基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
《生物技术制药》课程笔记
《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。
它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。
1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。
此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。
（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。
这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。
（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。
基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。
二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。
1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。
（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。
（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。
（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。
三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。
它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。
1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。
（2）药物作用机制明确，针对性强。
（3）生产周期较长，生产成本较高。
（4）药物质量和安全性要求严格。
1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。
基因工程菌发酵及相关技术交流
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
高密度发酵
2.6 代谢副产物
（以大肠杆菌为例）
大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢 副产物乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 针对这个问题，可以从以下几方面予以考 虑： 发酵过程调控：指数流加；pH、DO在线监 测反馈调节；透析发酵偶联。 代谢工程调控：代谢工程以提高细胞产量、 生产效率及细胞综合生理功能，降低或避 免副产物为目的。与DNA重组技术结合有 目的地改进代谢流流向及中间代谢物。
温度的பைடு நூலகம்控
目前主要的控温策略是手动调节冷却水的 流量 针对不同的发酵过程，罐温控制方式也不 相同。大致分为两类（据发酵过程中最适 温度是否变化）：
定值控制 程序设定控制（例如：自适应PID等）
2.3 pH
发酵体系pH值是发酵液成分与细胞代谢综 合作用的结果。C源消耗而产生的有机酸， CO2的溶解，补料的流加，次级代谢产物的 积累，菌体自溶裂解等都可导致pH的变化。
（2） 定性调控方法（许多公司采用） 集成分析 模式识别 Knowledge-based systems（KBS） Expert systems（专家系统）
pH不仅是反映细胞生长代谢的指标，也是 调控高密度培养的手段
pH调节
pH的调节需要从发酵初始培养基开始，初 始pH不同，最终发酵效果可能也会有很大 差异。发酵过程中pH的调节，可分为两种： 内源性调节：过程中通过补加C、N源调节 （C源经代谢产酸使pH降低；供能不足时， N源的C骨架作为能源参与代谢，产生NH+4, 使pH升高） 调外节源。性氨调水节还：可流以加作酸为（NH源3P。O4）碱（氨水）
3. 补料策略
培养基营养成分过高会抑制细胞的生长， 采用流加补料是提高细胞浓度和外源蛋白 产量的有效方式，高密度培养通过调节限 制性底物的流加速率来调控细胞生长。 目前报道的最高生物量(Methylobacterium extorquens)已达到233 g(DCW／L)；已报 道的高密度培养大肠杆菌最高生物量为 190g(DCW／L)，非常接近大肠杆菌在液体 培养基中可能达到的理论最高生物量水平 200 g(DCW／L)。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
IGF—I工程菌的高密度发酵与工艺优化
第３ ９
Ｉ — 工程茵的高密度发酵与工艺优化 ＧＦ Ｉ
陈蔚 青 陈 虹 汤铭 玉
（ 浙江树 人大 学生物 与环境 工程 学 院 浙 江杭州 ３ ０ １ ） １０ ５
摘
要： 为研 究表 达重 组 Ｉ Ｆ Ｉ Ｇ —（ 人胰 岛素样 生 长 因子一 ）－ 菌的优 化发 酵工 艺条件 ， ＩＹ程 ． 考察 了 ３种
不 同培养 基 以及 诱 导 时机 、 导剂量 和诱 导 时间对 蛋 白表 达 的影 响 ， ５ 自控 发 酵罐 进 行分批 补 料 培 诱 用 Ｌ
养 实验 ， 定 高密度发 酵工 艺条件 。结 果表 明 ， ２ ＹＴ ０ ％葡萄糖 为发 酵培养基 ， ０８ ｍｏ ＬＰ Ｇ 确 以 ｘ ＋． ５ 经 ．ｍ ｌ ＩＴ ／
Ｌ ２ Ｙ ＋ ．％葡 萄糖 、 Ｂ、 ｘ Ｔ ０ ５ Ｍ９等 培养 基 配 方参
缩小反 应器 的体积 。细胞 高 密度培 养可通 过补 料
分批 培养 法 实现 ， 方 法 既可 满 足菌 体生 长 与产 该 物积 累所 需 营养 ， 能 使各 种 培养 基 成分 低 于 抑 又 制浓 度 ， 尤其 是 可控 制 葡 萄糖 浓度 从 而 降低 代谢 抑制 物质 乙酸 的积 累 。大 肠杆 菌 （ ． ｌ 表达 系 Ｅｃ ｉ ｏ） 统是 基 因工 程菌 产 业化 的理想 系统 ， 具有 培养 方 便、 发酵 周期 短 、 本低 廉 等优 点 ， 重组 蛋 白在 成 但 大肠杆 菌表 达系 统 中能 否获 得高产 受诸 多因 素的
诱导 ５ ， ｈ 通过控 制溶 解氧 以及 ｐ 反馈 补料 方 式 ， 酵液 最终 菌体 密度 达到 ＯＤ １ （ Ｈ 发 ２ ． 菌体 ５ ． ／ ） 目 ７ ０１ Ｌ ， ｇ 的蛋 白表 达量约 占茵体 总蛋 白的 ３ ％。 立 了该 工程 菌优化 的 高密度发 酵工 艺 ， Ｉ — 的 下游纯化 和 ０ 建 为 ＧＦ Ｉ 工 业化生 产奠定 了基础 。 关键词 ： — 工程 菌 高密度发 酵 Ｉ ＧＦ Ｉ
[1174]《生物药学》
![[1174]《生物药学》](https://img.taocdn.com/s3/m/2b1cf2063968011ca3009167.png)
西南大学网络与继续教育学院课程代码： 1174 学年学季：20192单项选择题1、基因工程菌的稳定性至少要维持在（）以上. 30. 25. 40. 202、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是（）.降低免疫源性.延长半衰期.降低相对分子量.增加组织通透性3、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源.葡萄糖.甘油.甘露醇.蔗糖4、以下可用于菌种纯化的方法有（）.诱变处理.富集培养.高温灭菌.平板划线5、第三代抗体是指：（）.利用基因工程技术制备的基因工程抗体.融合细胞产生的单克隆抗体.多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白. B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白6、获得目的基因最常用的方法是：.化学合成法.逆转录法. DNA探针技术. PCR 技术7、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细.人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定.人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用.大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活.大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化8、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：（）.表达产物为糖基化蛋白质.表达产物为天然产物.容易培养，产物提纯简单.表达产物存在的部位是在菌体内9、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的主要区别是（）.糖基化.疗效可靠.产量高.性质稳定10、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是：（）. BME. RMP1640. HT. HAT11、鼠源性单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是（）.单链抗体. Fab 片段抗体.单域抗体.最小识别单位12、目前分离的1000多种抗生素，约2/3产自（）.病毒.细菌.放线菌.真菌13、基因表达最常用的宿主菌是：（）.大肠杆菌.枯草芽孢杆菌.酵母.链霉菌14、第三代生物技术（）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围. F. 海洋生物技术.细胞工程技术.基因工程技术.蛋白质工程技术15、发酵生产中培养基的成分是( ).碳源硫源无机盐和水.碳源氮源和水.碳源氮源无机盐微量元素和水.碳源氮源碱土金属元素和水16、人类第一个基因工程药物是：（）.人胰岛素.乙型肝炎疫苗.重组链激酶.促红细胞生成素主观题17、细胞因子参考答案：由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽物质18、生物药物参考答案：利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学、生病的制品19、发酵工程制药参考答案：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的药品，或直接把微生物应20、胰岛素参考答案：是胰脏的内分泌组织。
高密度发酵
葡萄糖
1
减少酶1活性 减少丙酮酸的合成
磷酸烯醇式丙酮酸
克隆酶3基因 增加乙偶姻的合成 3
乙偶姻
2
丙酮酸
4
乙柠檬酸循环
减少酶7活性 7 减少乙酸的形成
乙酰磷酸
8
乙酸
9
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
对碳代谢流进行分流
10
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
提高供氧能力
在一般情况下，溶解氧是菌体生长的限制因子。
7
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
阻断乙酸产生的主要途径
8
改造受体菌的遗传性，减少或消除乙酸的生产
1. 磷酸转移酶 2. 丙酮酸激酶 3. 乙偶姻合成酶 4. 丙酮酸脱氢酶 5. 乳酸脱氢酶 6. 柠檬酸合成酶 7. 磷酸转乙酸基酶 8. 乙酸激酶
限制进入糖酵解途径的碳代谢流
细胞膜
磷酸烯醇 式丙酮酸
丙酮酸
葡萄糖 磷酸葡萄糖
11
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
引入血红蛋白基因
遗传改造工程菌的输氧能力，不再使贫氧成为工程菌限制因子
12
二、实现高密度发酵的方法
3. 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
13
生物技术制药 第二章 基因工程制药
第九节 高密度发酵
1
一、影响高密度发酵的因素
1. 培养基 2. 溶氧浓度 3. pH 4. 温度
2
一、影响高密度发酵的因素
5. 代谢副产物
1. 磷酸转移酶 2. 丙酮酸激酶 3. 乙偶姻合成酶 4. 丙酮酸脱氢酶 5. 乳酸脱氢酶 6. 柠檬酸合成酶 7. 磷酸转乙酸基酶 8. 乙酸激酶
生化工程--基因工程菌培养
稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构 选择适当宿主 增加外界环境压力 调节培养条件
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维 持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能 为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中 添加相应的营养组份
基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产 物的表达都是在对数期内完成的，因此， 发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌 的对数生长时间，缩短衰亡时间
高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要 生产工艺
高密度发酵
培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达 产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细 菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需 要。
基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？
微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产 物，细胞生长并非主要目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物 。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒 上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单， 低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的 生长代谢
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的
重组工程菌的培养
二、基因工程菌的培养工艺
5. 诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。
二、基因工程菌的培养工艺
6. 诱导表达程序的影响
二、基因工程菌的培养工艺
7. pH的影响
如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳 生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。
细胞生长期的最佳pH为6.8～7.4， 外源蛋白表达的最佳pH为6.0～6.5。
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
二、基因工程菌的培养工艺
第八节 基因工程菌的培养
本节讲解的三个重点内容 1. 基因工程菌的培养方式 2. 基因工程菌的培养工艺 3. 基因工程菌的培养设备
一、基因工程菌的培养方式
1. 分批培养
分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体 密度也有限。
一、基因工程菌的培养方式
2. 补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时 间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
二、基因工程菌的培养工艺
3. 温度的影响
温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成 水平上。
二、基因工程菌的培养工艺
4. 溶解氧的影响
溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产 物的生成影响很大。
维持较高水平的DO2 值（>40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋 白产物的形成。
基因工程菌培养
培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
-
诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
-
选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
-
控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
-
pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
基因工程菌生长代谢特点指南
6 诱导表达程序的影响
对于PL或PR启动子型的工程菌来说，热诱导的程序对提高外源蛋白表达量是至关重要的。 当在短时间内温度骤然升高，热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导。如果升温时间过长， 则热激蛋白合成量剧增，外源蛋白相对含量降低。
7 pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢 情况，对pH进行适当的调节。
大肠杆菌合成青霉素酰化酶受温度的影响。
影响蛋白质的活性：分泌型重组人粒细胞-具噬细胞集落刺激因子工程菌大肠杆菌300C培养， 目的产物表达量最高，低于此温度时影响细菌生长，不利于表达，温度过高370C时由于细菌的热 休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，降解目的产物。
热休克蛋白：温度骤然升高，使一些在低温根本不会表达的蛋白合成大量增加，这些蛋 白的生产，增加的数量取决于温度变化的幅度，称为热休克蛋白。
工艺要求： 外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。
对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响
⒈培养基的影响
培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、 酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。
基因工程菌生长代谢特点指南
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合 成速度。
培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合 成和菌体的生长。
一、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙
基因工程菌的发酵研究
《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.2基因工程菌的发酵研究李会成 李文辉 郭 军 刘利民(哈尔滨市医药工程技术研究开发中心 150020)摘要 本文对大肠杆菌表达的rhG M-CSF工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响,优化了影响发酵的各种条件,形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺,并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。
关键词 工程菌发酵 外源蛋白 高密度 高表达 利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产之目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染,外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。
一、材料与方法111 材料重组工程菌系本所保存,宿主菌为E.co li DH5a。
Yeast Ex tract,Po lypep tone均为OX I OD 公司产品,其它所需试剂均为国产分析纯试剂。
112 方法11211 摇床条件下培养:30℃,120rpm培养到OD600达012-018时,水浴升温到42℃,继续培养3小时,取1m l离心收集菌体,做SD S2 PA GE分析。
11212 rh G M2CSF表达量测定用常规SD S-PA GE分析,用Phar m acia公司激光扫描仪扫描分析。
SD S2PA GE方法按文献(1)方法做。
11213 发酵采用美国NB S公司的40L发酵罐,按操作说明书操作。
11214 菌体测量采用称重法和浊度法。
11215 9501批发酵不添加任何营养物,9502批,高密度发酵都采用流加工艺,补加有机营养。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的微生物工程技术，它在生物医药领域具有广泛的应用前景。
高密度发酵是重组大肠杆菌工程中的关键技术之一，它能够提高生产效率，降低成本，是生物制药工业发展的重要推动力。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，旨在全面梳理该流程的节点、原理和优化策略，为相关领域的研究人员和工程师提供参考和借鉴。
一、高密度发酵工艺流程概述高密度发酵是指通过对发酵过程中的微生物、培养基、营养物质、发酵条件等方面进行优化，使得发酵反应体系中微生物细胞数量达到较高水平的一种发酵技术。
重组大肠杆菌是一种常见的表达宿主，其高密度发酵工艺流程主要包括菌种预处理、大规模发酵、收获和纯化等环节。
1. 菌种预处理菌种的筛选和预处理对于高密度发酵的成功至关重要。
首先要选择生长迅速、表达目的蛋白质能力强的重组大肠杆菌菌株，确保其具有较高的生产潜力。
随后进行菌种的预培养和激发，通过连续传代、逐渐提高菌种浓度等手段，使菌种达到理想的生长状态，为大规模发酵做好准备。
2. 大规模发酵大规模发酵是高密度发酵的核心环节，其主要包括发酵罐设计、发酵培养基配方、发酵条件控制等内容。
在发酵罐设计方面，需要考虑罐体结构、通气方式、搅拌方式等因素，以保证发酵过程中的氧气和营养物质充分混合，为微生物生长提供良好的环境。
培养基的配方需要根据菌株特性进行调整，保证细胞生长所需的碳源、氮源、无机盐等养分充足。
发酵过程中温度、pH、溶氧量、搅拌速率等参数的控制也至关重要，可通过在线监测和智能控制系统进行实时调节，以确保发酵反应的顺利进行。
3. 收获和纯化发酵结束后，需对发酵液进行收获和纯化，以获取所需的重组蛋白质产品。
收获过程包括发酵液的分离、离心、过滤等操作，目的是将微生物细胞和培养基分离，获取含有目的产物的上清液。
随后进行一系列的纯化步骤，如固定化金属亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析等，最终得到纯度较高的重组蛋白质产品。
二、高密度发酵工艺流程优化策略为了提高重组大肠杆菌的生产效率和产品质量，研究人员和工程师们一直在不断探索和优化高密度发酵工艺流程。
大规模细胞培养及发酵技术
渗透压
• 用于对引进的培养基进行质量控制
• 关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系 • 监控连续补加营养引起渗透压的增加
细胞密度
• 细胞密度通常等于 “生物量”
– 它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比 浓度.
– 它不是指活细胞数量 (但可很好显示细胞活力）
• 细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜 的结构.
Cell Counts vs Ammonia Levels Over Time
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
C.D. 1 NH3
8 7 5 4 3 2 1 0
2 3 4 5 6 7
Cell Density (cells/ml)
• 铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢 方式. • 引起细胞抑制的铵离子浓度范围: – 从: 0.5 mM (L Mouse Cells) – 到: 40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells) (不同的细胞株对铵有不同的耐受度)
• • • • • •
乳酸 NH4+ 磷酸盐 乙醇(酵母) 甲醇(酵母) 细胞密度
微生物高密度培养
发酵培养基 表达基因的调控 宿主菌 质粒的拷贝数及稳定性
高密度培养的关键是发酵的补料控制,根据 重组菌的生长特点及产物的表达方式采 取合理的营养物质的流加方式 恒速流加 变速流加 指数流加
微生物高密度培养乙酸的形成:培养液中葡 萄糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧 的情况下,便会大量产生乙酸. 减少乙酸的策略: 限制性流加葡萄糖 甘油代替葡萄糖 降低培养温度
• 宿主菌 • 降低比生长速率 • 透析培养
细胞培养和微生物发酵中的重要 参数
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生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】
实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
1．实验目的
（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理
重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。
此外，还需要考虑通风速度和搅
拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。
另外，工程菌的生长和繁殖也会使温度和PH值发生变化，也要及时进行调整在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。
如果使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺，因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对工程菌的生长繁殖极为有利。
以上几个方面是建立工程菌发酵工艺的关键，对基因工程中的大多数工程菌来说，只要综合考虑，严格控制，都会建立起成熟稳定的高密度发酵工艺。
3．器材及试剂
（1）仪器
发酵罐、冷冻高速离心机，可见光分光光度计，恒温培养箱。
（2）试剂
①菌种和质粒宿主菌为BL21，表达质粒pET24a SA-IL-2和pET24aSA-GM-CSF由本研究所构建和常规保存。
②LB培养基（pH7.0）
蛋白胨10g/L
酵母粉5g/L
NaCl 10g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
③2Y 培养基（pH7.0）
蛋白胨 16g/L
酵母提取物 10g/L
氯化钠 4g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
④半合成培养基（pH7.0）
(NH4) 2SO4 1.8g/L
NH4Cl 0. 3g/L
蛋白胨 4g/L
酵母粉 2.25g/L
甘油 10g/L
磷酸盐适量( KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O=2∶4∶7)
微量元素 MgSO4·7H2O 0.3g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑤补料基质（pH7.0）
酵母粉5g/L
蛋白胨 10g/L
MgSO4·7H2O 0.6g/L
甘油 170g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑥Bradford蛋白浓度测定试剂盒
4．实验步骤
（1）发酵用菌种的筛选
取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37℃培养过夜，随即挑选单克隆菌种于含有5mL LB培养液的试管中，30℃培养至A600nm为0.4～0.6时，IPTG诱导表达，离心收集菌体，进行SDS-PAGE以检测表达情况。
将表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装冷冻保存，每批发酵取出一管,以保证菌种的稳定性。
（2）工程菌的培养
①种子的活化：取冷冻保存的工程菌株划板，37℃培养约16h，挑单克隆接种于含3ml LB 培养基的试管中，37℃、200r/min培养10h左右，然后按试管培养基量的2%转种1次，在相同条件下培养4h即成为活化种子。
②工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以2%接种量接种于含200ml 2YT培养基的500ml 摇瓶中，37℃、250r/min旋摇培养，当OD600值为1～2时可以作为5L发酵罐的菌种。
③5L高密度发酵培养：发酵罐中的起始工作体积为2.5L，在罐中接入200ml三角摇瓶培养的种子(接种量为4%)。
装料前校正pH和溶氧电极，发酵温度37℃，起始转速250rpm。
发酵过程的几个关键参数为：
A.溶氧量及转速：空气流速设定为每分钟1个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧量参数相关联，每30s提高或降低10r/min，溶解氧量控制在35%左右，最大转速达800r/min时通入纯氧；
B.pH值：自动流加30%的氨水，使pH值保持在7.0左右；
C.补料的流加：根据实际经验，用甘油代替葡萄糖作为碳源。
补料的流加分两个阶段进行在5h的分批培养后，5～9h补加含5g甘油的补料；9～13h加入含100g甘油的补料。
以上数据由微机自动收集和记录。
整个发酵过程中,通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。
（3）菌体浓度、目的蛋白表达量、菌体总蛋白的测定
①菌体浓度的分光光度测定波长为600nm；
②使用灰度扫描仪测定电泳条带中目的蛋白含量
③Bradford法测定菌体总蛋白
要点提示：
（1）发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组大肠杆菌既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。
要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。
（2）发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；所以，应该根据基因重组菌的需求，将限制性底物(通常为碳源)不断流加到反应器中，可避免高浓度底物的抑制作用。
限制性底物的流加速率决定了细胞的比生长速率，从而影响重组菌的稳定性及外源基因的表达。
维持补料分批发酵中重组菌恒定的比生长速率，应采用指数流加的方式，也可采用阶梯式提高流加速率的方法。
（3）高密度发酵中为了减少补料的稀释作用，通常采用高浓度补料液。
这些浓液加入发酵液后，须立即混匀，否则细胞与局部的高浓度补料接触会造成代谢的失控。