所; 肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R730.51目前，手术和放、化疗已成为临床上治疗肿瘤的主要手段，并取得了一定的治疗效果，但目前肿瘤的复发率和死亡率仍然较高。
抗CD3单抗包被技术获得CD3AK细胞的体外实验研究
抗CD3单抗包被技术获得CD3AK细胞的体外实验研究白雪;邓琦【摘要】目的抗CD3单抗包被技术与传统方法培养获得的抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)的体外扩增、体外杀伤活性及免疫表型的比较,以期为选择增殖更快、抗癌效应更强的生物活性细胞供临床治疗.方法健康人外周血单个核细胞,分别采用抗CD3单抗包被技术与传统方法培养获得CD3AK细胞、常规方法培养获得CIK细胞,检测各免疫活性细胞对K562耐药细胞株(K562/ADR)的杀伤活性、细胞膜P-糖蛋白(P-glucoproteins,P-gP)表达以及收获时细胞表型、上清液细胞因子含量.结果培养第13天时,包被技术获得CD3AK细胞和CIK细胞计数分别为非包被培养的1.41倍、2.96倍;3组细胞免疫表型差异均无统计学意义(P＜0.05);但上清液中白细胞介素2(1L-2)水平3组分别为(47.97±3.24)ng/L vs(40.14士2.26)ng/L vs(35.90士3.33)ng/L,IL-12为(128.50±14.82)ng/L vs(110.69±10.02)ng/L vs(98.24±10.30)ng/L,肿瘤坏死因子α(TNF-α)为(154.42±16.99)ng/Lvs(143.67±14.24)ng/L vs(121.56土13.62)ng/L,γ干扰素(IFN-γ)为(143.79±12.97)ng/L vs(115.87士13.24)ng/L vs(102.50土10.47)ng/L,包被培养CD3AK细胞组高于其他两组(P＜0.05).3组细胞在不同效价比对K562/ADR细胞杀伤活性差异无统计学意义(P＞0.05),与K562/ADR细胞作用后P-gP蛋白表达均下调,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论抗CD3单抗包被技术可以在短时间内获得更大数量的免疫活性细胞,抗肿瘤细胞活性肯定,是一种更为有效的培养方式.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2010(025)018【总页数】4页(P1593-1596)【关键词】杀伤细胞;白细胞介素类;细胞培养技术;流式细胞术;酶联免疫吸附测定【作者】白雪;邓琦【作者单位】天津市第一中心医院血液科,天津,300192;天津市第一中心医院血液科,天津,300192【正文语种】中文【中图分类】R446.8免疫细胞过继治疗是继手术、化疗和放疗之后的第4种肿瘤治疗模式。
CIK细胞培养基及高效杀伤肝癌细胞效靶比的选择
CIK细胞培养基及高效杀伤肝癌细胞效靶比的选择李美鹤;戴尔珣;孙丽;侯雪芹;张汝建【摘要】目的选择高效、稳定的细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)培养基及杀伤肝癌细胞的效靶比.方法采用RPMI1640、GT-T551两种培养基对5例健康人外周血单个核细胞进行体外常规诱导培养,两种培养基中分别加入0、200、500 IU/mL 的IL-2,采用光学显微镜观察细胞形态变化,台盼蓝染色计数并绘制生长曲线,计算细胞扩增倍数.将CIK与肝癌7721细胞共培养,调整效靶比为10: 1、20: 1、40: 1、80: 1,72 h后进行CCK8检测,酶标仪测OD450值,计算杀伤率.结果与1640培养基比较,GT-T551培养基组各浓度IL-2下细胞扩增倍数增加(P均＜0.05).与效靶比80: 1时比较,效靶比为10: 1、20: 1、40: 1时CIK的杀伤率低(P均＜0.05).结论GT-T551培养基加500 IU/mL IL-2的培养体系更有利于CIK细胞的增殖,CIK细胞与7721细胞的效靶比为80: 1时杀伤效应更强.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2019(059)003【总页数】4页(P14-17)【关键词】培养基;效靶比;细胞因子诱导杀伤细胞;细胞增殖能力;细胞杀伤效应【作者】李美鹤;戴尔珣;孙丽;侯雪芹;张汝建【作者单位】泰山医学院,山东泰安271000;苏北人民医院;西安交大扬州科技园;泰山医学院,山东泰安271000;泰山医学院附属医院【正文语种】中文【中图分类】R735.7过继免疫疗法是癌症免疫疗法中的一种，是指将自体或异体的抗肿瘤效应细胞前体在体外进行活化、增殖，然后输入患者体内，使其发挥抗肿瘤作用[1]。
过继免疫疗法作用靶点位于人体正常免疫细胞，通过激活自身的免疫系统达到治疗癌症的目的。
细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是人体外周血单个核细胞体外诱导产生的具有杀瘤作用的异质细胞群，它对癌症的治疗属于过继免疫疗法，是肿瘤过继细胞免疫疗法中的首选方法，而且是免疫治疗的主要方法之一。
同种异型抗CD3单抗对细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增的影响
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１ １ 材 料 淋 巴 细 胞 分 离 液 （ ｙ ｈ ｐｅ Ｔ ； ． Ｌ ｍｐ ｏ ｒｐ Ｍ）
１ ３
山东 医药 ２ １ ０ １年第 ５ 卷 第 ３ １ ７期
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山东 医药 ２ １ ０ １年第 ５ １卷第 ３ ７
同种 异 型抗 Ｃ ３单 抗 对 细 胞 因子 诱 导 的 Ｄ 杀 伤 细胞 体 外 扩增 的影 响
细胞因子诱导的杀伤细胞在感染性疾病免疫治疗中的作用
细胞因子诱导的杀伤细胞在感染性疾病免疫治疗中的作用张克新;王智刚;蒋敬庭【摘要】细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK细胞)是体外采用多种细胞因子扩增的异质性细胞群,具有增殖活性高、杀瘤活性高、非MHC 限制性、安全性高等特点.此外,CIK细胞治疗可明显改善肿瘤患者免疫抑制状态,提高机体的免疫功能.CIK细胞在乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒相关的移植后淋巴组织增生性疾病等非肿瘤性疾病中也有应用研究的相关报道.CIK细胞过继免疫治疗有助于提高机体免疫功能,可有效抑制肝炎病毒复制、降低肝炎病毒载量、减轻肝脏炎症.本文就CIK细胞在感染相关性疾病治疗中的应用作一综述.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)003【总页数】4页(P200-203)【关键词】细胞因子诱导的杀伤细胞;感染免疫;乙型肝炎;丙型肝炎【作者】张克新;王智刚;蒋敬庭【作者单位】苏州大学附属第三医院呼吸科,江苏常州 213003;苏州大学附属第三医院呼吸科,江苏常州 213003;苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R392.12细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK细胞)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子诱导培养增殖后获得的一异质性细胞群，兼具有T淋巴细胞的抗瘤活性以及天然杀伤(NK)细胞的非MHC限制性杀瘤优点[1]。
CIK细胞过继免疫治疗肿瘤可协助和增强其他治疗的效果，预防、延缓肿瘤的复发与转移，延长生存期，提高机体免疫力和患者的生存质量[2]。
此外，与用于过继免疫治疗的其他细胞相比，CIK细胞具有增殖速度快、抗肿瘤活性高和杀瘤谱广等优点。
随着CIK抗肿瘤作用机制的逐步明确，其临床应用也越来越广泛[3-9]。
CIK细胞识别肿瘤细胞后，除通过分泌穿孔素和颗粒酶、诱导肿瘤细胞凋亡等直接杀伤作用外，还可通过分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种细胞因子的间接途径杀伤肿瘤细胞，并可改善机体的免疫功能。
宫颈癌术后输注细胞因子诱导的杀伤细胞治疗前后外周血免疫指标的变化
宫颈癌术后输注细胞因子诱导的杀伤细胞治疗前后外周血免疫指标的变化赵花;刘征丽;许霞【摘要】Objective To observe the changes of immune parameters of patients with different cervical cancer treated with cytokine-inducedkiller(CIK) cells after radical hysterectomy in order to provide data for clinical evaluation.Methods 50 ml peripheral blood was collected the day before CIK cell therapy and after a course of treatment from ninety-eight radical hysterectomy patients (56 cases of squamous carcinoma,25 cases of adenocarcinoma,and 17 cases of adenosquamous carcinoma) treated in the Department of Gynaecology and Obstetrics and Department of Oncology between January 2014 and September 2016.According to the process of CIK cell therapy,the serum was separated,and the proportion of CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 、CD4/CD8 、and NK cells in the serum was analyzed using flow cytometry (FCM).Results 1.The proportion of CD3 + and NK cells in the 98 patients was increased after CIK cell therapy.The proportion of CD4 + and CD4/CD8 rose only in patients of squamous carcinoma and adenocarcinoma.The proportion of CD8 + did not change significantly.2.The result of CD3 + and NK cells suggested that after treatment the immune parameters in patients of adenocarcinoma were significantly higher than those in patients of squamous carcinoma and adenosquamous carcinoma (P ＜ 0.05).After treatment,CD3 + and NK cells increased from 60.71 ± 5.84 to 67.27 ± 3.04 and from 8.92 ± 3.64 to 12.93± 6.25 respectively in patients of squamous carcinoma,from 59.91 ± 2.49 to 68.32 ± 8.24 and from 9.04± 5.31 to 17.87 ± 6.46 respectively in patients of adenocarcinoma,and finally from 59.01 ± 5.90 to 65.23 ± 7.07 and from 59 ± 3.97 to 15.07 ± 2.71 respectively in patients of adenosquamous carcinoma.Conclusions CIK cell therapy can markedly enhance the immunity of patients after radical hysterectomy.It's of great significance for improving the quality of survival.%目的观察鳞癌、腺癌、腺鳞癌3种类型宫颈癌根治术后使用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)治疗前后外周血中免疫指标的变化,为临床使用CIK治疗宫颈癌效果评估提供依据.方法收集我院2014-01至2016-05肿瘤科和妇产科行宫颈癌根治术后患者98例(其中鳞癌56例,腺癌25例,腺鳞癌17例)CIK治疗前ld和治疗1个周期后的外周血各5 ml,收集的外周血按CIK细胞治疗流程进行血清分离,分离后的血清用流式细胞计数仪对血清中CD3+、CI4+、CD8+、CD4/CD8、NK细胞的比例进行检测分析.结果 (1)98例宫颈癌根治术后使用CIK细胞治疗前后外周血中免疫指标的对比显示CD3+、NK细胞的比例均升高,CD4+、CD4/CD8比例仅在鳞癌和腺癌中升高,CD8+治疗前后变化不明显.(2)以CD3+和NK细胞为例可以看出使用CIK细胞治疗后腺癌免疫指标较鳞癌、腺鳞癌有显著提升(P＜0.05),鳞癌治疗前后,CD3+:(60.71±5.84)/(67.27±3.04),NK细胞:(8.92±3.64)/(12.93±6.25);腺癌治疗前后,CD3+:(59.91±2.49)/(68.32±8.24),NK细胞:(9.04±5.31)/(17.87±6.46);腺鳞癌治疗前后,CD3+:(59.01±5.90)/(65.23±7.07),NK细胞:(8.59±3.97)/(15.07±2.71).结论 CIK细胞治疗可以显著提升宫颈癌根治术后患者的免疫功能,对延长生存期,提高生存质量具有重要意义.【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2017(028)004【总页数】4页(P358-360,363)【关键词】细胞因子诱导的杀伤细胞;宫颈癌;免疫指标【作者】赵花;刘征丽;许霞【作者单位】710054西安,武警陕西总队医院检验科;710054西安,武警陕西总队医院妇产科;710054西安,武警陕西总队医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R737.3宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,高发年龄为30～55岁，是我国女性生殖系统恶性肿瘤发生率最高的肿瘤 [1]。
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院 ， 北 襄 樊 ４ １ ０ ４ 惠 州 市 中 心 １０ １
【 要】 目的 ： 价 采 用抗 Ｃ ３单 抗 、 、Ｆ ７和 Ｉ一ａ四 因 子 培 养 体 系 体 外 培 养 细 胞 因 子 诱 导 的 杀 伤 细 摘 评 Ｄ Ｉ ２ ＩＮ一 Ｉ Ｌ１
１ ， 培养 前 扩 增 ４ ～ １ ０倍 （ 均 ９ ０） 较 ４ ４ 平 ８倍 ） 细 胞 存 活 率 超 过 ９ ； 有 免 疫 表 型 Ｃ ３ Ｃ ４ Ｃ ８ ， Ｏ 具 Ｄ 、 Ｄ 、 Ｄ 和 Ｃ ３ Ｄ Ｃ ５ 细 胞 的 平 均 值 分别 从 培 养 前 的 （ ０ ９ ． ） 、 ２ ． ±１ ７ 、４ ． ±３ ２ 、 １ ６ ． ） ０ 加 到 培养 第 Ｄ６ ５ ． ±３ ５ （ ９ ９ ． ） （ １ ３ ． ） （ ． ±０ ２ Ｖ 增 １ 天 的 （ ０ ２ ． ） 、 ４ ． ±５ ５ 、 ５ ． ±４ ９ 、３ ． ±４ ０ ／ 。结 论 ： 养 当 日加 抗 人 Ｃ ３单 抗 、 一 ａ ３ ９ ． ±１ ６ （ ０ ６ ． ） （ ２ ８ ． ） （ ３ １ ． ） ｏ ０ 培 Ｄ Ｉ １、 Ｌ
胞（Ｉ 细胞） ＣＫ 的效 果 。方 法 ： 集 ８例 难 治性 淋 巴瘤 患者 外 周 血 单 个 核 细 胞 培 养 ， 培 养 第 １天加 入 抗 人 Ｃ ３单 采 于 Ｄ
抗 、 重组 Ｉ一ａ人 重 组 Ｉ Ｎ ７ 第 ２天 加 人 人 重 组 Ｉ一 ， ３ 换 培 养 液 并 添加 人 重 组 Ｉ 一 人 Ｌ１、 Ｆ 一， Ｌ２每 天 Ｌ ２和人 重 组 Ｉ Ｎ ７以维 Ｆ 一 持其 浓 度 ， 养 １～ １ 培 ２ ４ｄ收 获 Ｃ Ｋ 细胞 。于 培 养 第 １４ ７ １ 、３天 进行 细 胞 计 数 ， Ｉ 、 、 、０ １ 于培 养 前 及 培 养 第 １ ３天测 定 细 胞 免 疫 表 型 。结果 ： 胞 因 子 共 刺 激 ３ｄ即 出 现 细 胞 集 落 ，３ｄ后 Ｃ Ｋ 细 胞 总 数 达 （ ～ １ ） １。 平 均 １． × 细 １ Ｉ ７ ８ × ０（ ２７
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细胞 因子诱 导 的杀 伤 细胞 体 外 培养 技术 的评价
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１ 北 京 军 区 总 医院 血 液 科 ， 京 １ ０ ０ ；． 汉 市 中 心 医 院 骨 科 ， 汉 ４ ０ １ ； ． 樊 市 中 医 ． 北 ０ ７０ ２ 武 武 ３０ ４ ３ 襄
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【 键 词 】 杀 伤 细 胞 ， 巴 因子 激 活 ； 养 技 术 ； 本制 备 关 淋 培 标
【 图分 类 号 】 Ｒ７ １；Ｒ７ ３ ４ 【 献 标 识 码】 Ａ 中 ４ ３． １ 文 【 章 编 号】 １） １１ ７ ２ ０ ） ２０ １— ４ 文 【 － １ Ｘ（ ０ ９ ０ １ Ｏ Ｏ Ｏ