体外正常成人肝细胞分离培养的经验
肝脏细胞在体外培养技术的研究
肝脏细胞在体外培养技术的研究肝脏是人体最重要的器官之一，其主要功能是解毒、代谢、贮藏和合成。
然而，肝脏疾病在世界范围内仍然是一个重要的公共卫生问题。
在过去几十年中，肝脏细胞在体外培养技术的研究逐渐成为了一项重要的生物医学研究领域。
这项技术是指从人体肝脏中分离出来的肝细胞，通过外界提供的营养条件，使其在体外继续生长和分化。
这项技术不仅有助于深入了解肝脏生理学和疾病发生机制，还可以用于药物筛选、毒理学研究和肝移植等领域。
然而，肝脏细胞在体外培养的难度很大，一方面是因为肝脏细胞在体外容易失去其功能和特性，另一方面则是由于肝脏细胞的可塑性非常弱。
因此，如何在体外培养肝脏细胞，并保持其结构和功能的完整性成为了研究的重点。
从组织学角度来看，肝脏的结构非常复杂。
肝脏由肝小叶组成，每个肝小叶包含数百万个肝细胞、肝窦和肝管。
肝细胞没有直接连接，而是通过肝窦相连。
这样的结构能够使肝细胞与血液接触，从而能够达到解毒和代谢的作用。
因此，要在体外培养肝脏细胞就需要考虑如何模拟肝脏这种结构。
在研究中，肝细胞常用的培养基是DMEM/F12(1:1),其中DMEM包含了必需的氨基酸、糖类和维生素，而F12则富含微量元素。
为了模拟肝脏的组织结构，可以使用3D培养体系，如细胞聚集体、生物支架和生物芯片等。
这些3D培养体系可以更好地模拟肝小叶和肝窦之间的关系，从而提高肝细胞在体外培养中的生存率和功能表现。
其中，生物支架是一种被广泛使用的3D培养体系，它可以提供一种类似于肝窦的微环境，并通过支架对肝细胞进行定位和定向生长。
生物芯片则是一种新型的3D培养系统，基于微流体和微加工技术，能够在非压力、低剪力的微环境下培养肝细胞。
使用这种技术，可以更精确地调控细胞生长的微环境，从而获得更稳定的结果。
除了3D培养体系之外，肝细胞在体外培养中的质量管理也非常重要。
在这方面，正常的肝细胞生态系统、细胞密度、超生和梯度离心等操作都会对细胞的品质产生重要影响。
人肝细胞的分离_培养和冻存
metastases:acomparisonofinterstitiallaserphotocoagulation(ILP )and percutaneousalcoholin jection (PAI ).ClinRadiol,1993;48(3):166-171.(收稿日期:2004-09-18)・综述・人肝细胞的分离、培养和冻存李 涛 彭志海 摘要 人肝细胞是生物人工肝的最理想细胞来源,决定其治疗效果。
本文就人肝细胞分离、培养及冻存进行综述。
关键词 生物人工肝 人肝细胞 分离 培养 冻存作者单位:200080上海,上海市第一人民医院普外科 进展期肝功能衰竭(advancedacuteliverfailure )唯一证明有效的治疗措施是急诊肝移植(livertrans 2plantation,LT )[1]。
然而,许多患者却由于供肝的严重缺乏而在等待中死去。
这促使了研究者对肝功能支持研究的兴趣。
理想的肝功能支持可以使患者成功的桥接(bridge )肝移植或者使患肝得以再生恢复[2]。
作为一种替代疗法,一个桥接设备可以像肾透析一样为衰竭的肝脏提供长期的支持[3]。
在生物人工肝中(bioartificialliver,BAL ),患者的血浆循环通过体外的生物反应器,该反应器装载有具有生物合成、解毒和生物转化功能的肝细胞,从而发挥肝功能支持作用。
人原代肝细胞可以提供大部分肝功能,因此是生物人工肝中最理想的肝细胞来源。
本文主要对人肝细胞的分离技术、培养方法及冻存研究进展作一综述。
1.人肝细胞的分离人肝细胞主要来源于外科切除标本及由于严重脂肪变性或者肝硬化而遗弃的供肝[4～8,22,24]。
与脂肪肝相比,肝硬化肝分离的肝细胞产量及活性均低,但肝细胞的安定代谢功能却没有差别[8]。
目前广泛应用的人肝细胞分离技术是Seglen [9]创立的胶原酶两步法灌注分离技术。
简述如下:对于整肝灌注,通过门静脉插管并固定;而对于肝段,则通过切面主要血管开口插管,其他血管结扎以防漏液。
Kupffer细胞分离培养
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
非肝细胞SIP离心准备SIP Nhomakorabea心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HyClone）。
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(二)
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(二)肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程一、引言肝脏是人体重要的器官之一，肝细胞的研究对于治疗肝疾病和药物研发具有重要意义。
体外扩增培养肝细胞是研究肝脏生物学和药物代谢的关键步骤。
本文将详细介绍肝细胞的体外扩增培养方法及其应用与流程。
二、肝细胞体外培养方法1.培养基的配制•配制DMEM/F12基础培养基，并加入胎牛血清（FBS）和抗生素。
•应用无菌操作将培养基放置在培养瓶中，密封保存。
2.肝细胞的分离和培养•将新鲜动物肝脏取出，迅速放入含有DMEM/F12培养基和酶的培养皿中。
•利用离心等步骤，轻轻将肝组织分离成单个肝细胞。
•将分离的肝细胞转移到培养瓶中，加入预先配制好的培养基。
•将培养瓶放入恒温恒湿的培养箱中，经过适当时间的培养，肝细胞会开始扩增。
三、肝细胞体外扩增培养的应用1.药物代谢研究•体外培养的肝细胞可以用于评估药物的代谢途径和代谢产物。
•利用体外扩增培养的肝细胞，可以进行药物代谢动力学研究，了解药物在人体内的代谢速率和排泄途径。
2.肝脏疾病研究•体外培养的肝细胞可以用于研究肝脏疾病的分子机制和新药的筛选。
•通过体外培养，可以模拟肝脏疾病的环境，从而寻找有效的治疗方案。
四、肝细胞体外扩增培养的流程1.准备工作•配制培养基和相关试剂。
•检查培养设备和器具的无菌状态。
2.肝细胞的分离•使用无菌操作，将肝脏取出并分离。
•利用酶的作用，将肝组织分离成单个肝细胞。
3.培养肝细胞•将分离的肝细胞转移到培养瓶中，并加入培养基。
•将培养瓶放入培养箱中，提供适当的温度和湿度。
4.培养细胞的维护•定期更换培养基，以提供养分和生长因子。
•检查细胞的健康状态和扩增情况。
5.应用与研究•根据需要，将培养的肝细胞用于药物代谢研究或肝脏疾病模型的建立。
•分析和记录实验结果，并进行相应的数据处理和统计分析。
五、结论通过体外扩增培养肝细胞，可以为肝脏相关研究提供重要的实验材料和平台。
人类肝细胞的分离与培养技术
人类肝细胞的分离与培养技术随着生命科学的发展和进步，肝细胞的分离和培养技术在医学领域中越来越重要。
肝细胞作为机体内代谢和解毒的重要器官，它的功能对于人体的健康具有至关重要的影响。
因此，肝细胞的活体分离和培养技术是研究肝脏生理、病理机理及其相关疾病的重要手段之一，也是研发肝药和治疗肝病的重要基础。
一、肝细胞的分离技术1.灭菌准备分离和培养肝细胞必须有高质量的培养基和相关配件，因此必须进行严格的灭菌准备工作。
需要准备无菌离心管和培养皿、无菌试管、无菌针头等，以保证分离后的肝细胞有良好的生长环境。
2.胶原酶消化胶原酶是一种生物碱性蛋白酶，它可以使肝细胞在本身结构上受到的伤害最小，分离出的细胞也更加健康、完整。
使用胶原酶消化，可以将肝脏组织中的各类细胞分离出来，与此同时，有的组织中存在黏性蛋白质，加胶原酶后，可以有效地降低分离的黏性蛋白质含量，使其在分离过程中保持较好的完整性。
3.密度梯度离心密度梯度离心是将分离出来的细胞通过离心机离心处理，得到纯化的细胞组织。
将经胶原酶消化的混合细胞悬液注入含有石蜡或离子聚合物化合物的密度梯度管中，通过逐层离心，不断离心分离出不同密度的细胞。
二、肝细胞的培养技术肝细胞的分离与培养是肝研究的重要手段之一，为了成功地分离和培养肝细胞，还需要具备有效的培养技术。
以下是几种比较常见的肝细胞培养技术。
1.原代细胞培养原代细胞培养即从肝脏中取出肝细胞，以生理盐水或PBS等缓冲液洗涤去除血液和淋巴细胞，将肝组织制成细胞悬浮液，然后将细胞悬浮液转移到含有血清的培养基中培养。
初期内，细胞只能在特殊的培养条件下存活，随着时间的推移，细胞的生长速度会逐渐加快，直到与原始肝细胞达到一致。
2.选循环细胞培养选循环细胞培养技术是将同样的原代肝细胞在培养后进行染色体检测，并筛选出较好的染色体数量的细胞进行扩增。
通过筛选出的具有较好生长速度和菌礼细胞染色体形式的细胞进行扩张和培养。
3.分化诱导培养分化诱导培养技术是将原代肝细胞和不同化学物质进行共培养，从而使肝细胞分化为肝小叶细胞或胆汁细胞，为肝细胞研究提供了更加相应的模型。
人工肝治疗的临床实践与研究进展
人工肝治疗的临床实践与研究进展韩涛，张倩南开大学人民医院，天津市人民医院消化（肝病）科，天津 300121通信作者：韩涛，****************（ORCID： 0000-0003-4216-6968）摘要：人工肝支持系统是治疗肝衰竭的重要方法之一，近年来非生物型人工肝在肝衰竭救治中的作用越来越受到认可，在非肝衰竭疾病中的应用也日益广泛。
临床上需要综合多种因素，合理选择非生物型人工肝治疗的时机及模式，规范化、个体化、精准化治疗及不同模式的优化组合是人工肝临床应用的趋势。
生物型人工肝有关种子细胞来源、生物反应器等关键技术不断完善，且部分已经进入临床试验阶段。
尽管人工肝治疗的临床实践与研究已取得很大进展，但仍面临不少挑战。
如何通过技术创新与优化组合进一步提高其疗效与安全性，如何通过高质量的临床试验获得更高级别循证医学证据，仍是目前亟需解决的难题。
关键词：肝，人工；肝功能衰竭；治疗学Clinical practice and research advances in artificial liver support therapyHAN Tao，ZHANG Qian.（Department of Gastroenterology and Hepatology，Tianjin People’s Hospital，Tianjin Union Medical Center Affiliated to Nankai University， Tianjin 300121， China）Corresponding author： HAN Tao，****************（ORCID： 0000-0003-4216-6968）Abstract：Artificial liver support system is one of the important therapies for liver failure， and in recent years， the role of non-bioartificial liver support system in the treatment of liver failure has been gradually recognized， with wide application in non-liver failure diseases. In clinical practice，various factors should be considered to reasonably select the timing and mode of non-bioartificial liver support therapy，and standardized，individualized，and precise treatment and optimal combination of different modes are the trend of the clinical application of artificial liver support therapy. There have been constant improvements in the key techniques of bioartificial liver support system such as seed cell source and bioreactor， and some of them have entered the stage of clinical trial. Although remarkable progress has been made in the clinical practice and research of artificial liver support therapy，there are still many challenges，and it is urgently needed to solve the problems of how to further improve its efficacy and safety through technological innovation and combination optimization and how to obtain higher-level evidence-based medical evidence through high-quality clinical trials.Key words：Liver， Artificial； Liver Failure； Therapeutics肝衰竭是临床常见的因肝功能严重损伤引起的危重症，尤其是急性（亚急性）肝衰竭和慢加急性肝衰竭，病情进展快，病死率高。
人肝细胞的分离_培养和冻存
metastases:acomparisonofinterstitiallaserphotocoagulation(ILP )and percutaneousalcoholin jection (PAI ).ClinRadiol,1993;48(3):166-171.(收稿日期:2004-09-18)・综述・人肝细胞的分离、培养和冻存李 涛 彭志海 摘要 人肝细胞是生物人工肝的最理想细胞来源,决定其治疗效果。
本文就人肝细胞分离、培养及冻存进行综述。
关键词 生物人工肝 人肝细胞 分离 培养 冻存作者单位:200080上海,上海市第一人民医院普外科 进展期肝功能衰竭(advancedacuteliverfailure )唯一证明有效的治疗措施是急诊肝移植(livertrans 2plantation,LT )[1]。
然而,许多患者却由于供肝的严重缺乏而在等待中死去。
这促使了研究者对肝功能支持研究的兴趣。
理想的肝功能支持可以使患者成功的桥接(bridge )肝移植或者使患肝得以再生恢复[2]。
作为一种替代疗法,一个桥接设备可以像肾透析一样为衰竭的肝脏提供长期的支持[3]。
在生物人工肝中(bioartificialliver,BAL ),患者的血浆循环通过体外的生物反应器,该反应器装载有具有生物合成、解毒和生物转化功能的肝细胞,从而发挥肝功能支持作用。
人原代肝细胞可以提供大部分肝功能,因此是生物人工肝中最理想的肝细胞来源。
本文主要对人肝细胞的分离技术、培养方法及冻存研究进展作一综述。
1.人肝细胞的分离人肝细胞主要来源于外科切除标本及由于严重脂肪变性或者肝硬化而遗弃的供肝[4～8,22,24]。
与脂肪肝相比,肝硬化肝分离的肝细胞产量及活性均低,但肝细胞的安定代谢功能却没有差别[8]。
目前广泛应用的人肝细胞分离技术是Seglen [9]创立的胶原酶两步法灌注分离技术。
简述如下:对于整肝灌注,通过门静脉插管并固定;而对于肝段,则通过切面主要血管开口插管,其他血管结扎以防漏液。
肝脏细胞在体外培养过程中消长变化的探索_田三德
l.2陕西科技大学学报A pr.2009 V ol.27JOU R N AL O F SH AA N XI U N IV ERSIT Y OF SCI EN CE&T ECH NO L OG Y#54# *文章编号:1000-5811(2009)02-0054-04肝脏细胞在体外培养过程中消长变化的探索田三德,吴艳娜,刘娜(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021)摘要:为获得长期存活的肝细胞,采用肝细胞组织块培养法和肝细胞直接分离培养法分别培养雄性幼龄、壮龄、老龄小鼠肝细胞,结果证明这两种方法均能够成功地培养出原代肝细胞,通过比较发现对雄性壮龄小鼠肝细胞直接分离培养法较适合于体外原代培养,实验得到最佳的培养基础体系为:培养温度37.0e,胰蛋白酶用量20.0mL,消化时间15.0min,雄性壮龄小鼠(20.0~25.0g).关键词:小鼠;肝细胞;体外培养中图分类号:Q813.11文献标识码:A0引言肝细胞是肝脏最主要的实质细胞类型,完成肝脏的绝大部分功能.肝细胞的体外培养对于研究肝细胞的功能与细胞因子的作用、观察药物的代谢和致癌性以及构建生物人工肝均具有十分重要的意义,但该技术需要一定数量和功能完备的肝细胞体外存活生长[1-4].为获得长期存活的肝细胞,本实验分别采用不同的培养方法对原代肝细胞进行了长期培养,并观察了其形态学和功能变化过程.1材料与方法1.1实验动物小白鼠,品系SD,体重:雄性幼龄(4~5g),壮龄(20~25g),老龄(30~35g),购于西安交通大学医学院.1.2实验试剂PBS缓冲液,0.25%胰蛋白酶液,pH调整液,糖原染色液,台盼蓝染色液,吉姆萨染色液,RPM I1640培养液[3-5].1.3培养方法1.3.1肝细胞的组织块培养法(雄性老龄,壮龄,幼龄)取一只小鼠,称量体重,将其引颈处理后固定解剖,取出肝脏,放入无菌平皿中后移至无菌工作台,用PBS缓冲液冲洗肝脏,将血块及其它杂质等剔除,清洗3次,然后将肝脏剪成1~2mm3左右,用镊子夹住组织块,放入培养瓶的盖玻片上,摆放整齐.静置30min,使其能更好的贴壁,加入2mL新鲜培养液后于37e恒温箱内培养.用糖原染色法鉴定肝细胞,并且每天更换培养液及进行细胞计数,测定旧培养液的pH值.1.3.2肝细胞的直接分离培养法(雄性壮龄,幼龄)取一只小鼠,称量体重,将其引颈处理后固定解剖,取出肝脏,放入无菌平皿中后移至无菌工作台,用*收稿日期:2008-12-28作者简介:田三德(1954-),男,陕西省咸阳市人,教授,研究方向:食品生物技术和细胞工程第1期田三德等:肝脏细胞在体外培养过程中消长变化的探索PBS 缓冲液冲洗肝脏,将肝脏剪成小块,放入无菌研钵中研磨,研磨好后加入15.0m L(壮龄)或5.0mL (幼龄)0.25%胰蛋白酶液,然后倒入无菌三角瓶内(含玻璃珠),将三角瓶封口后放入37.0e 恒温水浴锅内消化20.0m in(壮龄)或5.0min(幼龄),消化时振荡3~5次.消化好后,加15.0mL(壮龄)或5.0mL (幼龄)含血清培养液终止消化,再加培养液至45mL(壮龄)或40mL(幼龄),用三层纱布过滤,滤液用吸管反复吹打,使肝细胞在溶液内分散开来,然后进行细胞计数.加培养液调节细胞悬液密度(1@105~0.5@106个/m L),之后计算细胞存活率,然后分装细胞悬液,每2.0mL 分装,于37.0e 恒温箱内培养.用糖原染色法鉴定肝细胞,并且每天更换培养液、细胞计数、测定旧培养液的pH 值.1.4 指标鉴定(1)肝细胞形态学观察[6]:采用吉姆萨染色后用电镜观察.(2)肝细胞的鉴定[7]:采用糖原染色法.(3)活细胞率的确定[8]:采用台盼蓝拒染法.2 结果与讨论2.1 组织块培养法2.1.1 组织块培养法(雄性老龄)图1 老龄小鼠组织块培养法(a)和壮龄小鼠组织块培养法(b)培养结果由图1(a)可以看出:采用组织块培养法培养雄性老龄小鼠肝细胞在5天的培养周期内会有一个明显的增殖、衰减过程.细胞在经过1天左右的适应期后便开始迅速增殖,到第3天时出现峰值,但稳定在峰值的时间很短,随后很快就衰减下来,到第5、6天时,大多数细胞已脱壁死亡,细胞原代培养生长周期结束.在培养过程中,pH 值处于6.50~7.00之间,虽然不处于细胞最适pH 值之间,但偏离不大,不会对细胞产生毒害作用,细胞能够正常生长.2.1.2 组织块培养法(雄性壮龄)由图1(b)可以看出:肝细胞在经过1~2天左右的适应期后开始迅速增殖,在第4天左右细胞数处于最高值,适应期和对数生长期有明显分界.平稳期的时间较短,随后细胞逐渐衰亡.在培养过程中,pH 值处于6.20~7.30之间,波动范围较大,变化不是很平稳.细胞生长代谢不如老龄小鼠的肝细胞稳定,但细胞仍能够正常生长.2.1.3 组织块培养法(雄性幼龄)由图2(a)可以看出:细胞在经过1~2天左右的适应期后开始迅速增殖,到第3天时出现最高值.此次平稳期的时间相对较长,随后细胞逐渐衰亡.到第5、6天时,细胞严重凋亡,大多数细胞已脱壁死亡,细胞原代培养生长周期结束.在培养过程中,pH 值处于5.00~ 6.80之间,波动范围大,不平稳.此时pH 值偏酸性,不适合细胞生长,可能会发生酸毒害,严重影响细胞正常生长.2.2 直接分离法2.2.1 直接分离法(雄性老龄)#55#陕西科技大学学报第27卷图2 幼龄小鼠组织块培养法(a)和老龄小鼠直接分离培养法(b)培养结果图3 壮龄小鼠直接分离培养法(a)和幼龄小鼠组直接分离培养法(b)培养结果由图2(b)可以看出:肝细胞在经过一段时间的适应期后迅速增殖,到第3天左右出现最高值,随后细胞逐渐衰亡脱壁死去,进入凋亡期.培养过程中,细胞溶液中的pH 变化范围波动比用组织块培养法培养时的大,pH 变化处于细胞正常生长所需的范围内,细胞最高数目较组织块培养法为多.2.2.2 直接分离法(雄性壮龄)由图3(a)可以看出:肝细胞在经过1~2天左右的适应期后开始迅速增殖,在培养第3天时出现最高值,处于对数生长期.此次平稳期的时间较长,增殖能力在短时间内可维持在较高水平,随后细胞逐渐衰亡,到第5、6天时,细胞不再增殖,大多数细胞已脱壁死亡.在培养过程中,pH 值处于6.80~7.30之间,变化很平稳,此时细胞的pH 值较接近细胞最适pH 值,较适合细胞生长,且此次细胞增殖的最高点细胞数较多.2.2.3 直接分离法(雄性幼龄)由图3(b)可以看出:采用直接分离法培养雄性幼龄小鼠肝细胞,细胞在经过1天左右的适应期后便开始增殖,当培养到第3天时出现峰值,且稳定在峰值的时间很短,很快就衰减下来,到第4天,细胞数量降到很低的水平,直到第6天时细胞不再增殖.在培养过程中,pH 值处于5.00~ 6.60之间,偏离细胞最适pH 较多,会对细胞产生酸毒害作用,细胞不能够正常生长.2.3 肝细胞培养过程中的形态变化刚培养的细胞呈多角形或菱形,细胞较大;随着培养时间的不断延长,细胞逐渐呈圆形.培养到1天左右肝细胞开始贴壁,经2~3天,细胞数目不断增加,贴壁细胞相互接触连接成片,在培养瓶内可明显看到玻璃表面有一层粘膜.随着培养环境的变化,细胞开始衰亡脱壁,有时培养到后期会发现细胞数突然增多,且细胞呈线状,这可能是由于后期非实质性细胞优势生长.2.4 细胞数及活细胞率幼龄小鼠的活细胞率大约为89.5%左右,获得的肝细胞数约为5.48@108个/只;壮龄小鼠的活细胞率大约为95.0%左右,获得的肝细胞数目约为5.94@108个/只;老龄小鼠的活细胞率大约为90.0%左右,获得的肝细胞数目大约为3.52@108个/只.从以上数据可看出:雄性壮龄小鼠的活细胞率高,每只获#56#第1期田三德等:肝脏细胞在体外培养过程中消长变化的探索得的肝细胞数目较多.3 结论雄性老龄小鼠的肝细胞体外生长增殖缓慢,细胞最高数目较少;雄性幼龄小鼠组织块培养法和直接分离法虽然增殖较快,细胞数目也很多,但在体外培养过程中由于细胞新陈代谢太快,二氧化碳产生过多使溶液偏酸性,不适合细胞生长,且细胞衰亡太快,不适合作为基础体系;雄性壮龄小鼠组织块培养法和直接分离法相比较而言,直接分离法获得的细胞最高数目多,且其在培养过程中pH 值未低过6.00,细胞能正常生长,故我们选雄性壮龄小鼠的直接分离法作为基础体系,以它为参照基准继续进行下一步的探索性实验.实验得到的基础体系的最佳条件为:培养温度37.0e ,胰蛋白酶的用量20.0mL,消化时间15.0min,雄性壮龄小鼠(20.0~25.0g),肝细胞直接分离培养法.参考文献[1]韩聚强.体外肝细胞培养技术新近展[J ].河北医科大学学报,2002,23(3):184-186.[2]张阳德,陈 伟.肝细胞体外培养研究近展[J].中国现代医学杂志,2002,12(15):1-4.[3]杨汉民.细胞生物学实验[M ].高等教育出版社,2004:89-97.[4]陈志南.细胞工程[M ].北京:科学出版社,2005:199-227.[5]安利国.细胞工程[M ].北京:科学出版社,2005:37-75.[6]刘德敏,赵慧茹,杨莉丽,孙 颍.大鼠肝细胞的原代培养及鉴定[J].天津医药,2006,34(5):322-324.[7]滕光菊.大鼠原代肝细胞的培养功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用[D].西安:第四军医大学硕士学位论文,2003.[8]曹健美.原代培养鼠肝细胞分离和培养的改良方法初探[J].深圳中西医结合杂志,2004,14(1):8-10.EXPLORING THE HEPATOCYTER c S SWING OF THEPENDULUM c S CHANGE IN VITROTIAN San -de,WU Yan -na,LIU N a(School of L ife Science and Eng ineering,Shaanx i U niver sity of Science &T echnolog y,Xi c an 710021,China)Abstract:In o rder to o btain long -term survival of hepatocy tes,this paper w e use the metho dof planting cultur e o f hepatic tissues and pancreatin digestion of hepatic tissues to culture themale m ouse of the yo ung,the prime of life and the old.T he ues o f these tw o m ethods formouse hepatocyes cultur e pro ved to be successful and primary culture o f new -born mousehepato cytes has been established.By discussed the differences betw een tw o methods w e findthat the m ale m ouse of the pr im e of life c s cultur e by pancreatin digestion of hepatic tissues a -dapts to the primary cultur e in vitro.The results show ed that culture temperature 37.0e ,amount of tryps in 20.0mL,dig estio n tim e 15.0m in,male mo use of the prim e of life c s(20.0~25.0g),pancreatin digestion o f hepatic tissues.Key words:m ouse;hepatocytes;isolation cultur e #57#。
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(一)
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(一)肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程引言在肝脏疾病的治疗和药物筛选中，肝细胞的体外扩增培养方法及应用具有重要的意义。
本文将详细介绍肝细胞体外扩增培养的流程和相关应用。
流程肝细胞的体外扩增培养主要包括以下几个步骤：1.肝细胞的分离和实验前处理•选择合适的动物模型或人体捐赠的肝脏组织。
•使用胰蛋白酶等消化酶对肝脏组织进行分离。
•过筛和离心等手段去除组织碎片和杂质，得到单个的肝细胞。
2.细胞培养基的配制•根据实验需要选择适用的培养基，如Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)。
•加入适量的营养物质、生长因子、抗生素等，以提供细胞所需的营养和生长环境。
3.细胞的培养和传代•将分离得到的肝细胞转移到含有培养基的培养皿中。
•放入恒温培养箱，保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
•定期观察细胞的形态和生长情况，根据需要进行细胞的传代。
4.细胞的鉴定和纯化•使用免疫荧光染色或特异性酶活性检测等方法，确定细胞是否为肝细胞。
•利用细胞分选技术如流式细胞仪等，对肝细胞进行纯化，以提高培养细胞的纯度和一致性。
5.细胞的应用•利用体外培养的肝细胞进行药物代谢研究，评估药物的药代动力学特性。
•通过肝细胞培养模型，研究肝脏疾病发生发展的机制，并开展相关药物的筛选和治疗研究。
应用实例肝细胞的体外扩增培养方法广泛应用于以下领域：1.肝脏疾病研究•通过体外培养模型，研究肝细胞在各种肝脏疾病中的功能改变。
•探索肝细胞变性、纤维化等疾病的分子机制。
2.肝药物代谢研究•利用肝细胞培养模型，评估药物在肝脏中的代谢情况。
•预测药物的药动学和药效学特性，为药物研发提供参考。
3.肝移植前肝细胞功能评估•对待移植的肝脏进行外体肝细胞培养，评估肝脏功能是否正常。
•提供有关肝脏移植前肝功能的重要信息。
结论肝细胞的体外扩增培养方法和应用具有重要的研究意义和临床应用价值。
通过对肝细胞的培养和应用，我们可以更深入地理解肝脏疾病的发生机制，为肝脏疾病的治疗和药物筛选提供新思路和方法。
原代肝细胞分离
肝细胞原代培养
实验用品
1.仪器与用品：倒置相差显微镜显微镜，离心机，试管，移液枪，培养皿，手术刀片，注
射器，眼科剪，真空泵
2.试剂：DMEM高糖细胞培养液（Hyclone），PBS（自配），0.25%胰酶（碧云天）
3.材料：成年大鼠（军事医学科学院动物房）
实验步骤
1. 按照约50g/kg大鼠为大鼠注射麻醉剂,待其昏迷后，置75%酒精中浸泡3min，剖取大鼠肝脏，置于玻璃皿中，分成小块，剔除脂肪、结缔组织等杂物。
2. 取1ml PBS于培养皿中清洗肝脏组织，洗完后吸去PBS，然后再用1ml PBS清洗一次。
3. 用眼科剪刀反复剪碎肝组织，直至剪成1mm3大小的组织块
4. 加入2ml胰酶消化，放于37℃培养箱中20min。
消化十分钟时拿出来摇晃一次。
5. 镜检，待细胞从组织解离。
将消化液全部转入10ml离心管中，再加入1ml培养基终止胰酶消化，在2000 rpm下离心3 min
6. 离心后，用枪吸去上清，加入3 ml培养基重新悬浮，静置。
7. 静置后，吸出上清至另一10 ml离心管中，在2000 rpm下再离心3 min
8. 弃去上清，小心收集离心管底细胞，加入5 ml新鲜培养基重新悬浮，接种到新培养皿中，标记后，放于37℃培养箱中培养。
实验结果
大鼠原代肝细胞
1。
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程体外培养是指将组织或细胞从体内分离出来，在适当的培养基中提供养分和环境条件，使其继续生长和繁殖。
肝细胞是人体内重要的细胞类型之一，其体外扩增培养可以为肝脏疾病的研究提供便利，如药物代谢、药物筛选、肝移植前的肝细胞修复等。
以下将介绍肝细胞的体外扩增培养方法、应用与流程。
1.肝细胞的体外扩增培养方法：(1)感应体外培养法：将组织切割成小块，用胶原酶等消化酶处理后，将细胞悬浮液接种于培养基中，经一段时间后，原始肝细胞将逐渐扩增生长。
(2)富集法：通过密度梯度离心或特异性细胞表面标记等方法，获得较纯的肝细胞种子，然后进行体外培养。
2.肝细胞的体外扩增培养应用：(1)药物代谢研究：利用体外培养的肝细胞，可以研究药物在体内的代谢途径、药物与代谢酶的相互作用等，为新药的研发和药物安全性评价提供依据。
(2)药物筛选：通过将已知化合物或新药接种于体外培养的肝细胞中，观察其对细胞生长、代谢活性的影响，判断化合物或药物的毒副作用、有效性等，并进行初步筛选。
(3)肝细胞移植前的修复：利用体外培养的肝细胞，进行相关修复试验，在肝脏移植前进行治疗，以快速修复受损肝细胞，减少术后并发症。
3.肝细胞的体外扩增培养流程：(1)细胞的获取：从人体器官获得肝组织，迅速放入无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中清洗，去除表面的血液和残留物质。
(2)细胞的分离：将肝脏组织切割成小碎片，加入含胶原酶等消化酶的消化液消化，分离出单个肝细胞。
(3)细胞的培养：将分离得到的肝细胞悬浮液接种于含有细胞培养基、血清和生长因子的培养瓶中，放置于恒温培养箱中，提供适当的培养条件，如温度、湿度、CO2浓度等。
(4)培养基的更新：根据需要，定期更换培养基，以保证细胞的生长和代谢所需的养分和环境条件。
(5)细胞的观察和评估：观察并记录细胞的生长状况、形态变化等，通过细胞计数、代谢指标测定等方法评估其活力和增殖能力。
(6)细胞的扩增和存储：根据需要，将培养后的肝细胞分为多个瓶子进行扩增，同时可将部分细胞进行冻存，以备后续研究使用。
肝细胞体外培养及其在药物毒理学研究中的应用
近 年 来 ， 外 肝 细 胞 培 养 模 型 的 应 用 越 来 越 广 泛 ， 外 体 从 源 性 化 合 物 的 毒 性 筛 选 、 险 性 评 价 到 肝 损 伤 机 制 的 研 究 都 危 有 广 泛 的 使 用 。人 和 动 物 的 肝 脏 细 胞 均 可 培 养 ， 据 肝 细 胞 根
织 分 离 肝 细 胞 进 行 短 时 间 人 工 培 养 ， 度 高 于 细 胞 系培 养 ， 难 但 细 胞 来 源 广 泛 。既 可 从 实 验 动 物 获 取 ， 可从 人 类 获 取 （ 产 又 引
胎 儿 Ｉ 手 术 切 除 的 癌 组 织 ） ｌ 或 。
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肝 细胞 培养 的 突 出 优 点 是 可 以 减 少 实 验 动 物 的使 用 量 ， 大 大 节 约 实 验 时 间 和 费 用 ， 可 同 时 检 测 多 种 物 质 多 个 浓 度 并 的 细胞 毒性 ， 体 外 高 通 量 筛 选 模 型 的 建 立 奠 定 了 基 础 。 为 １ １ 原 代 肝 细 胞 体 外 培 养 研 究 目前 ， 物 肝脏 毒 性 研 究 及 ． 药
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
相 关 领 域 应 用 最 多 的是 原 代 肝 细 胞 培 养 。原 代 肝 细 胞 在 一 定
条 件 下 几 天 时 间 内 ， 具有 体 内 肝 细胞 的一 些 功 能 和 活 性 ， 还 特
［ １ 丁 平 田 ， １］ 赵红 ．透皮 吸 收药 物 的载体 ～ 递 体［Ｏ 传 Ｊ．国外 医
原代肝细胞分离方法
原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。
体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究
Study on the Isolation, Cultivation and Cryopreservation of Human Primary Hepatocytes in
Vitro
作者： 李阳;张斌斌;彭青;高毅
作者机构： 南方医科大学珠江医院/南方医科大学珠江医院再生医学研究所／广东省人工器官与组织工程研究中心,广东广州510282
出版物刊名： 现代医院
页码： 867-871页
年卷期： 2017年 第6期
主题词： 人原代肝细胞 分离 培养 冻存
摘要：目的 通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。
方法 采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。
复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。
结果 复苏后,肝细胞存活率达到（71.6±2.2）%,相较新鲜分
离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白（ALB）、谷氨酰胺合成酶（GS）、氨甲酰磷酸合酶1（CPS1）以及细胞色素酶P450
3A4（CYP3A4）功能基因表达无统计学差异（P〉0.05）。
结论 初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。
原代肝细胞
原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。
该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。
但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。
1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。
该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。
但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。
可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。
2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。
胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。
成人原代肝细胞的分离、培养及冻存
成人原代肝细胞的分离、培养及冻存杭化莲;张磊;施晓雷;卞建民;丁义涛【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2011(19)19【摘要】目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点(2、6、12、24、36、48和72h),分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮.分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0%±4.6%和72.0%±6.0%.4℃预培养12或24h被证明是最适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P<0.05).与立即冷冻组相比较,预培养12或24h肝细胞解冻后活力(61.4%±4.8%,62.0%±5.6%vs53.4%±4.2%)、贴壁率(63.2%±5.8%,62.6%±3.6%vs55.2%±4.6%)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高(均P<0.05).结论:人肝细胞在冷冻前4℃预培养12-24h可以获得较理想的肝细胞,为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.【总页数】6页(P2016-2021)【关键词】人原代肝细胞;肝细胞分离;冷冻保存【作者】杭化莲;张磊;施晓雷;卞建民;丁义涛【作者单位】南京医科大学附属南京第一医院普外科;南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科【正文语种】中文【中图分类】R595.6【相关文献】1.体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究 [J], 李阳;张斌斌;彭青;高毅2.成人脂肪肝整肝肝细胞分离及大量冻存的实验研究 [J], 李涛;佟辉;申川;祝哲诚3.人肝细胞的分离、培养和冻存 [J], 李涛;彭志海4.pH 值对原代大鼠肝细胞冻存效果的影响 [J], 付建柱;张立军;于则利5.原代大鼠肝细胞分离方法与冻存条件的优化 [J], 姚云清;张定凤;倪小毅;卢萍;王波;周卫平;黄爱龙;任红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
[方案]原代肝细胞分离方法
![[方案]原代肝细胞分离方法](https://img.taocdn.com/s3/m/cc242bcfcf2f0066f5335a8102d276a20029606c.png)
原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法.Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率.1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。
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・经验交流・体外正常成人肝细胞分离培养的经验Ξ马巧玉,郝 飞,王宇明,宋志强,刘国栋(第三军医大学西南医院全军感染病中心,重庆400038) 摘 要:目的 为进一步研究病毒性肝炎免疫发病机制、临床治疗和疫苗研制提供最接近自然状态的理想细胞模型。
方法 体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并用1640培养液维持培养1个月以上。
结果 分离较多量正常成人肝细胞可在体外存活1个月以上。
结论 正常成人肝细胞可在体外被分离培养以供各种肝病基础和临床研究。
关键词:正常成人肝细胞;细胞模型中图分类号:R44611文献标识码:B文章编号:167128348(2003)0921228202 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎、原发性肝癌)在我国发病率高,无可靠治疗方法。
因此,迫切需要在肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破。
近年来,国内外有许多关于用动物肝细胞、胎儿肝细胞及肿瘤细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然状态的成人肝细胞存在较大差别。
我们在体外分离培养正常成人肝细胞,以期建立与自然状态最为接近、更适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治等研究的细胞模型。
1 材料与方法111 正常成人肝组织标本,共10例,其中取自意外死亡之3例成年男性(19、24、35岁),1例成年女性(27岁)肝脏;4例成年男性(42、47、55、62岁)胆囊结石或胆囊炎手术时肝脏活检标本;均无肝病史,临床生化和病理检查无异常发现;另有1例成年男性(36岁)肝脏血管瘤标本;2例成年男性(53、58岁)肝癌癌旁组织标本,各种肝炎病毒及AIDS标志物检测均阴性。
112 小牛血清 由本校试剂中心提供,用前56℃×30min灭活补体。
113 主要试剂 (1)PRMI21640细胞培养基:购自美国GIB2 CO公司;(2)胶原酶、胰蛋白酶抑制剂:由美国SIGMA公司提供;(3)分散酶:购自德国宝灵曼公司。
114 实验方法11411 正常成人肝细胞分离 采用体外灌流法分离正常成人肝细胞[1、2]。
取上述成年人肝脏2～100g,将肝组织置于培养皿中,用37℃前灌流液自残存血管中反复灌注,至大部分肝脏呈现灰白色,用37℃,0105%的胶原酶(含011分散酶)反复注入残存血管,剪碎肝组织,37℃振荡,消化30min,三层无菌沙布过滤,450r/min×4min离心,弃上清,加入PRMI21640培养液混匀,450r/min×4min离心,弃上清,反复3次,最后用含10%小牛血清1640培养液(完全培养液)按细胞密度1×106ml 稀释后接种至25ml培养瓶和加爬片的24孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱孵育。
11412 正常成人肝细胞培养 24h后换液,弃去含漂浮细胞的培养液,按上述比例,加入PRMI21640培养液,此后每2～3d 更换完全培养液1次,维持培养1个月以上。
于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存活率。
2 结 果211 细胞分离 由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到达部分肝组织,分离效果较差,加入分散酶后可提高分离效率,分离后用台盼蓝染色显示肝细胞存活率约50%～90%。
212 细胞培养 4例胆囊手术后肝组织分离显示肝细胞少,台盼蓝染色显示肝细胞存活率60%,贴壁差(<50%),碎片多,分离培养1周内均放弃;肝血管瘤标本RBC多,肝细胞相对较少,贴壁差,分离后次日放弃;2例肝癌癌旁组织标本分离肝细胞较多,台盼蓝染色肝细胞存活率仅50%,生长差,贴壁少,细胞碎片迅速增多,于分离后3～4d放弃。
4例意外死亡捐献的肝组织标本,分离细胞后用台盼蓝染色,肝细胞存活率约90%.24h后约70%～80%细胞贴壁,贴壁细胞前呈圆形,后呈多角形,单核,生长良好,加感染血清组与对照组细胞形态无明显差异。
于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数台盼蓝染色判断肝细胞存活率,结果见表1。
表1 正常成人肝细胞培养的计数、活力鉴定d肝细胞计数肝细胞存活率10 6.79±0.21×105/ml>90%20 5.56±0.24×105/ml>60%30 4.47±0.32×105/ml>60%3 讨 论目前,在肝脏疾病特别是病毒性肝炎的研究中,用动物肝细胞、肿瘤细胞、人胎肝细胞等作为细胞模型最常见,但这些细胞模型与自然感染状态下的成人肝细胞是否有相似的感染方式、途径及生物学特性尚无定论。
因此,我们建立了正常成人肝细胞分离培养的细胞模型,以期在最接近自然感染状况的情况下进一步研究肝疾病的发病机制、病理改变、临床治疗及疫苗效果。
目前分离肝细胞多采用二步灌流法。
因为我们所取用肝组织为非全小叶标本,灌注时,灌注液不能到达部分肝组织,加之用胶原酶分离正常成人肝细胞效率较分离胎肝细胞、动物肝细胞低,手术中取活检肝组织标本小,分离肝细胞少,难以生长,肝血管瘤组织RBC太多,灌注时不易去除;肝癌癌旁组织均有慢性炎症,纤维化明显,分离培养有较大困难,但意外死亡捐献之肝细胞标本较大,献者年轻,肝脏纤维化程度低,均分离Ξ基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770682)培养成功,在分离成人肝细胞时加入分散酶后可提高分离效率,所用消化酶最好新鲜配制,在最初24h,有部分细胞不贴壁,需弃去。
因此,要求每毫升细胞浓度略高于其它肝细胞培养。
正常成人肝细胞体外培养时间约1个月,有人提出采取胶原凝胶夹层培养和多细胞球状体方式培养[2、3].可提高肝细胞生存效率及延长其存活时间。
近年来,国外有人将兔肝细胞移植到切除90%肝脏、严重肝功能障碍的兔肝或脾上,证实形态完好的移植肝细胞可存活15个月,并能起良好的代偿作用[4]。
目前在治疗各种严重肝病时,肝移植已成为必不可少的方法之一,但供肝严重缺乏,如能将人肝细胞分离后移植在腹膜、脾脏或胰腺上,并发挥其生物作用,在肝病治疗史上将是一个突破性进展。
乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎的发病机制和临床治疗研究一直无突破性进展,这与缺乏适宜的细胞模型有关。
体外培养的正常成人肝细胞可改善乙、丙型病毒性肝炎复制[4～6]。
因此,可用人肝细胞进行下述研究:肝炎病毒怎样吸附于肝细胞,肝细胞上病毒抗原表达与免疫反应的关系,病毒变异、肝细胞感染后病理、功能改变等,人肝细胞还可用于抗病毒药物及疫苗效果判定。
体外分离培养正常成人肝细胞的细胞模型虽然有价格低廉、操作简便,与自然感染状态接近,利于开展关于肝脏病研究的优点,但肝细胞来源有一定困难,细胞培养时间不够长,不能传代等均为此细胞模型的特点,需要进一步研究解决。
参考文献:[1]王宇明,陈国致,董家鸿,等.分离肝细胞的一种体外灌流法[J].中华消化杂志,1994,14:175.[2]K ono Y,Y ang S,Letearte M,et al.Establishment of a hu2man hepatocyte line derived from primary clatter in a colla2 gen gen sandwich culture system[J].Exp Cell Res,1995, 221.478.[3]Li AP,Colburn SM,Beck DJ.A sim plified method for theculturing of primary adult rat and human hepatocytes as muliticellular spheroids[J].In Vitro Cell Der Biol,1992, 28A:673.[4]Moshage H,Y ap SH.Primary cultures of human hepato2cytes:a unigue system for studies in toxicology,virotogy.parasitology and live pathophysiology in man[J].J Hepatol, 1992,15:404.[5]Shimizu YK,Purcell RH,Y oshikura H.Correlation betweenthe effectivity of hepatitis C virus in vivo and its infectivity in vitro[J].Port Natl Acad Sci USA,1993,90:6037.[6]Ito T,Mukaigawa J,Zuo J,et al.Culture of he patitis C virusin primary hepatocyte culture from patients with chronic hepatitis C results in release of high titre infecious virus[J].J G en Viro,1996,77:1042.・经验交流・专业转运新生儿临床分析华子瑜1,叶荣民2,徐天鹤1,余加林1,漆正常1,李世红1,陈贻骥1,邓 春1,包 蕾1,王家蓉1(11重庆医科大学附属儿童医院新生儿科 400014;21重庆市长寿区人民医院儿科 401200) 摘 要:目的 分析专业新生儿急救转运(N ETS)的运作特点及临床意义,确保N ETS运作安全性的提高。
方法 用回顾性统计学分析方法,分析我院N ETS转运的215例新生儿的临床特点,总结院前急救经验。
结果 我院N ETS已具有较强的专业人员及完善的设备配置,与重庆地区及周边区域43家基层医院建立稳定的转运协作关系,院前急救、途中监护等N ETS运作规范有效,确保转运新生儿的安全;危重儿约95.6%,转运前常伴发低体温、酸中毒、低血糖,经现场急救稳定病情后,215例均安全转运回院。
转运患儿中,肺炎、缺氧缺血性脑病、早产儿为常见疾病,发生率分别为81.9%、69.8%、64.2%;早产儿胎龄多小于35周117/138(84.8%),双胎或多胎占27.5%;,治愈好转率88.4%。
结论 规范化的N ETS应包括专业人员组队、及时有效的院前急救、途中严密监护病情,可最大限度地保障危重新生儿安全的转运,为后续治疗争取了宝贵时间,对减少后遗症发生有积极作用。
关键词:新生儿;急救转运;院前急救中图分类号:R7201597文献标识码:B文章编号:167128348(2003)09201229203 20世纪70年代初国外建立了新生儿急救监护中心(N ICU),不久建立新生儿急救转运系统(N ETS),开展危重新生儿转运工作;随着N ETS的完善与普及,高危儿得到及时的产房抢救和院前监护、诊疗,使新生儿病死率及致残率明显降低。