第11章 基因工程菌发酵——【发酵工程 精】
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
菌要求安全， 列入FDA表中。 常用的宿主系统有：大肠杆菌
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如产品翻译后不需修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。 优点： 生理学和遗传学背景了解得深入，有利于进行复杂的基 因操作。 有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）； 能生长在简单的便宜的培养基上。
三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 部分可高产 对原核好 融合蛋白
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
不大
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
二、基因工程菌发酵的特点
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大 量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长 得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导 致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
1、分离丢失
基因工程菌生产的产品主要有二类：
蛋白质
非蛋白质
基因工程菌发酵水平取决于：
菌种遗传特性
发酵工艺及控制
发酵罐的性能与操作
——掌握工程菌的发酵特性、过程控 制和优化及放大特点，才能保证工程菌顺利实现 产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
一、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统。 要求：翻译后的修饰要简单；如果用于食品要考虑宿主
白信号肽序列的下游。
2、G+ 细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion） 到胞外。不能使蛋白质糖基化 缺陷:
枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯 草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差
其他G+ 细菌: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，可
将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力， 可做理想的受体菌。
到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，
要用动物细胞组织培养来达到。
丝状真菌： 很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切
和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌 （如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。
影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒 （有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的 机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子 细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现 质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细 胞分裂中一个）。
酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转 译后处理（修饰）与在整个动物中相同，在某种情况下可能转 译后修饰有些不同，但它可提供最接近于天然副本的产物，此 外多数产物可以分泌到胞外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较 低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓 鼠卵巢细胞）。
（一）外源基因的多样性
基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能 整合到染色体上，这些基因可能不稳定。 丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这 样就会大大降低产物的表达。 为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压 力，如抗生素。
Hale Waihona Puke （二）培养过程分两个阶段基因工程菌的培养一般分两段。 前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，现在发展了其他的酵
母如甲醇营养型酵母等。 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。不产 内毒素 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌
第十一章 基因工程菌发酵
主要内容
第一节 概述 第二节 基因工程菌的稳定性 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 基因工程菌发酵过程的工艺控制 第五节 重组大肠杆菌的培养策略 第六节 甲醇营养型酵母的生长与表达 第七节 培养装置与产物的提取
第一节 概 述
近年来，重组DNA技术已由实验室研究走向生产应用。 它不仅提供了一种有效的菌种改良技术，也为攻克医学 上的疑难杂症 (癌、遗传病及艾滋病等) 的治愈提供了可能； 为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提 供了有力的手段。 由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长 激素、乙肝表面抗原等已先后面市。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细 胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个 细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。
真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端
是原核序列，羧基端是真核序列。 优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高
效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破
坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
分泌(secretion)的蛋白通常在胞内，当这些蛋白达到高浓 度时，会被水解或形成不溶的包含体；包含体蛋白是不折叠的， 必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白会触发热冲击响应；增加蛋白水解酶的活 性；使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质N端 常多一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如产品翻译后不需修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。 优点： 生理学和遗传学背景了解得深入，有利于进行复杂的基 因操作。 有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）； 能生长在简单的便宜的培养基上。
三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 部分可高产 对原核好 融合蛋白
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
不大
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
二、基因工程菌发酵的特点
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大 量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长 得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导 致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
1、分离丢失
基因工程菌生产的产品主要有二类：
蛋白质
非蛋白质
基因工程菌发酵水平取决于：
菌种遗传特性
发酵工艺及控制
发酵罐的性能与操作
——掌握工程菌的发酵特性、过程控 制和优化及放大特点，才能保证工程菌顺利实现 产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
一、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统。 要求：翻译后的修饰要简单；如果用于食品要考虑宿主
白信号肽序列的下游。
2、G+ 细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion） 到胞外。不能使蛋白质糖基化 缺陷:
枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯 草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差
其他G+ 细菌: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，可
将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力， 可做理想的受体菌。
到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，
要用动物细胞组织培养来达到。
丝状真菌： 很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切
和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌 （如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。
影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒 （有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的 机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子 细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现 质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细 胞分裂中一个）。
酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转 译后处理（修饰）与在整个动物中相同，在某种情况下可能转 译后修饰有些不同，但它可提供最接近于天然副本的产物，此 外多数产物可以分泌到胞外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较 低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓 鼠卵巢细胞）。
（一）外源基因的多样性
基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能 整合到染色体上，这些基因可能不稳定。 丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这 样就会大大降低产物的表达。 为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压 力，如抗生素。
Hale Waihona Puke （二）培养过程分两个阶段基因工程菌的培养一般分两段。 前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，现在发展了其他的酵
母如甲醇营养型酵母等。 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。不产 内毒素 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌
第十一章 基因工程菌发酵
主要内容
第一节 概述 第二节 基因工程菌的稳定性 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 基因工程菌发酵过程的工艺控制 第五节 重组大肠杆菌的培养策略 第六节 甲醇营养型酵母的生长与表达 第七节 培养装置与产物的提取
第一节 概 述
近年来，重组DNA技术已由实验室研究走向生产应用。 它不仅提供了一种有效的菌种改良技术，也为攻克医学 上的疑难杂症 (癌、遗传病及艾滋病等) 的治愈提供了可能； 为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提 供了有力的手段。 由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长 激素、乙肝表面抗原等已先后面市。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细 胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个 细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。
真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端
是原核序列，羧基端是真核序列。 优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高
效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破
坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
分泌(secretion)的蛋白通常在胞内，当这些蛋白达到高浓 度时，会被水解或形成不溶的包含体；包含体蛋白是不折叠的， 必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白会触发热冲击响应；增加蛋白水解酶的活 性；使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质N端 常多一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。