基因工程菌发酵操作流程
第三章 基因工程菌发酵ppt课件
酶的活性下降 ● 采用trp启动子
色氨酸和吲哚丙烯酸（IAA）影响外源基因的表 达
● 酵母表达系统 毕赤酵母和汉逊酵母等甲醇营养酵母表达系统 具有高表达效率和分泌功能
表达阶段，需甲醇进行诱导，同时还作为碳源 若甲醇浓度过低，影响外源基因的表达 若甲醇浓度过高，产生抑制作用 利用甲醇传感器进行在线检测和补料控制 控制甲醇浓度在0.3%，蛋白产量可增加5倍
式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失 质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为 系数
带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质）
基本培养基﹥复合培养基
基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响
3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制
1、高密度培养 ●重组菌生长的障碍
■重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ■重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合 成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高 度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的 比生长速率往往远小于宿主菌
5、代谢副产物的影响 培养过程的代谢副产物积累对重组产物的生产
产生影响 大肠杆菌培养：
产生副产物醋酸 对外源基因的表达具有强烈的抑制作用 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α2干扰素： 随着醋酸浓度的增加 干扰素的比生产速率急剧下降
因此，发酵过程应避免醋酸的生成
减少乙酸积累的对策
■宿主菌
才能保证工程菌顺利实现产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改进技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了根底；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。
现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝外表抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使本钱大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。
第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程〔genetic engineering〕是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA的重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DNA 重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因〞；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA 分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术〞是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程〞，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控原理：β-甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖，还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。
酶活力单位（U）的定义：在40℃.pH5.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug 还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/ml（液体酶）表示。
一、菌株及培养基1、菌株毕赤酵母基因工程菌株man。
2一级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
3、二级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
4、发酵罐培养基：2%葡萄糖，2.7%玉米浆干粉。
5、补料培养基：50%葡萄糖。
培养基灭菌：葡萄糖与其它培养基分开灭菌，玉米浆干粉121℃灭菌20min，葡萄糖121℃灭菌15min。
发酵过程调节pH：浓氨水二、仪器设备及试剂1、仪器设备电子天枰，高压灭菌锅，5L发酵罐，100L发酵罐，移液枪及枪头（100µL量程和1mL量程），1.5mLEP 管，小型离心机，水浴锅，电热炉，10mL比色管，立式摇床。
2、所需试剂及配制① 1/15 mol/L pH5.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液称取二水磷酸氢二钠11.876g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
称取磷酸二氢钾9.078g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
用以上两种溶液按适当比例混匀得pH5.0的PBS缓冲液。
②氢氧化钠溶液（200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
③ DNS试剂称取3.15 g 3,5- 二硝基水杨酸加到500mL单蒸水中，在40℃下水浴。
然后称20g氢氧化钠，溶于100mL 单蒸水中，缓慢将氢氧化钠溶液加到DNS溶液中，一边加入，一边搅拌，直至3,5- 二硝基水杨酸全部溶解。
基因工程菌发酵操作流程
基因工程菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接补料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。
17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。
18.补碱时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。
20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。
21.补料时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，设置流量。
22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。
23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。
24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。
25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐离心。
芽孢杆菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
基因工程菌发酵培养的流程
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
最新第十三章 基因工程菌的发酵课件ppt
6. 排液
安全的方法是在培养开始前就将排液口与下段 工序相连接并进行灭菌，这样培养于结束即可直接 输送培养液。
三、培养罐的管道布局
四、基因工程产品的提取和精制
传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的 不同：
（1）传统发酵产品多为小分子，其理化性能都已知， 放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子， 必要数据缺乏，放大多凭经验。
第十三章 基因工程菌 的发酵
第一节 工程菌的来源和应用
一、何谓基因工程
基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上， 采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿， 主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再 转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造 出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地 遗传给后代。
物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给 实验人员和向外界扩散。
实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实 验室设计和实验注意事项组成。
密封程度分为P1、P2、P3和P4级。
生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存 的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通 过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外 扩散。
2. 质粒稳定性 Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因 工程细胞数与总细胞数的比值。
3. 表达效率及质粒拷贝数控制
第三节 工程菌分批培养动力学
对于质粒脱落性不稳定，细胞在分裂时丢失质粒的 概率为p 。
dX m S (1 p)X
dt
KS S
dX m S X m S pX
dt
KS S
KS S
dX mXmXp dX (1p)mX
对于底物 dS 1 dX 1 dX dt Y dt Y dt
发酵工程第八章基因工程菌发酵
工程菌活化、筛选和保藏方法
• 2. 含质粒大肠杆菌的活化：10ml LB培养基装50ml三角瓶中，灭菌 后接菌种，150rpm,37℃振摇1216小时；
• 3．含质粒大肠杆菌的筛选：：20ml 灭 菌LB培养基装一块平板，加卡那霉素 （1mg/ml）1ml. • 划线接种（上述活化的菌种），37℃倒 置培养12-16小时；
• 4. 含质粒大肠杆菌的增殖培养： 3ml LB液体试管中加入150µl卡那霉 素，挑选单菌落接入， 250rpm,37℃剧烈振摇12-16小时， 供质粒抽提和菌种保藏用。
• 5. 取150µl的培养物入1.5ml微量 离心管中,加850µl灭菌的甘油， 密封管口，放-20℃保藏。
☆
第二节 工程菌的发酵
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
7.0
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
4．透析培养
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产 物和培养基分离，通过去除培养液中的代 谢产物来解除其对生产菌的不利影响。传 统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等 代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生 长及外源基因的表达，而透析培养解决了 上述问题。
5．固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持 质粒的稳定性。有人将固定化技术应用 到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒稳定性大大提高，便于进行连 续培养，特别是分泌型菌更为有利。因 此基因工程菌固定化培养研究已得到迅 速开展。
第2讲 基因工程菌的发酵
二、基因工程菌发酵所用设备
基因工程菌的培养设备
（1）发酵罐的组成：发酵罐体、搅拌器、温控、灭
菌系统、空气无菌过滤系统、参数测量与控制系统、以 及培养液配制及连续操作装置等。
（2）基因工程菌对发酵设备的要求：
既要防止外部微生物侵入罐内，还要不使培养 物外漏。
机械搅拌式发酵罐
气升式发酵罐
三、基因工程菌的培养工艺
铵、硝酸铵、氯化铵等。 ③其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌 株还要补加相应的营养物质。
2 接种量的影响
① 什么是接种量?——移入的种子液体积和培养液体积之 比。 ② 接种量的大小对发酵有什么影响?
答：影响发酵的产量和发酵周期， （1）接种量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达； （2）接种量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，但
会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；
3
温度的影响
在复制水平上 在转录水平上 在其他方面
通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 通过影响RNA聚合酶作用来调控基因表达 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
例如：大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄 糖阻碍，还受温度调控。
16℃和18℃培养时，菌体生长较慢，从而影响翻译，即酶的合 成。
4 溶解氧的影响
溶解氧（Dissolved oxygen,DO2）：是工程菌发酵培养过
程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和 产物生成的影响很大。
发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST (surface tension) 值下降； 发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻
基因工程菌发酵
基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。
二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。
五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。
基因工程菌的发酵
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质 粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
发酵流程
分离、提纯：
产品的 分类
代谢产物 菌体本身
如谷氨酸、酒精等。如酵母菌和细菌等。
分离、提 纯的方法
可采用蒸馏、 萃取、离子 交换等方法 进行提取。
过滤、沉淀等 方法将菌体从 培养液中分离 出来
分离提纯后的产品，还要经过质量检查合格后， 才能成为正式产品。
菌种选育：一般有诱 变育种，基因工程和 细胞工程等 培养基配制
灭菌：包括设备灭菌和培养 基灭菌
扩大培养和接种
扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢？ 发酵过程：随时了解发酵进程，及 混入杂菌。这是为什么呢？ 扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖， 时添加必需的培养基组分，严格控 在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系， 制温度、pH 、溶氧、通气量与转速 而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的 对发酵过程造成不良影响。 等发酵条件。 例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌 不同采用的培养条件就有可能不同。 的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生 例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促 菌体：用过滤、沉淀方法 产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的 分离提纯 使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。 代谢产物：用蒸馏、萃取、离子 青霉素分解掉。 而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下 交换等方法
发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程中不能
影响发酵过程的因素
（1）温度 温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度 还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收 等。 （2）pH pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影 响培养基中营养物质的分解等 （3）溶解氧 在发酵过程中菌种只能利用溶解氧。因此，必须向发 酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在 发酵液中的溶解度。 （4）泡沫 发酵过程中，通气、搅拌、微生物的代谢过程及培养基 中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。过多的持久性泡沫 对发酵是不利的。 （5）营养物质的浓度 发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮 比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产 物的积累。
基因工程菌发酵
频率； ⑵这两种菌比数率差异的大小。
对同一工程菌控制不同的比生长 数率可改变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高如增加工程菌质粒拷 贝数可提高稳定性；
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率低但对稳定性不利。
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性 有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降， 但稳定性增加。
工艺要求：外源基因既高效表达， 又有利于产品分离纯化。对发酵 影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响
⒈培养基的影响
培养基的组成既要提高工程菌的 生长速率，又要保持工程菌的稳定性， 使外源基因高效表达。常用的碳源有： 葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖 等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋 白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、 硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维 生素等。
控制菌体的生长对提高质粒的稳 定性、减少代谢副产物积累、提高外 源蛋白产率有重要意义。
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比 值是基本恒定的，因而菌体的生长 速度反映了蛋白质的合成速度。
培养条件的改变，都会改变菌 体的能量代谢和小分子前体的供应， 影响生物大分子的和成和菌体的生 长。
一、菌体的生长与能量的关系
为了提高质粒稳定性，工程菌培 养采用两阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
由于第一阶段外源基因未表达， 减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速 率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒 丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养 基组分和溶解氧浓度
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
基因工程菌发酵培养的流程
基因工程菌发酵培养的流程Genetic engineering of bacteria is a complex process that involves manipulating the genetic material of the bacteria to produce desired products. 基因工程细菌是一个复杂的过程，涉及操纵细菌的基因物质以产生所需的产品。
This process begins with the selection of a suitable bacterial strain that has the potential to produce the desired product. 这个过程始于选择合适的细菌菌株，这些菌株有潜力产生所需的产品。
Once the bacterial strain has been selected, the genetic material of the bacteria is manipulated using techniques such as gene cloning and gene editing. 一旦细菌菌株被选择出来，就会使用基因克隆和基因编辑等技术来操纵细菌的基因物质。
After the genetic material has been manipulated, the bacteria are then cultured in a suitable growth medium to allow them to proliferate and produce the desired product. 在操纵基因物质之后，细菌就会在适宜的生长培养基中培养，以便它们能够繁殖并产生所需的产品。
This fermentation process involves closely monitoring the growth of the bacteria and providing the necessary nutrients and conditions for optimal product yield. 这个发酵过程涉及密切监测细菌的生长，并提供所需的营养和条件，以获得最佳的产品收率。
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基因工程菌发酵操作流程
1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条
件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管
道、碱罐及碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接补
料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。
17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。
18.补碱时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。
20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。
21.补料时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，设置流量。
22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。
23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。
24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。
25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐
离心。
芽孢杆菌发酵操作流程
1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条
件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消
泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、碱罐及
碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接酸、
消泡剂补料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子
罐。