基因工程菌的发酵共36页
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热诱导
13.3 发酵中影响基因表达的因素
外源基因表达的一般过程
– 复制
质粒的稳定性
– 转录
诱导 分解代谢物阻遏
– 翻译
mRNA的半衰期(寿命) 氨基酸是否供给充分
– 表达后的修饰和分泌
13.3 发酵中影响基因表达的因素
培养基对基因工程菌发酵的影响
– 培养基的浓度和配比不但影响菌体的生长，而且 影响外源蛋白的表达
13.4 基因工程菌的高密度发酵
实现基因工程菌高密度发酵的方法
– 流加培养技术 – 先采用合适的流加培养技术将基因工程菌
培养到一定的浓度(如50gDCW/L) – 然后通过诱导启动重组基因的表达
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
建立基因工程菌发酵动力学模型应从基 因工程菌发酵与一般的微生物发酵的差 别着手
– 一般而言营养丰富的复合培养基比合成培养基的 效果好，缓慢利用的碳源比葡萄糖的效果好
– 不同的表达系统对营养物质有不同的要求 – 相同的表达系统在表达不同的外源蛋白时也对培
养基有不同的要求
13.3 发酵中影响基因表达的因素
发酵过程中比生长速率的影响
– 比生长速率的影响尚无定论 – 因不同的表达系统而异
13.2 基因工程菌的稳定性
引起质粒-宿主表达系统不稳定性的因素
– 不含质粒的细菌对工程菌的生长优势 – 质粒分配的不稳定性
质粒在子代微生物中的不均一分配
– 质粒结构的不稳定性
质粒DNA易发生突变，同时也容易受到宿主 菌核酸酶的攻击
13.2 基因工程菌的稳定性
考虑一个质粒-宿主表达系统
a SP (2k)P kN
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
– 温度
高温时质粒的稳定性较差
– pH
pH接近于基因工程菌的最适生长pH时质粒的稳 定性较高
– 溶氧
在基因工程菌的发酵过程中保持较高的溶氧有 利于质粒的稳定
Байду номын сангаас
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
构建更为稳定的工程菌 使用整合型的表达系统 使用可诱导的表达系统并控制诱导的时机，将
基因工程菌的生长和外源蛋白的表达分开进行 在发酵过程中使用抗生素抑制野生菌的生长
13.4 基因工程菌的高密度发酵
若每个基因工程菌产生重组蛋白的能力相同， 则重组蛋白的生产能力与菌体量成正比
dP dt
qP
X
正常的基因工程菌 质粒结构发生变化的工程菌 野生菌
– 考虑了细胞内mRNA的合成与外源蛋白表达 的关系
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
dd1X t1X1(1)1X1
dd2 X t2X2(1)1X1
d d3X t3X 31X 12X 2
较低 的温度下重组蛋白稳定
– 有些表达系统采用热诱导
诱导温度的确定
13.3 发酵中影响基因表达的因素
溶氧(DO)的影响
– 溶氧对基因工程菌发酵的影响取决于 工程菌的特性
宿主菌为需要菌时一般要有较高的溶氧 宿主菌为厌氧菌时则需要厌氧培养
13.3 发酵中影响基因表达的因素
诱导
– 诱导时机
– 质粒的不稳定性
野生菌的生长优势 结构的不稳定性 分配的不稳定性
– 重组蛋白质的表达 – 诱导
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
Lee的模型
– 发表在Bioengineering and Biotechnology (生 物工程与技术)上
– 充分考虑了质粒的不稳定性，将培养液中 的微生物分为三种
– 培养装置密闭 – 排气经过无菌过滤
– 生物防护
EK1-EK3三个等级
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
外源基因表达系统可以分为两种类型
– 质粒-宿主表达系统
外源基因位于工程菌的质粒上 存在质粒的不稳定性
– 整合型表达系统
外源基因位于宿主菌的染色体上 稳定性的问题相对不太严重
– 解决代谢副产物抑制的方法
控制快速利用碳源(葡萄糖)的浓度 使用缓慢利用碳源 在线分离抑制物质
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌的稳定性对发酵的影响
– 发酵液中丢失质粒的工程菌数量多 – 解决这一问题的方法
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌的安全性受到关注的原因
– 基因工程菌都含有外源DNA片段，其遗传 结构与自然界中的DNA相比有较大的差别
– 一般含有抗生素抗性基因 – 有的含有病毒的遗传信息
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌泄露的防护措施
– 物理防护
实验室规模上有P1-P4四个等级 工业规模上则有LS1、LS2两个等级 LS-1的设备标准
由于外源蛋白的表达对工程菌的生长有抑制 作用，故一般在对数生长后期进行诱导
– 诱导剂量
过量诱导往往对细胞生长和代谢活性以及基 因的表达具有抑制作用
使用热诱导时不能用过高的温度
13.3 发酵中影响基因表达的因素
代谢副产物的影响
– 常见的基因工程菌产生的抑制性代谢副产物
大肠杆菌产生乙酸 枯草杆菌产生乙酸和丙酸 酵母产酒精
b SN 2N
1k F1k2n(k1)
2 1
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
– 培养基的影响
复合培养基(完全培养基)对质粒的稳定性有利 基本培养基
– 比生长速率
比生长速率高时有利于质粒稳定
13.2 基因工程菌的稳定性
– 细胞的固定化
固定化细胞可以提高质粒的稳定性
– 外源基因的表达
外源基因的表达会引起质粒的不稳定性问题 采用可诱导的表达方式
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌发酵的特殊性
– 生长速度比野生菌株慢 – 存在稳定性的问题 – 外源基因的表达一般需要诱导
化学诱导
– IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，乳糖等
有的表达系统需要高的比生长速率 有的则需要比较低的比生长速率 有的工程菌的表达效率在比生长速率为零时
(稳定期)最高
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
温度的影响
– 温度影响质粒的稳定性 – 影响细胞内酶的活性和重组蛋白的合成速度 – 影响重组蛋白的稳定性
13.3 发酵中影响基因表达的因素
外源基因表达的一般过程
– 复制
质粒的稳定性
– 转录
诱导 分解代谢物阻遏
– 翻译
mRNA的半衰期(寿命) 氨基酸是否供给充分
– 表达后的修饰和分泌
13.3 发酵中影响基因表达的因素
培养基对基因工程菌发酵的影响
– 培养基的浓度和配比不但影响菌体的生长，而且 影响外源蛋白的表达
13.4 基因工程菌的高密度发酵
实现基因工程菌高密度发酵的方法
– 流加培养技术 – 先采用合适的流加培养技术将基因工程菌
培养到一定的浓度(如50gDCW/L) – 然后通过诱导启动重组基因的表达
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
建立基因工程菌发酵动力学模型应从基 因工程菌发酵与一般的微生物发酵的差 别着手
– 一般而言营养丰富的复合培养基比合成培养基的 效果好，缓慢利用的碳源比葡萄糖的效果好
– 不同的表达系统对营养物质有不同的要求 – 相同的表达系统在表达不同的外源蛋白时也对培
养基有不同的要求
13.3 发酵中影响基因表达的因素
发酵过程中比生长速率的影响
– 比生长速率的影响尚无定论 – 因不同的表达系统而异
13.2 基因工程菌的稳定性
引起质粒-宿主表达系统不稳定性的因素
– 不含质粒的细菌对工程菌的生长优势 – 质粒分配的不稳定性
质粒在子代微生物中的不均一分配
– 质粒结构的不稳定性
质粒DNA易发生突变，同时也容易受到宿主 菌核酸酶的攻击
13.2 基因工程菌的稳定性
考虑一个质粒-宿主表达系统
a SP (2k)P kN
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
– 温度
高温时质粒的稳定性较差
– pH
pH接近于基因工程菌的最适生长pH时质粒的稳 定性较高
– 溶氧
在基因工程菌的发酵过程中保持较高的溶氧有 利于质粒的稳定
Байду номын сангаас
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
构建更为稳定的工程菌 使用整合型的表达系统 使用可诱导的表达系统并控制诱导的时机，将
基因工程菌的生长和外源蛋白的表达分开进行 在发酵过程中使用抗生素抑制野生菌的生长
13.4 基因工程菌的高密度发酵
若每个基因工程菌产生重组蛋白的能力相同， 则重组蛋白的生产能力与菌体量成正比
dP dt
qP
X
正常的基因工程菌 质粒结构发生变化的工程菌 野生菌
– 考虑了细胞内mRNA的合成与外源蛋白表达 的关系
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
dd1X t1X1(1)1X1
dd2 X t2X2(1)1X1
d d3X t3X 31X 12X 2
较低 的温度下重组蛋白稳定
– 有些表达系统采用热诱导
诱导温度的确定
13.3 发酵中影响基因表达的因素
溶氧(DO)的影响
– 溶氧对基因工程菌发酵的影响取决于 工程菌的特性
宿主菌为需要菌时一般要有较高的溶氧 宿主菌为厌氧菌时则需要厌氧培养
13.3 发酵中影响基因表达的因素
诱导
– 诱导时机
– 质粒的不稳定性
野生菌的生长优势 结构的不稳定性 分配的不稳定性
– 重组蛋白质的表达 – 诱导
13.5 基因工程菌发酵动力学模型
Lee的模型
– 发表在Bioengineering and Biotechnology (生 物工程与技术)上
– 充分考虑了质粒的不稳定性，将培养液中 的微生物分为三种
– 培养装置密闭 – 排气经过无菌过滤
– 生物防护
EK1-EK3三个等级
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
外源基因表达系统可以分为两种类型
– 质粒-宿主表达系统
外源基因位于工程菌的质粒上 存在质粒的不稳定性
– 整合型表达系统
外源基因位于宿主菌的染色体上 稳定性的问题相对不太严重
– 解决代谢副产物抑制的方法
控制快速利用碳源(葡萄糖)的浓度 使用缓慢利用碳源 在线分离抑制物质
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌的稳定性对发酵的影响
– 发酵液中丢失质粒的工程菌数量多 – 解决这一问题的方法
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌的安全性受到关注的原因
– 基因工程菌都含有外源DNA片段，其遗传 结构与自然界中的DNA相比有较大的差别
– 一般含有抗生素抗性基因 – 有的含有病毒的遗传信息
13.1 基因工程菌的安全性问题
基因工程菌泄露的防护措施
– 物理防护
实验室规模上有P1-P4四个等级 工业规模上则有LS1、LS2两个等级 LS-1的设备标准
由于外源蛋白的表达对工程菌的生长有抑制 作用，故一般在对数生长后期进行诱导
– 诱导剂量
过量诱导往往对细胞生长和代谢活性以及基 因的表达具有抑制作用
使用热诱导时不能用过高的温度
13.3 发酵中影响基因表达的因素
代谢副产物的影响
– 常见的基因工程菌产生的抑制性代谢副产物
大肠杆菌产生乙酸 枯草杆菌产生乙酸和丙酸 酵母产酒精
b SN 2N
1k F1k2n(k1)
2 1
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
13.2 基因工程菌的稳定性
培养条件对工程菌稳定性的影响
– 培养基的影响
复合培养基(完全培养基)对质粒的稳定性有利 基本培养基
– 比生长速率
比生长速率高时有利于质粒稳定
13.2 基因工程菌的稳定性
– 细胞的固定化
固定化细胞可以提高质粒的稳定性
– 外源基因的表达
外源基因的表达会引起质粒的不稳定性问题 采用可诱导的表达方式
13.3 发酵中影响基因表达的因素
基因工程菌发酵的特殊性
– 生长速度比野生菌株慢 – 存在稳定性的问题 – 外源基因的表达一般需要诱导
化学诱导
– IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，乳糖等
有的表达系统需要高的比生长速率 有的则需要比较低的比生长速率 有的工程菌的表达效率在比生长速率为零时
(稳定期)最高
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
13.3 发酵中影响基因表达的因素
温度的影响
– 温度影响质粒的稳定性 – 影响细胞内酶的活性和重组蛋白的合成速度 – 影响重组蛋白的稳定性