基因工程菌的发酵共36页
第三章 基因工程菌发酵ppt课件
酶的活性下降 ● 采用trp启动子
色氨酸和吲哚丙烯酸（IAA）影响外源基因的表 达
● 酵母表达系统 毕赤酵母和汉逊酵母等甲醇营养酵母表达系统 具有高表达效率和分泌功能
表达阶段，需甲醇进行诱导，同时还作为碳源 若甲醇浓度过低，影响外源基因的表达 若甲醇浓度过高，产生抑制作用 利用甲醇传感器进行在线检测和补料控制 控制甲醇浓度在0.3%，蛋白产量可增加5倍
式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失 质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为 系数
带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质）
基本培养基﹥复合培养基
基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响
3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制
1、高密度培养 ●重组菌生长的障碍
■重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ■重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合 成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高 度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的 比生长速率往往远小于宿主菌
5、代谢副产物的影响 培养过程的代谢副产物积累对重组产物的生产
产生影响 大肠杆菌培养：
产生副产物醋酸 对外源基因的表达具有强烈的抑制作用 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α2干扰素： 随着醋酸浓度的增加 干扰素的比生产速率急剧下降
因此，发酵过程应避免醋酸的生成
减少乙酸积累的对策
■宿主菌
才能保证工程菌顺利实现产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率
第5章基因工程菌的发酵
5.3 基因工程菌的高密度发酵
• 高密度发酵的优点：提高产物的生成速率、 提高目标产物的浓度，有利于进一步的产 品分离，减少反应器的体积。 • 分批培养不可能获得高菌体密度的发酵液， 通常采用补料分批培养实现。 • 5.3.1 高密度发酵 • 5.3.2 代谢副产物生成的防止 • 5.3.3 例
• 但高密度培养的实现并不一定意味外源基 因的高表工艺条件，并 结合反应器的合理设计，配臵，操作和控 制，才能实现高效表达的目标。 • 5.3.1 高密度发酵的培养基优化 • 高密度发酵，关键是菌体生长所需的营养 成分合理。培养基的优化非常重要。 • 常用培养基中有些元素过量。
5.2.2 比生长速率
• 许多基因工程菌外源蛋白质的生产显示出 与生长速率正相关的特点。 • 故保持较高的比生长速率可提高目标蛋白 质的产量。 • 对于外源基因需诱导表达的基因工程菌发 酵，可分为菌体生长和外源基因诱导表达 两个阶段。分别控制合适的生长和表达条 件。
5.2.3培养条件
• 5.2.3.1 溶氧 • 外源基因的高表达需要细胞合成大量的 mRNA和重组蛋白，占用细胞的mRNA合成酶 和核糖体等资源，消耗更多的营养和能量， 给宿主细胞带来了很大的代谢负担，在培 养中显示更高的维持系数，因此基因工程 菌发酵中，一般应提供足够的氧以满足其 代谢的需要。 • 但仍需通过实验确定最佳的供氧水平。
影响基因工程菌质粒稳定性的因素
遗传因素
质粒的结构 质粒的拷贝数 宿主细胞特性 选择性遗传标记 外源基因表达水平
环境因素
培养基 限制性底物 比生长速率 溶氧 温度 发酵操作方式
5.1.1 培养条件对稳定性的影响
• • • • 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 培养基的影响 比生长速率的影响 外源基因的表达的影响 其它培养条件的影响
第11章 基因工程菌发酵
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细 胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个 细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。
质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、 培养基组成和恒化器中的稀释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形 成一个单位。
经n次传代后，重组菌在培养液中的比例为：
Fn
1 p 1 p 2n( p1)
(3-1)
式中α=μ－/μ﹢，由于宿主菌更具生长优势，2﹥α﹥1 μ－ =0，反映了营养缺陷型宿主丢失了质粒中合成有关 缺陷的营养物质的酶 μ－﹤0，反映了重组菌丢失其耐药性被杀死的情况
Ollis和Chang提出了丢失了质粒的重组菌在分批培养 中的动力学模型（生长、消耗、合成）
第十一章 基因工程菌发酵
主要内容
第一节 概述 第二节 基因工程菌的稳定性 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 基因工程菌发酵过程的工艺控制 第五节 重组大肠杆菌的培养策略 第六节 甲醇营养型酵母的生长与表达 第七节 培养装置与产物的提取
第一节 概 述
近年来，重组DNA技术已由实验室研究走向生产应用。 它不仅提供了一种有效的菌种改良技术，也为攻克医学 上的疑难杂症 (癌、遗传病及艾滋病等) 的治愈提供了可能； 为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提 供了有力的手段。 由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长 激素、乙肝表面抗原等已先后面市。
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常 改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。
例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动 子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DN双术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症一一癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。
现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、十扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程(genetic engineering )是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA勺重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DN"子，然后在将重组DN"子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DN济组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DN"段，这种DN隔段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病蠹DN础接成重组DNR三是把重组DN闻|入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五白万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。
第11章 基因工程菌发酵——【发酵工程 精】
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如产品翻译后不需修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。 优点： 生理学和遗传学背景了解得深入，有利于进行复杂的基 因操作。 有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）； 能生长在简单的便宜的培养基上。
三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 部分可高产 对原核好 融合蛋白
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
不大
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
二、基因工程菌发酵的特点
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大 量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长 得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导 致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
1、分离丢失
基因工程菌生产的产品主要有二类：
蛋白质
非蛋白质
基因工程菌发酵水平取决于：
菌种遗传特性
发酵工艺及控制
发酵罐的性能与操作
——掌握工程菌的发酵特性、过程控 制和优化及放大特点，才能保证工程菌顺利实现 产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
一、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统。 要求：翻译后的修饰要简单；如果用于食品要考虑宿主
白信号肽序列的下游。
2、G+ 细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion） 到胞外。不能使蛋白质糖基化 缺陷:
最新第十三章 基因工程菌的发酵课件ppt
6. 排液
安全的方法是在培养开始前就将排液口与下段 工序相连接并进行灭菌，这样培养于结束即可直接 输送培养液。
三、培养罐的管道布局
四、基因工程产品的提取和精制
传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的 不同：
（1）传统发酵产品多为小分子，其理化性能都已知， 放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子， 必要数据缺乏，放大多凭经验。
第十三章 基因工程菌 的发酵
第一节 工程菌的来源和应用
一、何谓基因工程
基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上， 采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿， 主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再 转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造 出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地 遗传给后代。
物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给 实验人员和向外界扩散。
实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实 验室设计和实验注意事项组成。
密封程度分为P1、P2、P3和P4级。
生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存 的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通 过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外 扩散。
2. 质粒稳定性 Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因 工程细胞数与总细胞数的比值。
3. 表达效率及质粒拷贝数控制
第三节 工程菌分批培养动力学
对于质粒脱落性不稳定，细胞在分裂时丢失质粒的 概率为p 。
dX m S (1 p)X
dt
KS S
dX m S X m S pX
dt
KS S
KS S
dX mXmXp dX (1p)mX
对于底物 dS 1 dX 1 dX dt Y dt Y dt
基因工程菌发酵
基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。
二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。
五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。
《基因工程菌发酵》PPT课件
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分批培养中选择不同的碳源，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生。
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大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提 高产量。
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它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的 RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少。
也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应。
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第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件,如温度、pH、培养基各种组分、 碳氧比，分析表达产物的合成、积累 对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。
高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
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“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并合 成被称为魔点的ppGpp的结果。
ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录。
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
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发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
基因工程大肠杆菌发酵的研究ppt课件
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Hale Waihona Puke 生产型发酵罐： 夹套：设计压力0.3 Mpa，夹套材质： 304不锈钢，用于温控、辅助灭菌；采 用优化导流设计，提高了交换效率和罐 内温度的均匀性； 进气过滤：采用一路深层通气质量流量 计显示，采用精度为0.2μm的进口除菌 过滤器，配空气分布器，防倒流装置； 确保安全并可独立灭菌，大大延长使用 寿命； 电机：采用德国汉森公司的调速电机 （加强型冷却装置，确保电机能在恶劣 的环境中长期运行）； 调 速 器：日本变频调速器 专用无菌取样阀：在位灭菌、微量取样 不染菌，无死角，不积料，使用方便； 专用无菌放料阀：在位灭菌、材质特制， 可无杂菌放料，无死角，不积料，使用 方便； 灭菌：蒸汽在位灭菌。设置灭菌程序， 灭菌温度100-130℃； 移种：316L不锈钢光亮管，隔膜阀。 在位灭菌； 控制系统： 德国西门子PLC控制核心+ 工业平板电脑；
生物工程下游技术
• 一、什么叫生物工程下游技术？其主要研 究那些内容？ 下游技术指的是生物工程技术具体的工 业实现方面的技术开发。 例如生物工程菌的发酵技术、发酵菌的 代谢产物中目标产品的分离提取技术、工 艺过程中的质量控制技术、质量控制标准 的研究和相关的分析技术等。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
• 一、什么是基因工程菌？ • 二、为什么要制备基因工程菌？ • 三、生物工程下游技术
基因工程菌的发酵研究
《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.2基因工程菌的发酵研究李会成 李文辉 郭 军 刘利民(哈尔滨市医药工程技术研究开发中心 150020)摘要 本文对大肠杆菌表达的rhG M-CSF工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响,优化了影响发酵的各种条件,形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺,并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。
关键词 工程菌发酵 外源蛋白 高密度 高表达 利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产之目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染,外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。
一、材料与方法111 材料重组工程菌系本所保存,宿主菌为E.co li DH5a。
Yeast Ex tract,Po lypep tone均为OX I OD 公司产品,其它所需试剂均为国产分析纯试剂。
112 方法11211 摇床条件下培养:30℃,120rpm培养到OD600达012-018时,水浴升温到42℃,继续培养3小时,取1m l离心收集菌体,做SD S2 PA GE分析。
11212 rh G M2CSF表达量测定用常规SD S-PA GE分析,用Phar m acia公司激光扫描仪扫描分析。
SD S2PA GE方法按文献(1)方法做。
11213 发酵采用美国NB S公司的40L发酵罐,按操作说明书操作。
11214 菌体测量采用称重法和浊度法。
11215 9501批发酵不添加任何营养物,9502批,高密度发酵都采用流加工艺,补加有机营养。
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– 诱导剂量
过量诱导往往对细胞生长和代谢活性以及基 因的表达具有抑制作用
使用热诱导时不能用过高的温度
13.3 发酵中影响基因表达的因素
代谢副产物的影响
– 常见的基因工程菌产生的抑制性代谢副产物
大肠杆菌产生乙酸 枯草杆菌产生乙酸和丙酸 酵母产酒精
13.4 基因工程菌的高密度发酵
实现基因工程菌高密度发酵的方法
– 流加培养技术 – 先采用合适的流加培养技术将基因工程菌
培养到一定的浓度(如50gDCW/L) – 然后通过诱导启动重组基因的表达
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
建立基因工程菌发酵动力学模型应从基 因工程菌发酵与一般的微生物发酵的差 别着手
– 一般而言营养丰富的复合培养基比合成培养基的 效果好，缓慢利用的碳源比葡萄糖的效果好
– 不同的表达系统对营养物质有不同的要求 – 相同的表达系统在表达不同的外源蛋白时也对培
养基有不同的要求
13.3 发酵中影响基因表达的因素
发酵过程中比生长速率的影响
– 比生长速率的影响尚无定论 – 因不同的表达系统而异
热诱导
13.3 发酵中影响基因表达的因素
外源基因表达的一般过程
– 复制
质粒的稳定性
Hale Waihona Puke – 转录诱导 分解代谢物阻遏
– 翻译
mRNA的半衰期(寿命) 氨基酸是否供给充分
– 表达后的修饰和分泌
13.3 发酵中影响基因表达的因素
培养基对基因工程菌发酵的影响
– 培养基的浓度和配比不但影响菌体的生长，而且 影响外源蛋白的表达
– 质粒的不稳定性
野生菌的生长优势 结构的不稳定性 分配的不稳定性
– 重组蛋白质的表达 – 诱导
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
Lee的模型
– 发表在Bioengineering and Biotechnology (生 物工程与技术)上
– 充分考虑了质粒的不稳定性，将培养液中 的微生物分为三种
13.2 基因工程菌的稳定性
引起质粒-宿主表达系统不稳定性的因素
– 不含质粒的细菌对工程菌的生长优势 – 质粒分配的不稳定性
质粒在子代微生物中的不均一分配
– 质粒结构的不稳定性
质粒DNA易发生突变，同时也容易受到宿主 菌核酸酶的攻击
13.2 基因工程菌的稳定性
考虑一个质粒-宿主表达系统
a SP (2k)P kN
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌的安全性受到关注的原因
– 基因工程菌都含有外源DNA片段，其遗传 结构与自然界中的DNA相比有较大的差别
– 一般含有抗生素抗性基因 – 有的含有病毒的遗传信息
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌泄露的防护措施
– 物理防护
实验室规模上有P1-P4四个等级 工业规模上则有LS1、LS2两个等级 LS-1的设备标准
– 解决代谢副产物抑制的方法
控制快速利用碳源(葡萄糖)的浓度 使用缓慢利用碳源 在线分离抑制物质
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌的稳定性对发酵的影响
– 发酵液中丢失质粒的工程菌数量多 – 解决这一问题的方法
正常的基因工程菌 质粒结构发生变化的工程菌 野生菌
– 考虑了细胞内mRNA的合成与外源蛋白表达 的关系
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
dd1X t1X1(1)1X1
dd2 X t2X2(1)1X1
d d3X t3X 31X 12X 2
有的表达系统需要高的比生长速率 有的则需要比较低的比生长速率 有的工程菌的表达效率在比生长速率为零时
(稳定期)最高
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
温度的影响
– 温度影响质粒的稳定性 – 影响细胞内酶的活性和重组蛋白的合成速度 – 影响重组蛋白的稳定性
构建更为稳定的工程菌 使用整合型的表达系统 使用可诱导的表达系统并控制诱导的时机，将
基因工程菌的生长和外源蛋白的表达分开进行 在发酵过程中使用抗生素抑制野生菌的生长
13.4 基因工程菌的高密度发酵
若每个基因工程菌产生重组蛋白的能力相同， 则重组蛋白的生产能力与菌体量成正比
dP dt
qP
X
– 培养装置密闭 – 排气经过无菌过滤
– 生物防护
EK1-EK3三个等级
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
外源基因表达系统可以分为两种类型
– 质粒-宿主表达系统
外源基因位于工程菌的质粒上 存在质粒的不稳定性
– 整合型表达系统
外源基因位于宿主菌的染色体上 稳定性的问题相对不太严重
较低 的温度下重组蛋白稳定
– 有些表达系统采用热诱导
诱导温度的确定
13.3 发酵中影响基因表达的因素
溶氧(DO)的影响
– 溶氧对基因工程菌发酵的影响取决于 工程菌的特性
宿主菌为需要菌时一般要有较高的溶氧 宿主菌为厌氧菌时则需要厌氧培养
13.3 发酵中影响基因表达的因素
诱导
– 诱导时机
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
– 温度
高温时质粒的稳定性较差
– pH
pH接近于基因工程菌的最适生长pH时质粒的稳 定性较高
– 溶氧
在基因工程菌的发酵过程中保持较高的溶氧有 利于质粒的稳定
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
– 细胞的固定化
固定化细胞可以提高质粒的稳定性
– 外源基因的表达
外源基因的表达会引起质粒的不稳定性问题 采用可诱导的表达方式
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌发酵的特殊性
– 生长速度比野生菌株慢 – 存在稳定性的问题 – 外源基因的表达一般需要诱导
化学诱导
– IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，乳糖等
b SN 2N
1k F1k2n(k1)
2 1
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
– 培养基的影响
复合培养基(完全培养基)对质粒的稳定性有利 基本培养基
– 比生长速率
比生长速率高时有利于质粒稳定
13.2 基因工程菌的稳定性