小鼠原代肝细胞的分离与培养

大黄和尿毒清对大 鼠肾组织抗氧化应激作 用的比较研 究▲
梁晓静 廖 蕴华 朱 荃 何 宝
（ 广西医科大学 ， 南宁市 ５０ ２ ；广西医科大学第一附属医院肾内科 ， ３０ １ 南宁市 ５ ０２ ； ３０ １
澳门科技大学 ， 门 ０ ８３ 广州康 臣药业肾病研究中心 ， 澳 ０５ ； 广州市 ５０ ３ ） １５ ０
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肝 脏作 为机 体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生理 病 理 过 程 在 中发挥 重要 作用 。肝 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的 功能 ， 合 成 如 动物 实验 中心提 供 ） 。 １２ 主要试 剂 完全 Ｄ Ｅ ． Ｍ Ｍ培养基 ：． ｇＬ ３． ｍ ｌＬ ２８ ／ （３３ ｏ ） ｍ ／ 碳 酸氢钠 ，． Ｌ ２ ｍ ｌ ） Ｅ Ｅ ，％ 胎牛 血 清 （ ４８ （０ｍ ｏ Ｌ Ｈ Ｐ Ｓ５ ／ 四季 青 ）５ｍ／ （ ｍ ｏ ） 一 酰胺 ，０ｍ／ （ ｍ ￣Ｌ 丙 ， ｌＬ １ ｍ ￣Ｌ Ｌ谷氨 １ ｌＬ １ｍ ｏ ） 酮 酸钠 ； 型胶 原 酶 （ｉ ａ ， Ｖ Ｉ ｓ ｍ ） 浓度 ：．％ ； — ｎ ｓ不 含 钙 ｇ ０ ２ Ｄ ｈ ｋ， ａ 镁 ，ｓ ａ ｉ ；５ （ｏ ｂ ）７ ％酒精 。 ｌ ｏ ｒ １３ 主要 实验 器材 ． １４ 肝 细胞的 分 离 ． 眼科 剪 、 眼科镊 、 术剪 、 杯 、 管 、 手 烧 滴 断头处 死 小 鼠 ，５ ７ ％酒 精 浸泡 ５Ｓ剖 ， 离 心管 、 Ｌ培养 瓶 。 ５ ｍ ０ 腹取肝 脏 ， 于装有 适量 Ｄ ｈｎ ｓ 放置 — ｋ 的培养 皿 ， 除血管 、 ａ 去 血 污 、 膜 等 ， 移 至 装 有 Ｄｈｎｓ 小 烧 杯 ， 碎 组 织 ， 包 转 － ｋ的 ａ 剪 用 Ｄｈｎｓ －ａｋ 冲洗 ２次 ， 至离 心管 ， ００ｒｍ， 心 ５ｍｎ 弃 转移 １ ０ ｐ 离 ｉ，
１ 材料 与方法
１１ 实验 动 物 ． ２ ４周龄 昆 明小 鼠 ， 性 （ ～ 雄 广西 医科 大 学
４２ ０
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［］ 鄂 ５
征 ． 织培养 和分 子细胞 学技术 ［ ． 京 ： 京 出版社 ， 组 Ｍ］ 北 北
１９ １ ． ９ ５： ３
ｔ ｒｔ ｅａｏｙ ｓＪ ．ｐ ａ ｃｒＲ ｓ１ ８ ，９ ９ ：８ ９ ８ ｏ ａ ｈ ｐｔ ｔ ［ ］ＪｎＪＣ ｎｅ ｅ，９ ８７ （ ）９ ３— ８ ． ｃｅ （ 收稿 日期 ：０ １ ６１ 修 回 Ｅ期 ：０ １ ７２ ） ２ １ － —１ ０ ｔ ２ １－ －８ ０
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凝血因子、 血清白蛋 白及 多种消化酶 ， 参与 内分泌调节 ， 代 谢多种营养物质 ， 储存葡萄糖 ， 清除毒素等。原代培养的肝
细胞广 泛用 于药 理学 、 理学 、 疫学 、 毒 免 分子 生 物学 、 细胞 生 物学 等相关 的研 究 ， 在药 物研 发方 面 ， 用 原代 肝 细胞 尤其 使
可较经 济 和迅速 地 阐明药物 对药 物代 谢 酶 的诱 导或 抑制 作
用， 从而避免采用 大量动物进行药理效应筛选 。但原代肝 细胞增殖能力差 ， 不易长时间保存或长期培养 ， 其生物学性
状 易发生 改变 ， 因此 建 立 简单 易 行 的 分 离培 养 纯 化 肝 细胞
的方法显得十分重要 。国内外大都采用经典的 Ｓｈ ｎ原位 ｅｌ ｅ 两步灌流法分离肝 细胞 ， 但该方法操作复杂， 技术要求高， 所需时 间长， 易污染 ， 经济成本高 ， 不适合较小动物也不易 在一般实验室开展 ， 限制 了原代肝细胞在研究 中的广泛应 用…。本研究在聂兴草等 、 李素婷等 的实验方法基础 上， 建立了一种简单易行、 经济实用 的小鼠原代肝细胞分离
础。
此方法较适合一般 实验室开展 小鼠原代肝细胞的分 离与培养， 为进一步的实验研究提供 了基
【 关键词】 原代细胞培养； 肝细胞 ； 细胞分离； 细胞培养
【 中图分类号】 Ｑ８３【 文章编号 】 １７ － ６ （０ １０ － ０ － ６３ ７８ ２ １ ）５ ４０ ３ ７ ０ ０
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培 养方 法 ， 并对 原代肝 细胞 的形态 变 化进 行 观察 ， 为进 一 步 进 行相 关研 究奠 定 了基 础 。
悬液 ， 每加入 １ ＬＩ型胶原酶便轻轻吹打 １ 共加 ４次， ｍ Ｖ 次， 即总共加入 ４ｍ 胶原酶 ， ＬＩ Ｖ 室温消化 １ ｍｎ 全部过滤至 ５ ｉ， 装有完 全 Ｄ Ｅ 的 烧杯 中， Ｍ Ｍ 吹打 均匀 ， 移 至离 心 管 ， 转
４ ００
小 鼠 原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养
杨 天燕 赖
（ 广西医科大学第一附属医院药剂科 ， 南宁市
静 韦锦 斌
５０２ ；广西 中医学院， ３０ １ 南宁市 ５ ００ ； ３０ １
广西医科大学实验 中心 ， 南宁市 ５０２ ） ３０ １
【 摘要】 目的 探 求一种简易、 经济的小鼠原代肝细胞的分 离与培养方法。方法 采用非灌注法分 离小鼠肝脏， 利用 ０ ２ １型胶 原 酶对肝 脏 消化 以获取肝 细胞 ， Ｄ Ｅ 培 养基 对 肝 细胞 进 行单 层 培 养 。结果 光镜 下 可 见培 养 的肝 细 胞 ．％ Ｖ 以 Ｍ Ｍ 呈三角形、 圆形、 类圆形或扁平不规则多角形 ， 排列整齐， 细胞界 限清晰， 胞浆丰富透亮， 细胞 中有核， 有单核 、 双核是 圆形或 椭圆形， 核仁清晰。结论
Ｍ ｅ ｈｏ ｓ Ｔｈ ｒ ｅ ｌ ｅ ｓ ｉｏａ ｅ ｙ ｎ ｎ ｐ ｒｕ ｉ ｎ． ｉ ｅ ｔ ｄ ｂ ２ ｔ ｄ ｅ ｍｕ ｎ ｉ ｒｗａ ｓ ｌ ｔ ｄ ｂ ｏ － ｅ ｆ ｓｏ ｄ ｇ ｓｅ ｙ ０． ％ Ｉ Ｃ ｌ ｇ ｎ ｓ Ｏ ａ ｏ ｇ ｔ ｔ ｅ ｐ ｍａ ｙ ｈ ｐ ｔｃ ｔ ｓ ｉ ｖ Ｖ— ｏｌ ｅ ａ ｅ Ｓ ｓ ｔ ｅ ｈ ｒ ｒ ｅ ａｏ ｙ ｅ ａ ｉ ａ ｄ ｃ ｌ ｒ ｈ ｍ ｔ ｎ ｕ ｔ ｅ ｔ ｅ ｗｉ ＤＭＥＭ ｄ ｕ ｉ ｈ ｎ ｌ ｙ ｒ Ｒｅ ｄ ￣ ｕ ｈ ｍｅ ｉ ｍ ｎ ｔ ｅ ｍｏ ｏ ａ ｅ ． ｓ Ｌ ｖ ｒｃ ｌｓｗｅ ｅ ｆ ｕ ｄ ｕ ｄ ｒ ｔ ｅ ｏ ｔ ａ ｃ ｏ ｃ ｐ ｓ ｏ ｎ ｓ ｉ ｅ ｅ ｌ ｒ ｏ ｎ ｎ ｅ ｈ ｐ ｉ ｌ ｍｉ ｒ ｓ ｏ ｅ， ｈ ｗｉ ｇ ａ ｃ
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１ ０ ｍ， 次离 心 ５ｍｎ弃 悬 液 ， ０ｒ 再 ０ ｐ ｉ， 重新 加 入 ５ｍ Ｌ没 有 血 清 的 Ｄ Ｅ 吹 打混匀 所得 沉 淀 物 ， ００ｒ 离 心 ５ｍ ｎ Ｍ Ｍ， １ ０ ｐ ｍ， ｉ，
弃悬液 ， 加入 ５ｍ Ｌ完全 Ｄ Ｅ 吹打混匀 ， Ｍ Ｍ， 接种至培养瓶 。 １５ 肝细胞的培养 在接种细胞前 ， ． 预先在培养瓶的底部 铺上一层胎 牛血清， 待血清干时即可 ， 接种至培养瓶 ， 放人 ３℃的 Ｃ ７ Ｏ 培养箱培养 ， ｄ ２ 后可见部分细胞贴壁 ， 培养到
［］ ６
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