基因工程菌的发酵
植酸酶基因工程菌的发酵研究
关键词 ： 酸酶 ； 酵 ； 植 发 植酸 酶基 因工 程菌
植 酸 酶 （ ｈ ｔ ｅ） 一 种 新 型 食 品 与 饲 料 添 加 剂 ， 能 １ ｏ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。 ｐ Ｙ ｓ 是 ａ 它 ｍ Ｌ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ．
催 化 植酸 （ ） 盐 水解 为肌 醇 及无 机磷 酸 ， 进微 量 元素 及 蛋 促
从 ０ ０ ５ ｏ ／ 的植 酸钠 溶 液 中释 放 １ ｍ Ｌ 机 磷 所 需 的酶 ． ０ １ｍ Ｌ Ｌ ｎ ｏ 无
Ｙ Ｄ种子液 ： ％ 母提取物 ； ％蛋 白胨 ； ％葡萄糖 。 Ｐ １酵 ２ ２
增 殖 培养 基 ： 母 提 取 物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨 ２ ｇ Ｌ 酵 母 量 为 一 个 酶 活 单 位 。 酵 ０ ／， ０ ／， 氮 源 （Ｎ ） ３ ４ ｇ Ｌ 生 物 素 ０ ４ ｇ Ｌ 甘 油 ｌ Ｌ Ｌ ０ １ １４ 植酸酶基 因工程菌摇瓶发酵产酶条件 的研究 Ｙ Ｂ １． ／ ， ． ｍ ／ ， ０ ｍ ／ ， ． ．
ｍ ０ ０ ７ ｍ ｌ Ｌ Ｌ ． ０ ６ ｏ ／ 植酸 钠溶 液 ）在 分 光 光 度 计 上 测 Ｏ ４ ５ ｍ ， Ｄ １ｎ
１
材 料 与 方 法
植 酸 酶 基 因工 程 菌 Ｅ ２ ， 本 实 验 室 构 建 。 一 ２为
１ １ 供试菌株 ．
１２ 培养基及试剂配制 ．
琼 脂 。
ｍ ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ． ｏｌ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。
种子活化与种子液的制备 ： 将实验室保存的植酸酶基因工
诱导培养基 ： 酵母提取物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨２ ｇ Ｌ 酵母 程 菌Ｅ ２ 划线于Ｙ Ｄ ０ ／， ０ ／， 一２ Ｐ 培养基平板上 ，８ ℃～３ ℃温箱 中培养 ， ２ ０
核黄素基因工程菌的构建及其发酵的初步研究
文章编号 ：１０ －０ ５２ ０）２０ ５ －５ ０ ３９ １（０ ７０ －３ ６０
核 黄素基 因工程菌的构建及其发酵的初步研 究
陈 涛， 董文明， 李晓静， 武秋立， 陈 天津 ３ ０７ ） ００ ２
摘
要： 构建整合型核黄素质粒 ｐ Ｂ ３ Ｒ ６ ，该质粒含有解调的Ｂ ｕ ｔ￣ ． ｂ ｌ 核黄素操纵子 ， ｓ ｉ 将其转化）Ｂｓ ｂ ｌ Ｈ１并在染 ｋ ． ｔ￣Ｒ ３ ｕｉ
色体上进行适 当的扩增后得 到 Ｒ ３： Ｒ ６ ］ Ｈ１ ： Ｂ ３ 系列工程菌 ，其核黄素合成能力随着 ｐ Ｂ ３ 扩增程度 的增加而增强， ［ ｐ Ｒ６ 最终达到Ｉ ｌ 的６ ７ ３ ￣ 倍。随后 ￣Ｒ ３ ［ Ｂ ３ 系列 工程菌和Ｂｓｂｌ Ｂ 为亲株 进行原 生质体 融合 ，筛得 重组菌 Ｈ１：ｐ ６ ］ ：Ｒ ． ｔｉ Ｙ １ ｕ ｌ ｓ
．
ｓｒ ｎｄｂ ｒｔ ｌ ｔｕ ｉ ｆ ． ｂｉｓ ＨＩ ：ｐ Ｂ ３ ｄａ ｏ ｅ ｒ ｏ ａ ｉ ｐｏ ｕ ｉ ｔ ｉ Ｂｓｂｉｓ ｃ ｅ ｅ ｙｐｏ ｐａ ｓ ｎｏ ｓ ｔｉ Ｒ ３： Ｒ ６ １ ａ ｔ ｒ ｉ ｆ ｖｎ ｒｄ ｃ ｇｓ ａ ． ｔｉ ｅ ｏ ｓ ｆ ｏ Ｂ ｕ ｌ ［ ｎ ｎ ｈ ｂｌ ｎ ｒ ｎ ｕ ｌ
Ｂｓｂｉｓ Ｈ３ 。该菌在含 １ ％葡萄糖或蔗糖的分批 发酵中培养 ６ 可产 核黄素量４２ｇＬ ． ｔ Ｒ ３ ｕ Ｂ ０ ４ｈ ． －～。采用 以葡萄糖为碳源的流 加发酵工艺，２ 可积累核黄素 ７ ８ｇＬ ４ｈ ￣ ．一，４ ８ｈ达ｌ￣ ２ｇＬ １ －－，核黄素对葡萄糖的得率为００ ６ｇｇ １ ．５ ＇～。 关键词：枯草芽孢杆菌：核黄 素操纵子 ：基 因扩增：原生质体 融合 ；流加发酵 中图分类号：Ｔ ６ ．：Ｑ５ ３２ Ｑ４ ６２ ６ ．；Ｑ８ ３ １． ２ 文献标识码 ：Ａ
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控原理：β-甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖，还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。
酶活力单位（U）的定义：在40℃.pH5.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug 还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/ml（液体酶）表示。
一、菌株及培养基1、菌株毕赤酵母基因工程菌株man。
2一级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
3、二级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
4、发酵罐培养基：2%葡萄糖，2.7%玉米浆干粉。
5、补料培养基：50%葡萄糖。
培养基灭菌：葡萄糖与其它培养基分开灭菌，玉米浆干粉121℃灭菌20min，葡萄糖121℃灭菌15min。
发酵过程调节pH：浓氨水二、仪器设备及试剂1、仪器设备电子天枰，高压灭菌锅，5L发酵罐，100L发酵罐，移液枪及枪头（100µL量程和1mL量程），1.5mLEP 管，小型离心机，水浴锅，电热炉，10mL比色管，立式摇床。
2、所需试剂及配制① 1/15 mol/L pH5.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液称取二水磷酸氢二钠11.876g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
称取磷酸二氢钾9.078g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
用以上两种溶液按适当比例混匀得pH5.0的PBS缓冲液。
②氢氧化钠溶液（200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
③ DNS试剂称取3.15 g 3,5- 二硝基水杨酸加到500mL单蒸水中，在40℃下水浴。
然后称20g氢氧化钠，溶于100mL 单蒸水中，缓慢将氢氧化钠溶液加到DNS溶液中，一边加入，一边搅拌，直至3,5- 二硝基水杨酸全部溶解。
植酸酶基因工程菌的发酵研究
步的酶学性质研究 ， 其最适温度 、Ｈ、 热性等都能 ｐ 耐 很好的满足生产需要 ， 有很高的应用潜在价值 。在实 验室条件下对植酸酶基 因工程菌 （ 一 ） Ｅ２ 进行发酵研 ２ 究， 为发酵生产作探索性研究。
微量元素及蛋 白质等营养成分 的吸收。植 酸酶广泛 存在于动物 、 植物和微生 物中， 目前实际应用 的植酸
６ ０；ｍｅｈ ｎ ｌ ｐ ｅ ｄ ｄ ａ ｕ ｔ ． ， ｔ ａ ｏ ｐ ｎ ｅ ｍｏ ｎ ：１ ５％ ；ａ ｄ ｆ ｌ ｇ ｌ ｕ ｄ ｖ ｌ ｍｅ ０ ． Ｅ ｔ ｅ ｌ ｌｒ ｐ ｙ ａ ｅ ａ ｃ ｓ １ ６ ７ Ｕ ｍＬ ｗａ ｂ ａ ｎ ｉ ｉ ｉ ｉ ｏｕ ：１ ％ ｌｎ ｑ ｘｒ ｅｌ ａ ｈ ｔｓ ｓ ｍｕ ｈ ａ ６ ４１ ． ／ ｓ ｏ － ａ ｕ ４
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｅ ｆ ｒ ｎ ｉｇ ｐ ｏ ｅ ｓ ｓ ｏ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｓ ａ ｎ Ｅ一 ２ ｆｒｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｐ ｙａ ｅ ｗ ｒ ｔ ｄ ｅ ．Ｔ ｅ ｏ ｔ ｍ ｏ ｄ ｔ ｎ ｒ ｓ ｒ ｃ ： ｈ ｅｍｅ ｔ ｒｃ ｓ ｅ ｆ ｅ ｇ ｎ ｃ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｔ ｉ ２ ｏ ｒｄ ｃ ｎ ｈ ｔｓ ｅ ｅ ｓｕ ｉ ｄ ｎ ｔ ｎ ｒ ｈ ｐｉ ｍｕ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｉ ｏ ｌ ｕ ｄ ｆｒ ｅ ｔｔ ｎ ｗ ｒ ：ｉｏ ｕ ａｉ ｎ ａ ｅ ｂ ｕ ６ ｈ ｎ ｃ ｌ ｔ ｎ ａ ｕ ｔ １ ％ ；ｍｕ ｔ ｌ ａ ｉｎ ｔ ｉ ｉ ｅ ｑ ｍ ｎ ａｉ ｅ ｅ ｎ ｃ ｌ ｔ ｇ ：ａ ｏ ｔ ３ ；ｉ ｏ ｕ ａｉ ｍｏ ｎ ： ｏ ｏ ｏ ０ ｌｐｉ ｔ ｉ ｉ ｃ ｏ ｍｅ：７ ；ｆ ｒ ｅ ｔ ｔ ｎ ｌ ｕ ｄ ｐ ： ２ｈ ｅ ｍ ｎ ａｉ ｉ ｉ Ｈ ｏ ｑ
工程菌的知识
工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。
研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。
这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。
要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。
这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验
图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
4/8
2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
基因工程菌的发酵
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质 粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
GL-7ACA酰化酶基因工程菌(E.coliBL21(DE3)pYW—GA)发酵工艺的优化
Ｏｐ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｅ ｔ ｔｏ ｃ ｓ ｏ ｔｍ ｚ ｔｏ ｆ Ｆｅ ｍ ｎ ａ ｉ ｎ Ｐｏ ｅ ｓ ｆ ｒ ＧＬ－ ＡＣＡ ｙ ａ ｅ ７ Ａｃ ｌ ｓ
杨 志平 ， 筱 兰 ， 兵 兵 王 孙
（ 南昌大学 生命 科学学院 ， 江西 南昌 ３ ０ ３ ） ３ ０ １
摘 要 ： 索 － ￣ 成 型 重 组 大 肠 杆 菌 Ｅ ｃｌ Ｌ １ Ｄ ３ ｐ Ｗ—Ａ 高 效 表 达 Ｇ －Ａ Ａ酰 化 酶 （ Ｃ ３ １５ １ ） 探 ｒ－ ｉ ｉ ．ｏｉ ２ （ Ｅ ） Ｙ Ｇ Ｂ Ｌ７ Ｃ Ｅ ． ． ． ．１ 的发
酵工艺． 在摇瓶 培养获得 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶工程菌 的最佳发酵条件 的基础上 ， ５ Ｌ７ Ｃ 用 Ｌ自控发 酵罐进行 分批补料 培养 ， 为减少细菌代谢过程 中有 害的物质 （ 主要是 乙酸 ） 的产生及酶的高效表达 ， 发酵过程 中采用不 同的流加方 式进行补 料， 同时对 转速和溶 氧等进行控制． 考察 了恒速流加 、Ｈ反馈流加和指数流加 几种补料模 式 ， ｐ 比较得 出菌浓最高 的 是 ｐ ８０反馈流 加这一模 式 ， Ｄ 可达 ３ ， Ｈ． ０ ５ 而酶活 最高的模式是 ｐ ７ ０反馈流加 ， Ｈ． 最高酶 活可达 ３４ ３ ８Ｕ Ｌ 大 ６ ． ／ ． 肠杆菌 Ｅ ｌ Ｌ １ Ｄ ３ ｐ Ｗ． Ａ高效 表达 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶 的发酵工艺 的建立为工 业化生产 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶和 ｃ ｉ ２ （ Ｅ ）Ｙ Ｇ ｏＢ Ｌ７ Ｃ Ｌ７ Ｃ 头孢类抗生素提供 了基础 ． 关键词 ：Ｌ７ Ｃ Ｇ －Ａ Ａ酰化 酶 ； 因工程菌 ； 基 补料分批发酵 ； 高效表达
乳铁蛋白肽基因工程菌(E.col-ipED-LfcinB BL21)的发酵与诱导表达条件优化
２ １０ ； ３ 上 海 市 高 校 水 产 养 殖 学 Ｅ一 究 院 ， 海 ０ ３６ ． 研 上
摘 要 ： 铁 蛋 白肽 是 乳 铁 蛋 白在 酸 性 条 件 下 经 胃 蛋 白酶 裂 解 ， Ｎ 端 释 放 的 具 有 两 亲 性 的 阳离 子 多 肽 ， 有 乳 从 具 广 谱 抗 菌 等 诸 多 生 理 功 能 。 目前 ， 铁 蛋 白肽 主要 是 通 过 水 解 乳 铁 蛋 白来 获 得 ， 本 昂 贵 ， 基 因技 术 是 大规 乳 成 转 模 生产 乳 铁 蛋 白 肽 的 最佳 途径 ， 验 比 较 了 常 用 碳 源 和 氮 源 对 已 构 建 的 基 因 工 程 菌 的 菌 体 生 物 量 及 蛋 白表 试 达 量 的 影 响 ， 采 用 正 交 试 验 对 工 程 菌 的发 酵 与诱 导 表 达 条 件 进 行 优 化 。结 果 表 明 ： 溶 性 淀 粉 和 牛 肉 膏 可 并 可
基 金 项 目 ： 海 市 教 育 委 员 会 科 研 创 新 项 目（ ９ Ｚ ６ ） 上 ０ Ｚ １ ６ ；上 海 高 校 创 新 团 队 建 设 项 目 ； 海 市 教 育 委 员 会 重 点 学 科 建 设 项 目 上
（５ ７ ４ Ｊ０ ０ ）
作者简介 ： 巴特 （ ９ ６一） 男 ， 士 研 究 生 ， 究 方 向 为 营养 与食 品安 全 。Ｅ ｍ ｉ ｔｓｎ ｙｈｏ ｔｍ ｃ １８ ， 硕 研 ． ａｌ ８ｕ ＠ ａ ｏ．ｏ ． ｎ ： 通 信 作 者 ： 承 初 （ ９ ５一） 女 ， 授 ， 士 ， 究 方 向为 海 洋 生 物 资 源 利 用 、 养 与 食 品 安 全 。 刘 １６ ， 教 博 研 营
具有 开 发价值 的一 个 选择 ， 目前 已有 许 多 学 者克 隆 了人 、 和猪 乳 铁 蛋 白肽 基 因 ， 在 细 菌 牛 并 、
基因工程大肠杆菌发酵的研究
讨论
• 含PL启动子的 启动子的E.coli工程菌的表达及温度敏感株 启动子的 工程菌的表达及温度敏感株 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（ ℃ 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（30℃） 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度， 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度，然后迅 速提高温度诱导目的产物的表达。 速提高温度诱导目的产物的表达。 • 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素：一是 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素： 在30℃发酵过程中尽可能提高菌体密度；二是快 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度； 速升温诱导。 速升温诱导。
• 科学家们把人的胰岛素基 因送到大肠杆菌的细胞里， 因送到大肠杆菌的细胞里， 让胰岛素基因和大肠杆菌 的遗传物质相结合。 的遗传物质相结合。人的 胰岛素基因在大肠杆菌的 细胞里指挥着大肠杆菌生 产出了人的胰岛素。 产出了人的胰岛素。并随 着它的繁殖， 着它的繁殖，胰岛素基因 也一代代的传了下去， 也一代代的传了下去，后 代的大肠杆菌也能生产胰 岛素了。 岛素了。这种带上了人工 给予的新的遗传性状的细 被称为基因工程菌。 菌，被称为基因工程菌。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（ 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、 （ ， ）干扰素、链激酶、 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、 型肝炎检测试 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程产业化除上游构建工程菌之外， 基因工程产业化除上游构建工程菌之外，下 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破 目的产物的分离、纯化、 碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天 然结构使之具有生物活性， 然结构使之具有生物活性，有的表达产物还需进 一步加工修饰， 一步加工修饰，如人胰岛素原的化学切断与酶切 降钙素C-末端的酰胺化修饰 末端的酰胺化修饰， 断，降钙素 末端的酰胺化修饰，以及质量控制 等，没有这些下游技术的建立就没有基因工程产 品。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
工程菌
发酵时，随DO浓度的下降，细 胞生长减慢。 外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。 维持较高的DO值，才能提高工 程菌的生长，利于外源蛋白产物的 形成。
采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提高 活菌产量。
⒌ 热诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱 导表达。 要求在2min内让罐升温达到42 。 升温时间太长，会降低外源蛋白表达量， 也给提取纯化增加困难。
微生物发酵目的是为了获得初级或次 级代谢产物，细胞生长并非主要目标 应用发酵罐大规模培养基因工程菌是 为了获得最大量的基因表达产物。
发酵罐的组成有：
发酵罐体
保证高传质作用的搅拌器 精细的温度控制和灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制和连续操作系统。
发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
表达产物不稳定：
人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的
延长，干扰素活性反而下降。
影响工程菌稳定性的因素： （1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上
有重复序列等。
（2）宿主 ：宿主中重组基因的完整性、重组时有关
基因的变异等。
（3）环境因素 ：高温、去垢剂、某些药物(如利福
平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的 丢失。
b 抗生素依赖变异法
诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组 质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向
培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。
c 、营养缺陷型法
诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重
基因工程菌发酵培养的流程
基因工程菌发酵培养的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
基因工程菌发酵及相关技术交流
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
基因工程菌发酵
频率； ⑵这两种菌比数率差异的大小。
对同一工程菌控制不同的比生长 数率可改变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高如增加工程菌质粒拷 贝数可提高稳定性；
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率低但对稳定性不利。
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性 有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降， 但稳定性增加。
工艺要求：外源基因既高效表达， 又有利于产品分离纯化。对发酵 影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响
⒈培养基的影响
培养基的组成既要提高工程菌的 生长速率，又要保持工程菌的稳定性， 使外源基因高效表达。常用的碳源有： 葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖 等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋 白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、 硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维 生素等。
控制菌体的生长对提高质粒的稳 定性、减少代谢副产物积累、提高外 源蛋白产率有重要意义。
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比 值是基本恒定的，因而菌体的生长 速度反映了蛋白质的合成速度。
培养条件的改变，都会改变菌 体的能量代谢和小分子前体的供应， 影响生物大分子的和成和菌体的生 长。
一、菌体的生长与能量的关系
为了提高质粒稳定性，工程菌培 养采用两阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
由于第一阶段外源基因未表达， 减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速 率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒 丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养 基组分和溶解氧浓度
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响