细胞冻存复苏及腹水制备-LM

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干细胞冻存及复苏步骤

干细胞冻存及复苏步骤

干细胞冻存及复苏步骤
细胞冻存(缓存)
1、0.25%trypsin(或+0.02%EDTA)消化5min左右,镜下见细胞回缩间隙增大,即可
吹打脱落。

1、800r离心5分钟,2次(无EDTA,离心一次即可)
2、配制冻存液:甘油:血清:完全培养基=1:2:7
3、50ml培养瓶的细胞(约5×105),用1ml冻存液重悬细胞,放入冻存管中。

4、冻存步骤:4℃1h——-20℃1h——--80℃1h——- -196℃液氮冻存。

(冻存细胞程
序性降温,4℃放置时间40min以上,3h以内,-20℃对细胞损伤最大,1h左右为
宜。


细胞复苏(速溶)
冻存管直接投入37℃水浴,平摇直至融化,种于50ml培养瓶中。

根据细胞贴壁情况换液(一般24-36h换液)。

计算存活率
取一滴冻存细胞悬液,台盼兰染色,活细胞不上色,死细胞染成兰色,计算细胞存活率。

(细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100%。

细胞的冻存和复苏实验原理

细胞的冻存和复苏实验原理

细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞,以便以后使用。

此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。

细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。

首先,培养细胞是实验的第一步。

细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等,根据不同的细胞类型和需要,选取合适的培养基和条件进行细胞培养。

培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等,提供细胞生长所需的基础条件。

接下来,要准备细胞冻存液。

细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。

常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。

其中,冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子,血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等,可以提供细胞所需的生长因子;DMSO作为一种保护剂,可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。

然后进行细胞的冷冻。

将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基,然后加入适量的细胞冻存液,混匀后分装于冷冻管中,最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。

低温环境下,细胞的代谢活动明显减慢,可以有效降低细胞死亡率。

细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下,通常为-80或更低的温度。

在低温下,细胞的代谢活动几乎停止,能够大大延缓细胞的老化和死亡,从而实现长期保存。

冷冻保存期间,细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代,以防止细胞因冻结而受到损伤。

细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温,使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。

复苏过程中需要进行一系列的操作,其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。

一般情况下,将冷冻管放入37水浴中,然后缓慢将温度逐渐升高。

此外,为了减小细胞受到冻融损伤,可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中,将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。

总之,细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动,同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤,从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。

细胞的冻存及复苏PPT课件

细胞的冻存及复苏PPT课件
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冷冻保存方法
1.非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ~-80 ℃ ,然后直接投入液氮进行保 存;或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液,按一定的降温速率从室温降至1000C以下,再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率:在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说, 复温速度越快越好,速度过慢,细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂:可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度:能长期保存细胞的超低温度,在 此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止,但 经过长期保存,在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度(-196℃)是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率:慢冻 复苏速率:快融 冷冻保护剂:渗透性和非渗透性 冷冻保存温度:-196 ℃(液氮)
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于:一,可以减少 人力、经费投入,减少污染,减少细胞生物学特性变化; 二,有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前,动物细胞一般保存于液氮(-196℃)。
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细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输细胞株(系)的使用,为医学研究和测试工作带来了极大的方便。

但细胞的传代是有限制的,长期连续传代的细胞,不仅消耗大量的人力和物力,而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化,因而细胞失去原有的遗传特性,有时还会由于细胞污染而造成传代中断,种子丢失。

因此,在实际工作中常需冻存一定数量的细胞,以备替换使用。

细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。

细胞的冻存一、概述目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。

细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。

如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。

胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。

如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。

因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。

采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。

慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有35L3和50L3两种。

使用时要注意以下几点:(1)一般两周需充液氮一次,至少一个月充氮一次。

液氮温度达-19 6℃,使用时注意勿让液氮溅到皮肤上,以免引起冻伤。

(2)液氮容器为双层结构,中间为真空层,瓶口有双层焊接处,应防止焊接部裂开。

(3)在装入液氮时,要注意缓慢小心,并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导,使液氮直达瓶底,如有专用液氮灌注装置则更好。

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。

细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。

细胞冻存方法预先配制冻存液:20%血清培养基10%DMSO (二甲基亚砜)取对数生长期细胞1ml于冻存管中,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106—5×106细胞/ml),密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

慢冻程序标准程序(放哪里?)当温度在-25 ℃以上时,1-2 ℃/min当温度达-25 ℃以下时,5-10℃/min当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时,于-20℃放置1小时,通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口(-70℃),放置1小时,后直接投入液氮中(-196℃)细胞复苏方法从液氮中取出冻存管,迅速投入37℃水浴中,使其融化(1分钟左右)注意防护(冻存管爆炸)!5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。

注意事项:在使用DMSO前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。

高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。

在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。

细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

背景知识:细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。

原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容(操作步骤):一、材料(一)仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库:/yp/product-list-42.html(二)玻璃器皿1. 吸管(弯头、直头)2. 培养瓶3. 玻璃瓶(250ml、100ml)4. 废液缸(三)塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管(10ml)5. 15ml离心管6. 冻存管(1~2ml)(四)其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪(五)试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗(青霉素、链霉素)5. 胰蛋白酶(0.08%)6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油易生物试剂库:/yp/product-list-43.html二、操作步骤(一)细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm,5min;4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107 /ml;5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。

细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项

细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项

细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存:一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里,细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。

今天呀,我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿,这里面的门道可多着呢,就像走钢丝,容不得半点马虎。

一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一:前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前,得把“战场”布置好。

先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍,就像给它做个全面的SPA,确保里面一尘不染。

接着,打开水浴锅,把水温调到37℃,这温度可不能出差错,多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了,少一度就像是在冷水里打哆嗦,都不利于细胞恢复生机。

准备好相应的培养液,这就像是细胞的“营养套餐”,没它细胞可活不下去。

步骤二:复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候,感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。

那冻存管冻得直冰手,得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻,要不停地轻轻晃动,就像是在鼓励细胞:“小宝贝们,快快醒来啊!”这时候心里默默祈祷着,可别出啥岔子。

在小细胞们还迷糊着的时候,把它们转移到含有培养液的离心管里,离心的过程又像一场小小的筛选,把那些还没适应过来的杂质去除,留下顽强的细胞。

最后把细胞接种到培养瓶里,就像给它们安家落户啦,盼着它们在新家里茁壮成长。

二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一:选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。

一般是包括培养液、血清和保护剂(像是二甲基亚砜这类的神奇物质)。

血清就像保护层里的柔软衬里,给细胞温暖的呵护,而保护剂则像坚韧的外壳,防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。

这三者的比例得拿捏得死死的,就像厨师做菜时放盐的量,多一点少一点都不行。

步骤二:缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里,标记好细胞类型、日期等信息,这就好比给细胞上户口,省得以后找不到“人”。

然后要进行程序降温。

想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物,得一步步慢慢适应越来越冷的环境。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项|细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备:●细胞培养通风橱(即生物安全柜)●培养箱(通用推荐:湿式二氧化碳培养箱)●离心机●医用冰箱(4℃)和冰柜(-20℃)、生物超低温冰箱(-80℃)、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品:细胞培养容器(培养瓶、培养皿、多孔板等),吸管和移液器,培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域:细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态,最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基:商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌,注意操作过程中不要被污染,其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法(例如:高压蒸汽、无菌过滤等)进行灭菌。

●无菌操作:要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒;尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作,避免交叉污染;试剂瓶和培养用具使用时方可开盖,用后要第一时间盖上,暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要,需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌,包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存细胞复苏:在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下,需要进行细胞复苏:a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后,快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化(一分钟内)。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后,转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合,约800-1000rpm下离心5-10分钟,实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中,做好标记,37℃,5%CO2条件下培养。

细胞冻存:为现有细胞系做细胞储备,需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存:a)准备细胞冻存液,置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞,密度达到80%-90%左右,将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动,并在低温下保存,以便今后可以复苏和继续进行研究。

这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。

步骤:1.细胞培养和准备:选择合适的细胞培养基和培养条件,使细胞处于最佳状态。

2.冻存液制备:制备一种含有细胞生长因子、保护剂(例如DMSO或甘油)以及缓冲剂(例如BSA或EDTA)的冻存液。

3.细胞收集和离心:将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。

4.细胞冻存和保存:将收集到的细胞与冻存液混合,将混合液分装到冷冻管中,并在极低温下保存(通常为-80°C或液氮温度)。

复苏:1.细胞溶解和补充:将冷藏的细胞迅速解冻,并将其加入到预先准备好的培养基中。

2.培养和观察:将复苏后的细胞转移到培养皿中,并在适当的条件下培养。

观察细胞的生长和形态变化。

原理:细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。

冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤,防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。

细胞冷冻过程中,细胞内的水会形成冰晶,但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。

当细胞需要复苏时,通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中,细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。

注意事项:1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。

2.选择适当的冻存液和培养基,以确保细胞的最佳保护和生长条件。

3.控制冷冻和解冻速率,过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。

通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。

4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。

不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。

5.注明冷冻细胞的信息,例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等,以便于后续的管理和查询。

细胞复苏、传代、冻存过程

细胞复苏、传代、冻存过程

细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。

细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能,传代是将细胞进行繁殖,冻存则是将细胞保存在极低温下,以便长期保存和后续使用。

下面将详细讨论这些过程。

细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管:包含冻存细胞的管子•暖水槽:设置在37°C的恒温水槽内•柱塞:用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中,快速融化冰冻细胞。

2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。

3.加入预热的培养基,使细胞悬液与培养基充分混合。

4.将细胞培养皿放入培养箱中,维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。

5.定期观察细胞的生长情况。

细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿:含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下,观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞,移除老化细胞和细胞碎片。

3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。

4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。

5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。

冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿:含有生长的细胞•冻存液:包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器:用于储存冻存管的液体氮罐•标签:用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下,观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器吹洗细胞,并移除老化细胞和细胞碎片。

3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。

4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。

5.将混合液转移至冻存管中,并封闭管盖。

6.标记冻存管上的信息,包括细胞类型、传代数和日期。

7.将冻存管放入冷冻容器中,迅速冷冻至-80°C或更低温度。

细胞复苏的操作方法

细胞复苏的操作方法

细胞复苏的操作方法
细胞复苏是指将处于悬浮状态或冷冻保存状态的细胞,通过适当的处理方法,使其重新恢复到正常生长状态并继续进行繁殖和生长。

具体的操作方法如下:
1. 取出冷冻存储的细胞:将处于液氮存储罐内的细胞冷冻管快速放入预先准备好的70%乙醇中消毒,待消毒10秒后,取出放在无菌条件下的台面上。

2. 进行解冻处理:将细胞冷冻管立即放入预先准备好温水中,以室温解冻,每隔2-3分钟轻微摇晃管子,直到解冻完全,再立即将管子放到孵化箱内,避免冷冻时产生的压力冲击细胞,引起溶胞现象。

3. 处理细胞培养基:细胞培养基的PH值、温度、CO2浓度等条件需要顺应细胞情况逐渐恢复到正常生长状态,避免环境突变影响细胞的复苏和生长。

4. 加入细胞:将已解冻的细胞迅速转移到培养基中,先进行暴露5~10分钟,再进行转移至预处理好的细胞培养瓶中,尽可能使细胞均匀分散。

5. 稳定恢复期:转移后,避免环境的干扰干扰细胞的恢复稳定,维持细胞培养瓶内的清洁卫生环境,逐渐调节细胞培养的温度和CO2浓度,让其适应细胞定植状态,并逐渐达到正常的生长状态。

6. 定期观察:对于细胞进行定期观察,观察细胞的颜色、形态、大小等,以及
细胞繁殖情况、存活率等指标。

同时,还要注意细胞培养瓶内的清洁卫生环境,保证细胞的稳定生长和繁殖。

腹水的制备

腹水的制备

这里还有一个获得腹水经验性步骤,不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠,小鼠一定要健康。

2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠,1-2周后(我一般选用注射10天后的小鼠,不过注射3-4周后的小鼠仍可用)腹腔注射细胞。

3) 打腹水时,细胞要处于对数生长期,细胞数量过多过少都不好,我一般是注射10^6/鼠,每株杂交瘤打3只。

4) 约7天后,触摸小鼠腹部有肿胀感时,即可用16号针头采集腹水,针头刺入腹腔后,一般即有腹水喷出,若没有腹水流出,可轻旋针头,操作时要有耐心。

我每次可采集4-5ml 腹水/鼠,有时甚至可达6ml,隔天后再次采集,一般可采集三次左右,每只小鼠可采集十多ml腹水。

有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好(这也很烦)。

还有一点,采集用的针头要事先灭菌!小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同,有的注射后一周即死亡,有的会出现血性腹水,有的可以反复收取腹水2-3次。

我做过2种类别10株细胞的腹水,以下供参考:1、每组细胞准备2只小鼠,8-10周龄,最好与制备单抗的小鼠同系;接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂,可以用石蜡油(提前一周)或不完全弗氏佐剂(提前三天);2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方,如果出现腹水少、死得快的现象,则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方;注射细胞少腹水形成慢但效价会更高;3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况,如果活力佳,有明显移动性腹水,可以放腹水2次左右;一旦发现小鼠活动受限,要立即处死放腹水;4、一般每次可以收取2-3ml。

制备小鼠腹水细节剪刀剃毛,酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头,越细越好,减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可,但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛,在腹部中线旁刺入空隙,勿扎住内脏腹水采集分成两类:1:活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器(2-5ml)以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好,便于离心)。

细胞冻存、复苏及传代

细胞冻存、复苏及传代

细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液(10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷;
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时,用胰蛋白酶将细胞消化下来,1200 rpm离心,去上清;
3、加入PBS重悬细胞,以洗去残留的胰蛋白酶,1200 rpm离心,去上清;
4、加入1ml细胞冻存液重悬后,将细胞重悬液放入冻存管中,并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜,再转移至液氮中保存。

细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温,在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后,立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中,1200 rpm离心3 min,弃上清;
3、加入6ml培养基重悬细胞,并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养,贴壁12h后换液。

4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。

细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时,可进行传代。

2、弃上清,PBS洗2-3次,6cm(10cm)培养皿中加入600μl(800 μl)胰蛋白酶消化1-2min
后,在显微镜下观察细胞是否变成圆形,当细胞变成圆形后,应立即加入培养基终止消化,以免细胞消化过度。

3、1200 rpm离心3min,弃上清,加入1ml培养基重悬,将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。

细胞的冻存及复苏ppt课件

细胞的冻存及复苏ppt课件
在日常生活中,随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费,也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于:一,可以减少 人力、经费投入,减少污染,减少细胞生物学特性变化; 二,有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
要获得好的冻存与复苏效果,必须了解如下几 个问题:冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂,冷 冻保存温度。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率:降温的速度,直接关系到冷冻效果, 对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其 最适冷冻速率,以保证获得最高的冷冻存活率。
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冷冻速率:慢冻 复苏速率:快融 冷冻保护剂:渗透性和非渗透性 冷冻保存温度:-196 ℃(液氮)
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细胞冻存与复苏的关键因素 复苏速率
复苏速率:在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说, 复温速度越快越好,速度过慢,细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生。

细胞冻存和复苏标准操作规程

细胞冻存和复苏标准操作规程

细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识:细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。

原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

一、材料(一)仪器1. 净化工作台,2. 离心机,3. 恒温水浴箱,4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃),5. 倒置相差显微镜,6. 培养箱,7. 液氮冰箱(二)玻璃器皿1. 吸管(弯头、直头),2. 培养瓶,3. 玻璃瓶(250ml、100ml),4. 废液缸(三)塑料器皿1. 吸头,2. 枪头,3. 胶塞,4. 移液管(10ml),5. 15ml离心管,6. 冻存管(1~2ml)(四)其他物品1. 微量加样枪,2. 红血球计数板,3. 记号笔,4. 医用橡皮膏,5. 移液枪(五)试剂1. D-Hanks液,2. 小牛血清,3. 培养液,4. 双抗(青霉素、链霉素),5. 胰蛋白酶(0.25%),6. 1NHCl,7. 7.4%NaHCO3,8. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油二、操作步骤(一)细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm,5min;4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/ min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。

一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法与流程

一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法与流程

本发明涉及细胞保护液技术领域,特别涉及一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法。

背景技术:细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

细胞株的冻存和复苏是细胞生物学最常见的实验技术之一,广泛应用于生命科学和医学的各项科学研究或技术应用中。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,在需要的时候又可以再复苏细胞用于实验。

而且,冻存一定量的细胞,可防止因正在培养的细胞被污染或其他原因而使细胞丢种,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存的关键是向培养基中加入冷冻保护剂,一般常用二甲基亚砜(dmso),使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。

常用的细胞冻存液的配方有:传统细胞冻存液的配制比例主要为30%的血清+60%的细胞培养基+10%dmso;而融合瘤细胞、淋巴细胞一般采用90%细胞培养基+10%dmso等。

dmso此类渗透性保护剂,可以有效减少冻存过程中冰晶形成对细胞的损伤。

但是,复苏过程中冻存液里的dmso和复苏后细胞培养基里的残留dmso往往对细胞会有一定的毒性作用,影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展复苏过程中冻存液里的dmso和复苏后细胞培养基里的残留dmso往往对细胞会有一定的毒性作用,影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展。

另外有些重要的细胞对于dmso非常敏感(造血干细胞、原代培养神经细胞等),使用含dmso的细胞冷冻液可能会影响细胞的功能。

更重要的是,随着临床上细胞疗法使用的逐渐增加,dmso的潜在毒性如引起dna突变、蛋白变性等,可能带来dmso冻存的细胞在临床应用中的副作用,如腹泻以及神经系统、呼吸系统等组织损伤。

由于在冻存液中,dmso的浓度为10%;复苏后,如不进行离心处理除去dmso,而直接使用培养瓶或培养板培养细胞,残留的dmso浓度也达到1%-3%;为降低dmso的毒性,通常采用降低冻存液中dmso的含量以及复苏后洗涤离心除去dmso残留这两种办法。

腹水瘤细胞制作步骤

腹水瘤细胞制作步骤

文献一:鞘内注射U0126 对骨癌痛大鼠痛行为学的影响Walker256 细胞腹水传代:1、将冻存于液氮中的Walker-256 细胞37℃水浴复苏后2、以Hank’s 液洗涤3 次3、细胞计数后,取0.5 ml(约1×107肿瘤细胞)种植于大鼠腹腔。

4、饲养7-14 d,大鼠可出现大量腹水(50-150 ml)。

建立大鼠骨癌痛模型:1、收集肿瘤细胞(大鼠腹水肿瘤细胞)2、用Hank’s 液洗涤3 次3、在血球计数板上计数,收集细胞浓度约2×107/ml。

4、细胞悬液置于冰袋上直至接种到大鼠体内,注射入大鼠胫骨内肿瘤细胞混悬液容积为5μl,约1×105细胞。

文献二:大鼠骨癌痛模型的建立及其脊髓GFAP表达水平的变化试验步骤(大鼠胫骨癌痛模型制作)瘤株:Walker256细胞,来源于wista大鼠乳腺癌腹水瘤细胞,购于中国医学科学院药物研究所1、WaIker256肿瘤细胞的准备:取一支保存在液氮中的WaIker256大鼠乳腺癌细胞,迅速放置37。

水浴中快速摇动,解冻为液体后移至离心管中,1200转/分离心3分钟,弃上清液,加少量生理盐水混匀冲洗沉淀,1200转/分离心3分钟,弃上清液,加0.5ml的生理盐水并用枪混匀。

将1只重70一80g雌性wista大鼠络合碘消毒腹部后,腹腔注射上述制备的0.5m1 waIker256肿瘤细胞悬液(约2x107ells/ml)。

将大鼠放回动物房正常饲养6一7天后,大鼠腹部明显彭隆。

无菌抽取大鼠腹水2ml,1200转/分离心3分钟,弃上清液,加少量生理盐水混匀冲洗,1200转/分离心3分钟,弃上清液,加适量生理盐水显微镜计数,按照所需浓度稀释,制成2 x 104cells/ul的walker256肿瘤细胞悬液,并置于冰上保存。

上述操作均在超净台中进行;2、将1只正常的重70一80g雌性wista大鼠络合碘消毒腹部后,腹腔注射生理盐水20ml,轻柔按摩腹部,使生理盐水与腹腔中的细胞充分混匀后,抽取腹水2ml,参照步骤1,12oorpm 离心3分钟一生理盐水冲洗反复2次后,按照步骤1的稀释比例制备成不含肿瘤细胞的大鼠腹水,置于冰上保存,以制备Shaml。

培养细胞的冷冻保存与复苏原理及注意事项

培养细胞的冷冻保存与复苏原理及注意事项

培养细胞的冷冻⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,他们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。

接下来的重大进展是Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。

他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。

冷冻理论后来得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及Smith(1961)等学者的继续和发展。

1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。

Lovelock(1959)等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO)。

而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。

目前,无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。

冷冻保存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。

水在低于零度的条件下会结冰。

如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。

这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。

如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。

如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。

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2013-5-23
三,贴壁细胞的消化:
1,吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一 次,以去除残余的血清。 2,加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,室温放置30秒至2分钟。 3,显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细 胞的形态发生明显的变化;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打
下来,此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶(竞争
抑制),吹打下细胞,即可直接用于后续实验。 4,如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化。
5,如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接
从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来, 1000-2000r离心1min,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完
的首选方法,一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。
三,腹水产生的原因:
1,杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后,大量肿瘤细胞在腹腔
中生长,分泌很多刺激性的因子,胶体渗透压升高,导致 腹水产生。 2,杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激,引起炎症反应导 致腹膜上的毛细血管通透性增加,体液漏出,形成腹水 。
四,液体石蜡的作用:
1,饲养细胞有污染却没有发现。 2,细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3,操作过程存在污染。 4,没有更换枪头,导致交叉污染。 5,没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。
四,细胞复苏的注意事项:
1,所用器材经过高压处理,培养基和血清是新的。
2,整个过程保证无菌操作。
3,复苏的关键是速融,一般在1min内。
接种小鼠腹腔 抽取腹水
腹水纯化标记
单抗鉴定
项目组进行评价
我们主要制备的腹水有三类:
1,研发性:即小样,要求注射两只小鼠,至少5ml腹水。
2,中 样:从小样里面筛选出来的细胞株,一般要求5只。
3,生产性:供应生产用的腹水。 腹水制备的原则:保质保量! 对我们的要求:必须要有高度的责任心。
二,为什么要制备腹水?
会太忙。假期前要合理规划复苏时间,不要留太多, 一个制备周期大概就是20天左右。
第三章,细胞的培养和消化
一,细胞培养的概念及生长方式
二,细胞的常见污染及处理
三,细胞的消化
四,细胞培养的注意事项
一,细胞培养的概念: 把来自机体的组织经分散成为单个细胞,放在体外
模拟体内的生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养
个人操作对腹水产量有影响,因此尽可能熟练掌握, 抽的又快又多。
抽取腹水时的注意事项:
1,抽取时机的把握,一周左右肚子明显胀大或者发黑。
2,抽取时应该轻柔,特别是第一次。 3,抽取部位不能太靠近大腿,否则伤口难以愈合。 4,研发性抽取时不要弄乱注射器,避免交叉污染,及时记录。 5,每次抽取前后吹打干净针头,防止堵塞。
二,制备适量的饲养细胞
确定完复苏的细胞数量后就要准备饲养细胞,一般一只 小鼠的饲养细胞可以配置100mlDMEM培养基,根据细胞数量 的多少确定小鼠的数量,加样备用。目前,一般情况24孔板 1.5ml/孔,6孔板5ml/孔,大平皿30ml/板。
注意事项:
1,培养液和血清必须用新的,并记录批号。
2,制备过程严格无菌操作。
1,免疫抑制剂,注射石蜡油(降植烷和不完全福氏佐剂)
可以降低小鼠的免疫力, 从而降低小鼠对接种的杂交瘤细胞
的排斥反应; 2,石蜡(降植烷、不完全福氏佐剂)可以强烈刺激小鼠产 生白细胞介素6(IL-6),IL-6是最重要、最主要的浆细胞 (成熟的抗体分泌细胞)生长因子,因此注射上述几种物质
都可以通过刺激IL-6的产生,为接种的杂交瘤细胞提供较
丝状菌污染的污染
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二,细胞培养的污染
支原体污染
培养细胞受支原体污染后, 部分敏感细胞可见细胞生长增殖 变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱 落。但多数细胞污染后无明显变 化,或略有变化,若不及时处理 ,还会产生交叉污染。
阳性 支原体污染检测 阴性
二,细胞培养的污染
病毒污染
尽管病毒污染的细胞不 影响原代培养,但生产疫
3,第二天确定没有污染后方可使用。
三,细胞的复苏
1、将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温,回温后以75%酒精消毒,移 入无菌操作台内。 2、取50ml离心管,加入细胞冻存前所用基础培养液5ml。 3、根据复苏申请单,由细胞管理员将细胞从液氮中取出,细胞使用人核 对后,立即放入37 ℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1min内全部融
全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验。
四,细胞培养时的注意事项:
1,要定期观察细胞的状态,发现问题及时处理,切忌将
细胞弃之不顾。
2,不能频繁将细胞拿进拿出,会影响细胞的生长。 3,不能频繁更换培养基,细胞生长有一个适应过程。 4,必须更换培养基时应严格无菌操作,避免交叉污染。 如液体变黄,死细胞过多等原因可考虑换液。 5,培养基应该做到专人专用。 6,发现细胞污染后需要及时处理,避免传染。
吹打细胞时注意事项:
1,动作轻柔,不能溅到其他孔中 2,细胞时被吹掉的而不是被划掉的,不能留死角 3,及时更换枪头,避免交叉污染 4,及时在离心管上写上细胞信息。
生理盐水洗细胞时注意事项:
1,盖子要对号入座,避免交叉污染。 2,加生理盐水时应悬空,不能回溅到枪头上污染整瓶生理盐水
二,小鼠的选择
小鼠的选择很研发重要,不仅关系到腹水的数量还 关系到质量,研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠,
目前,大量生产单抗的方法主要有两种:
1,体外培养法,从上清中获取单克隆抗体 (1)悬浮培养法:
和常规静置培养相比,增加了细胞生长空间,使单位体积内细胞数量
增多,从而增加抗体量。 (2)固相培养法: 单层培养和悬浮培养的结合,主要用于贴壁性较强的杂交瘤细胞,以 小的固体颗粒作为细胞生长的载体,细胞固定在载体表面生长。 体外培养法优点:工艺简单,易于控制,目前上市的单抗多用此法。 体外培养法缺点:抗体浓度低,一般含量为200~500μ g左右。
腹水制备操作 技能与注意事项
LM
第一章,认识我们的工作
一,我们的主要工作是什么 二,为什么要制备腹水 三,腹水产生的原因 四,为什么要注射石蜡
立项
购买抗原或提取抗原
免疫小鼠
一 腹 水 制 备 组 的 主 要 工 作
制备饲养细胞
解冻NS1
检测效价
融合
检测抗体
三次克隆化 7-10天前注射液体石蜡 扩大培养 冻存细胞 复苏并培养
条件下,使之不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的 生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养的培养物可以 是单个细胞(称为克隆培养),也可以是细胞群(称为 群体培养)。见下图:
概述
群体培养
克隆培养
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细胞的生长方式:
(1)贴附生长: 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 (2)悬浮生长: 于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。见于 各种造血系统肿瘤细胞。
化,以75%酒精消毒?,移入无菌操作台内。
4、取出复苏细胞悬浮液,缓缓加入已准备的培养液中,混合均匀后, 1500rpm离心5min。 5、将离心管取出,弃去上清,用含血清培养基重悬后,加入6孔板或小号 平皿中,观察细胞复苏时状况并记录,37℃ 5%CO2培养。 6、次日观察有无污染。
以下原因可能导致复苏失败:
4,及时更换枪头,避免交叉污染。
5,及时记录细胞的名称及其编号批号,切忌弄混。
6,复苏完毕后重新核实复苏的细胞名称和编号批号。 7,填写复苏记录表。
细胞复苏时机的选择:
平时一般选取在周五,原因:一般情况周五复苏 后下周一会有一半细胞可以注射小鼠,一般三四天可
以全部注射完,7天后的周一开始抽取,这样周末就不
注射0.2ml。注射完毕后要及时把项目名称和编号及注
射时间记录到笼子上面。 注意事项: 1,细胞数量和状态 2,细胞不能注射到皮下 3,笼子上细胞信息要完整 4,填写注射记录
四,腹水的抽取
注射完细胞一周左右时间 会长腹水,一般第六天
就需要观察,防止胀死。小鼠腹腔明显胀大或者发黑
就必须抽取,但首次抽取应该轻柔,不能抽取过度。
第四章,腹水的制备
一,细胞的准备
二,小鼠的选择
三,细胞的注射
四,腹水的抽取
一,细胞的准备: 细胞复苏后要密切关注其生长状态,一般要求注射
数量为(5-10)×105个/只,研发性细胞要求超过3/4
孔注射两只。注射的细胞要求状态良好,处于对数期, 细胞又圆又亮。 经验:一般情况下一批细胞复苏后两天就可以注射 总数的一半,三天后注射剩下的一半,7天内基本可以 全部注射。如果发现细胞聚堆现象要轻轻吹开,状态不 好的细胞要换液并且加饲养细胞,但操作要轻柔。
6,发现针头变钝要及时更换。
7,倒腹水时看清楚,不能倒乱,不能倒进去沉淀。 8,抽取大样最好更换手套。
一,确定复苏的细胞数
二,制备适量的饲养细胞
三,细胞的复苏
四,细胞复苏的注意事项
一,首先确定复苏的细胞数
1,比较紧急的项目
对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急,
紧急的项目要随时准备复苏。例如,目前紧急的有肿瘤系列
细胞如CA153CR,CA724,colo205等。中样腹水一般由领
导直接下单子。 2,根据实际情况自行安排 一般按项目进行复苏,先紧同一个项目复苏,切忌不要同 时复苏多个项目,这样容易弄乱,并且交接时比较麻烦。
全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验。
三,贴壁细胞的消化:
1,吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一 次,以去除残余的血清。 2,加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,室温放置30秒至2分钟。 3,显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细 胞的形态发生明显的变化;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打
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