基因工程菌讲义的发酵
基因工程大肠杆菌发酵的研究ppt课件
• 要同时解决这两个问题是比较困难的，目前不少 基因工程研究研究室或生产厂对于这类菌的发酵 均遇到上述同类的问题，即菌体密度不高和表达 量低，他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵 体积，显然不是良策，因为含PL启动子的工程菌 在发酵过程中发酵体积越大（500～1000L），其 表达效率愈低，并大大增加了抽提分离表达产物 的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
• 三、基因工程菌 • 干扰素α-2b PL启动子氨苄青霉素抗性基因；降 钙素/JM103氨苄青霉素抗性基因；鱼生长激素 Trp启动子氨苄青霉素抗性基因.K8899/C600氨苄 青霉素抗性基因。
人干扰素α-2b
四、设备
• • 径高比：1:2~3； 装料系数: 70%； 罐体耐高温、耐酸碱、耐腐蚀的硅 硼玻璃罐与材质为进口316L的不 锈钢组合体；不锈钢内抛光精度 Ra≤0.8；特别设计的AQ保护装置， 无任怎样操作玻璃罐永不破碎； 搅拌系统：顶式机械搅拌，机械密 封。采用316L不锈钢专用搅拌轴 材料，精密加工，刚性好，长期使 用不变形； 灭菌：在位/离位灭菌；设置灭菌 程序，灭菌温度100-130℃； 接种：酒精火焰接种和插针接种； 控制系统：德国西门子PLC控制核 心+进口触摸屏；
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生产型发酵罐： 夹套：设计压力0.3 Mpa，夹套材质： 304不锈钢，用于温控、辅助灭菌；采 用优化导流设计，提高了交换效率和罐 内温度的均匀性； 进气过滤：采用一路深层通气质量流量 计显示，采用精度为0.2μm的进口除菌 过滤器，配空气分布器，防倒流装置； 确保安全并可独立灭菌，大大延长使用 寿命； 电机：采用德国汉森公司的调速电机 （加强型冷却装置，确保电机能在恶劣 的环境中长期运行）； 调 速 器：日本变频调速器 专用无菌取样阀：在位灭菌、微量取样 不染菌，无死角，不积料，使用方便； 专用无菌放料阀：在位灭菌、材质特制， 可无杂菌放料，无死角，不积料，使用 方便； 灭菌：蒸汽在位灭菌。设置灭菌程序， 灭菌温度100-130℃； 移种：316L不锈钢光亮管，隔膜阀。 在位灭菌； 控制系统： 德国西门子PLC控制核心+ 工业平板电脑；
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DN双术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症一一癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。
现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、十扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程(genetic engineering )是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA勺重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DN"子，然后在将重组DN"子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DN济组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DN"段，这种DN隔段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病蠹DN础接成重组DNR三是把重组DN闻|入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五白万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。
第2讲 基因工程菌的发酵
二、基因工程菌发酵所用设备
基因工程菌的培养设备
（1）发酵罐的组成：发酵罐体、搅拌器、温控、灭
菌系统、空气无菌过滤系统、参数测量与控制系统、以 及培养液配制及连续操作装置等。
（2）基因工程菌对发酵设备的要求：
既要防止外部微生物侵入罐内，还要不使培养 物外漏。
机械搅拌式发酵罐
气升式发酵罐
三、基因工程菌的培养工艺
铵、硝酸铵、氯化铵等。 ③其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌 株还要补加相应的营养物质。
2 接种量的影响
① 什么是接种量?——移入的种子液体积和培养液体积之 比。 ② 接种量的大小对发酵有什么影响?
答：影响发酵的产量和发酵周期， （1）接种量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达； （2）接种量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，但
会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；
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温度的影响
在复制水平上 在转录水平上 在其他方面
通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 通过影响RNA聚合酶作用来调控基因表达 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
例如：大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄 糖阻碍，还受温度调控。
16℃和18℃培养时，菌体生长较慢，从而影响翻译，即酶的合 成。
4 溶解氧的影响
溶解氧（Dissolved oxygen,DO2）：是工程菌发酵培养过
程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和 产物生成的影响很大。
发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST (surface tension) 值下降； 发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻
《生物工艺学》基因工程菌的发酵 ppt课件
（3）使质粒稳定的措施
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3，表达效率及质粒拷贝数控制
• 在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上， 应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。
• 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达 到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝 数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加， 目的基因产量提高。
四、工程菌的应用
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2，其它发酵产品 • 酶制剂 • 氨基酸（苏氨酸、色氨酸） • 抗生素
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第二节 工程菌的培养
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存 过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。
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三、工程菌应具备的条件
• 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 • 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 • 菌株不是致病株，也不产内毒素。 • 代谢控制容易进行。 • 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。
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1，基因药物 • 红细胞生成素 • 胰岛素 • 干扰素 • 乙肝疫苗 • 生长激素 • 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
• 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定， 采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。
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• 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。 实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项 组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。
第八章基因工程菌发酵
（五）溶解氧
一般对于需氧的基因工程菌发酵，要求培养 液中有足够高的溶解氧，特别是在进行高密 度培养时。近年来很多实验证明不同的菌株 对氧的需求是有差别的。追求高的溶氧水平， 虽然能得高的菌体密度，但在质粒稳定性和 产物的表达上未必得到好的效果，有的甚至 会对纯化提取产生不良影响。因此，溶氧的 水平应根据使用的菌株和表达产物的需要， 控制在适量水平。
（六）比生长速率
基因工程菌在培养过程中的比生长速率 与重组产物的表达效率存在一定的关系。 Riesenberg在用大肠杆菌TG1(pBB210)生产 α干扰素时，发现在较低的比生产速率 （0.15h-1）有较高的产率。因而在发酵过程 中如果能对基因工程菌的比生长速率进行控 制，能有效提高生产水平。
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
• 动物细胞培养的一般流程为： • 机体组织→切碎→酶解→离心收集 →单细胞→培养→种子→液氮冷藏 →复活培养→扩大培养→反应器大 规模培养
（二）动物细胞的培养特性
• 动物细胞一般经约50代分裂繁殖，便退化死 亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞 特性仍保持正常。这类细胞被称为初代培养 细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现 繁殖能力突然增强、几乎无限制繁殖的细胞， 其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成 等都发生了变化，完全失去原细胞的特性。 我们把这一类通常所说的癌细胞称之为确立 细胞株或株化细胞。
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效菌种改良技术和手段，也为攻克医学上疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病深入研究和最后治愈提供了可能；为农业第三次革命提供了基础；为深入探索生命奥秘提供了有力手段。
现在由工程菌产生珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物来源，而且可使成本大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力关键之一。
第一节工程菌来源和应用一、何谓基因工程基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似方法，根据人们意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望产物，或创造出具有新遗传特征生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程核心技术是DNA重组技术。
重组即利用供体生物遗传物质或人工合成基因，经过体外或离体限制酶切割后与适当载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好蓝图表现出另外一种生物某种性状。
除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因表达技术，基因突变技术，基因导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求DNA片段，这种DNA片段被称为“目基因”；二是将目基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目基因能表达受体细胞挑选出来。
DNA 分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA切割、缝合与转运，必须有特殊工具。
要把目基因从供体DNA长链中准确地剪切下来，可不是一件容易事。
《基因工程菌发酵》PPT课件
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分批培养中选择不同的碳源，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生。
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大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提 高产量。
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它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的 RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少。
也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应。
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第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件,如温度、pH、培养基各种组分、 碳氧比，分析表达产物的合成、积累 对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。
高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
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“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并合 成被称为魔点的ppGpp的结果。
ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录。
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
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发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
《基因工程菌发酵》课件
通过将目标基因插入宿主菌株的染色体，实现对目标基因的表达和调控。
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发酵过程
利用菌株进行发酵过程，通过代谢产物合成目标化合物。
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纯化和提取
通过有效的纯化和提取技术，获取目标化合物的高纯度。
基因工程菌发酵的优势
1 高效
菌体能够高效合成目标化合物，提高生产效率。
2 可控
通过基因调控和发酵条件优化，可以精确控制产品成分和质量。
总结和展望
基因工程菌发酵是一项具有广泛应用和巨大潜力的技术，将在医药、工业、 环境和农业等领域继续发展和创新。
《基因工程菌发酵》PPT课件
通过深入浅出的解释和精美的图片，本课件将详细介绍基因工程菌发酵的背 景、原理、应用领域以及发展前景。
背景介绍
基因工程菌发酵是一种重要的生物工艺技术，利用基因工程手段改造菌株， 通过发酵生产目标物质。
基因工程菌发酵的定义
基因工程菌发酵是指利用重组DNA技术构建具有特定基因组的菌株，并通过 菌体生物代谢过程来合成目标化合物的过程。
3 环保
利用菌株的生物降解能力，减少废弃物产生和环境污染。
基因工程菌发酵的发展前景
创新性
基因工程菌发酵将会不断结合新 技术和新领域，推动科技创新。
研究和发展
越来越多的研究机构和企业投入 基因工程菌发酵领域的研究和开 发。
生物技术发展
基因工程菌发酵是生物技术发展 的重要方向之一，有着广阔的应 用前景。
基因工程菌发酵的应用领域
制药业
利用基因工程菌发酵生产药物，提高药物生产 效率和纯度。
环境治理
利用基因工程菌发酵进行废水处理和有机废弃 物降解。
工领域
利用基因工程菌发酵生产化工原料和生化产品， 替代传统化工合成过程。
发酵工程第八章基因工程菌发酵
工程菌活化、筛选和保藏方法
• 2. 含质粒大肠杆菌的活化：10ml LB培养基装50ml三角瓶中，灭菌 后接菌种，150rpm,37℃振摇1216小时；
• 3．含质粒大肠杆菌的筛选：：20ml 灭 菌LB培养基装一块平板，加卡那霉素 （1mg/ml）1ml. • 划线接种（上述活化的菌种），37℃倒 置培养12-16小时；
• 4. 含质粒大肠杆菌的增殖培养： 3ml LB液体试管中加入150µl卡那霉 素，挑选单菌落接入， 250rpm,37℃剧烈振摇12-16小时， 供质粒抽提和菌种保藏用。
• 5. 取150µl的培养物入1.5ml微量 离心管中,加850µl灭菌的甘油， 密封管口，放-20℃保藏。
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第二节 工程菌的发酵
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
7.0
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
4．透析培养
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产 物和培养基分离，通过去除培养液中的代 谢产物来解除其对生产菌的不利影响。传 统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等 代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生 长及外源基因的表达，而透析培养解决了 上述问题。
5．固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持 质粒的稳定性。有人将固定化技术应用 到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒稳定性大大提高，便于进行连 续培养，特别是分泌型菌更为有利。因 此基因工程菌固定化培养研究已得到迅 速开展。
第11章 基因工程菌发酵——【发酵工程 精】
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大 量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长 得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导 致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
1、分离丢失
分离丢失示意图
2、质粒结构不稳定性
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变。
如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成 外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生 长。
而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快， 使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培 养情况就是结构不稳定性。
2、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶 解氧浓度），调节比 生长速率，使工程菌生长具有优势。有 些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢，因 而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可以改 善质粒的稳定性。
（四）表达的诱导
基因工程菌的产物表达需要诱导； 诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似 物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱 导等。
重组菌GY2345(pBR325)则表现不同
■质粒在不同的宿主中，有不同的稳定性 质粒pBR325在不同的宿主大肠杆菌中： 限制性基质：葡萄糖、镁盐、磷酸盐 稳定性有很大差异 葡萄糖和磷酸盐限制时最易发生质粒不稳定性 可能是它们提供合成DNA的材料和能量
（2）比生长速率μ 重组菌的μ对质粒的稳定性有很大影响
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细 胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个 细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。
基因工程菌发酵
基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细 胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛 的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是 人体防御系统的重要组成部分。根据 分子结构和抗原性的差异分为α、β、 γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
1、基因工程菌的组建
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
平板培养基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次,计算比值
(稳定性stability)
4、影响质粒稳定的因素
• 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对
其稳定性的影响； • 宿主对质粒稳定的影响； • 质粒拷贝数；
• 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。
5、使质粒稳定的措施
组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改进技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了根底；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。
现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝外表抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使本钱大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。
第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程〔genetic engineering〕是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA的重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DNA 重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因〞；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA 分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术〞是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程〞，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。
第三章 基因工程菌发酵ppt课件
酶的活性下降 ● 采用trp启动子
色氨酸和吲哚丙烯酸（IAA）影响外源基因的表 达
● 酵母表达系统 毕赤酵母和汉逊酵母等甲醇营养酵母表达系统 具有高表达效率和分泌功能
表达阶段，需甲醇进行诱导，同时还作为碳源 若甲醇浓度过低，影响外源基因的表达 若甲醇浓度过高，产生抑制作用 利用甲醇传感器进行在线检测和补料控制 控制甲醇浓度在0.3%，蛋白产量可增加5倍
式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失 质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为 系数
带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质）
基本培养基﹥复合培养基
基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响
3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制
1、高密度培养 ●重组菌生长的障碍
■重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ■重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合 成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高 度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的 比生长速率往往远小于宿主菌
5、代谢副产物的影响 培养过程的代谢副产物积累对重组产物的生产
产生影响 大肠杆菌培养：
产生副产物醋酸 对外源基因的表达具有强烈的抑制作用 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α2干扰素： 随着醋酸浓度的增加 干扰素的比生产速率急剧下降
因此，发酵过程应避免醋酸的生成
减少乙酸积累的对策
■宿主菌
才能保证工程菌顺利实现产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率