基因工程菌发酵
提高发酵产酶量的措施
提高发酵产酶量的措施一、优化培养条件1.1温度：在一定的温度范围内，大部分酶的活性随着温度的升高而增强。
因此，可以通过调整培养温度来提高发酵产酶量。
1.2 pH值：酶的活性受pH值影响较大，只有在适宜的pH值条件下，酶的活性才能得到充分发挥。
因此，可以通过调节培养液的pH值来提高发酵产酶量。
1.3溶氧浓度：对于好氧菌，发酵过程中的溶氧浓度对产酶量有显著影响。
可以通过调整搅拌速度和通气量来控制溶氧浓度，从而提高发酵产酶量。
二、基因工程2.1构建高产酶的基因工程菌：通过基因工程技术将目的基因导入到菌种中，构建高产酶的基因工程菌，从而提高发酵产酶量。
2.2基因表达调控：通过基因表达调控手段，如诱导表达、补料表达等，来提高目的基因的表达水平，从而增加发酵产酶量。
三、添加诱导物添加适当的诱导物可以促进酶的合成，从而提高发酵产酶量。
诱导物可以是天然的，也可以是人工合成的。
选择合适的诱导物并根据实验条件优化其浓度是提高发酵产酶量的有效手段。
四、细胞固定化通过固定化技术将菌体固定在载体上，可以提高菌体的生长速度和存活率，同时延长菌体的寿命并提高产酶量。
选择合适的固定化载体和工艺参数是实现这一目标的关键。
五、补糖与补料5.1补糖：通过适时补充葡萄糖等营养物质，可以促进菌体的生长和代谢，从而提高发酵产酶量。
同时，控制补糖速率和浓度可以有效避免对菌体生长和产酶的抑制作用。
5.2补料：适当的补料可以延长发酵周期，提高产物浓度。
选择合适的补料种类和添加时机是关键。
六、降低产物抑制6.1控制产物浓度：产物浓度过高可能会对菌体的生长和产酶产生抑制作用。
因此，在发酵过程中应控制产物浓度在适宜范围内，避免其对发酵过程的影响。
6.2添加抗抑物：某些物质如丙酮酸、硫酸铵等可以减轻或消除产物对菌体生长和产酶的抑制作用。
在发酵过程中适时添加这些物质可以提高发酵产酶量。
七、提高搅拌速率提高搅拌速率可以增加溶氧浓度，促进菌体生长和代谢。
但同时也会增加能源消耗和剪切力对菌体的损伤。
植酸酶基因工程菌的发酵研究
关键词 ： 酸酶 ； 酵 ； 植 发 植酸 酶基 因工 程菌
植 酸 酶 （ ｈ ｔ ｅ） 一 种 新 型 食 品 与 饲 料 添 加 剂 ， 能 １ ｏ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。 ｐ Ｙ ｓ 是 ａ 它 ｍ Ｌ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ．
催 化 植酸 （ ） 盐 水解 为肌 醇 及无 机磷 酸 ， 进微 量 元素 及 蛋 促
从 ０ ０ ５ ｏ ／ 的植 酸钠 溶 液 中释 放 １ ｍ Ｌ 机 磷 所 需 的酶 ． ０ １ｍ Ｌ Ｌ ｎ ｏ 无
Ｙ Ｄ种子液 ： ％ 母提取物 ； ％蛋 白胨 ； ％葡萄糖 。 Ｐ １酵 ２ ２
增 殖 培养 基 ： 母 提 取 物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨 ２ ｇ Ｌ 酵 母 量 为 一 个 酶 活 单 位 。 酵 ０ ／， ０ ／， 氮 源 （Ｎ ） ３ ４ ｇ Ｌ 生 物 素 ０ ４ ｇ Ｌ 甘 油 ｌ Ｌ Ｌ ０ １ １４ 植酸酶基 因工程菌摇瓶发酵产酶条件 的研究 Ｙ Ｂ １． ／ ， ． ｍ ／ ， ０ ｍ ／ ， ． ．
ｍ ０ ０ ７ ｍ ｌ Ｌ Ｌ ． ０ ６ ｏ ／ 植酸 钠溶 液 ）在 分 光 光 度 计 上 测 Ｏ ４ ５ ｍ ， Ｄ １ｎ
１
材 料 与 方 法
植 酸 酶 基 因工 程 菌 Ｅ ２ ， 本 实 验 室 构 建 。 一 ２为
１ １ 供试菌株 ．
１２ 培养基及试剂配制 ．
琼 脂 。
ｍ ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ． ｏｌ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。
种子活化与种子液的制备 ： 将实验室保存的植酸酶基因工
诱导培养基 ： 酵母提取物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨２ ｇ Ｌ 酵母 程 菌Ｅ ２ 划线于Ｙ Ｄ ０ ／， ０ ／， 一２ Ｐ 培养基平板上 ，８ ℃～３ ℃温箱 中培养 ， ２ ０
基因工程菌发酵培养的流程
基因工程菌发酵培养的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
工程菌的知识
工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。
研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。
这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。
要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。
这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
基因工程菌发酵及相关技术交流
基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。
比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。
经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。
这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。
2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。
3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。
4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
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9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化
基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化α-淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，被广泛应用于食品、制浆造纸、医药等领域。
由于生产条件的限制，传统的α-淀粉酶生产工艺存在很大的局限性，因此需要探索新的生产技术和生产菌株。
方法：
本实验选用经过基因工程改造的高温耐受性菌株，利用筛选得到的最优菌株进行发酵生产α-淀粉酶。
通过单因素实验和正交实验优化发酵条件，包括发酵时间、发酵温度、pH值、转速等指标，寻找最佳发酵条件。
结果：
确定最佳生产菌株后，发酵条件的单因素实验结果表明，最佳发酵时间为72小时，发酵温度为60℃，pH值为7.0，转速为180转/分。
进一步经过正交实验优化，确定了最佳的发酵条件为：发酵时间72小时，发酵温度60℃，pH值7.0，转速180转/分。
结论：
通过基因工程改造的耐高温菌株生产α-淀粉酶的发酵条件已经成功优化，这为更高效、环境友好的α-淀粉酶生产提供了技术支持和理论基础，同时也为高效生产其他工业酶类开辟了新的途径。
大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验
图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
4/8
2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株，广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。
本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤：1. 选择宿主菌株：根据所需的功能和目标，选择合适的菌株作为宿主，常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。
2. 提取目标基因：从源菌株中提取所需的目标基因，可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。
3. 载体构建：将目标基因片段与合适的载体进行连接，构建重组载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4. 转化：将重组载体导入宿主菌株中，使目标基因能够稳定表达。
5. 筛选和鉴定：经过转化的菌株进行筛选和鉴定，常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。
6. 培养和扩大：经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大，得到足够的菌体。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。
下面以生物工程领域为例，介绍基因工程菌的应用与流程。
1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因，并通过PCR扩增获取目标基因片段。
然后将目标基因片段与适当的载体连接，构建重组载体。
接下来，将重组载体导入宿主菌株中，经过筛选和鉴定，获得含有目标基因的基因工程菌株。
最后，通过培养和表达优化等步骤，使目标基因在基因工程菌中稳定表达，并获得足够的目标蛋白产物。
2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。
通过基因工程技术，可以改造菌株的代谢途径，使其具有特定的代谢功能。
例如，通过引入外源基因，可以使菌株具备合成特定化合物的能力，如生物染料、药物等。
通过调控代谢途径中的关键基因表达水平，还可以实现代谢产物的高效合成。
3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。
通过基因工程技术，可以改变蛋白质的结构和功能，实现蛋白质的改良和优化。
基因工程菌的发酵
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质 粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌的构建及其发酵条件优化
关 健词 ：靛蓝色素 ；苯 乙烯单加氧酶 ；工程菌 ；发酵条件 ；响应面试验
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｇｅ ｎ ｅ ｉ ｔ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ Ｅｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｅ ｄ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ Ｏｐ ｉ ｔ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｉ ｔ ｓ Ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃｏ ｎ ｄ ｉ ｉ ｔ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｈｉ ｇ ｈ — Ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｄ ｉ ｇ ｏ
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微生物基因工程菌
具有高效性、可操作性和可预测 性，能够实现快速、准确地对微 生物进行定向改造。
微生物基因工程菌的应用领域
01
02
03
生物医药领域
生产重组蛋白药物、抗体 药物、疫苗等，提高药物 质量和产量。
工业领域
生产高值化学品、生物燃 料、生物塑料等，提高生 产效率和降低成本。
环境治理领域
修复污染环境、降解有机 污染物等，改善环境质量 。
微生物基因工程菌
汇报人： 202X-12-21
目 录
• 微生物基因工程菌概述 • 微生物基因工程菌的构建与优化 • 微生物基因工程菌的发酵工艺研究 • 微生物基因工程菌的应用研究 • 微生物基因工程菌的未来发展趋势与挑战
01
微生物基因工程菌概述
定义与特点
定义
微生物基因工程菌是指通过基因 工程技术对微生物进行改造和优 化，以获得具有特定性状的工程 菌。
通过选择合适的培养基、控制 培养条件、优化基因型等方法 提高基因工程菌的稳定性和可
重复性。
03
微生物基因工程菌的发 酵工艺研究
发酵工艺流程及影响因素
菌种选育
选择适合表达目标产物 的菌种，进行遗传改良
和筛选。
种子制备
通过培养基优化、接种 量、接种时间等因素，
制备活力强的种子。
发酵培养基
选择适合菌种生长和目 标产物表达的培养基， 包括碳源、氮源、无机
在农业领域的应用
1 2
生物肥料研发
通过基因工程技术改造微生物，生产具有固氮、 解磷、解钾等功能的生物肥料，提高土壤肥力和 农作物产量。
植物生长调节剂研发
利用微生物基因工程菌生产植物生长调节剂，促 进植物生长和发育，提高农作物产量和品质。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
讨论
• 含PL启动子的 启动子的E.coli工程菌的表达及温度敏感株 启动子的 工程菌的表达及温度敏感株 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（ ℃ 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（30℃） 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度， 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度，然后迅 速提高温度诱导目的产物的表达。 速提高温度诱导目的产物的表达。 • 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素：一是 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素： 在30℃发酵过程中尽可能提高菌体密度；二是快 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度； 速升温诱导。 速升温诱导。
• 科学家们把人的胰岛素基 因送到大肠杆菌的细胞里， 因送到大肠杆菌的细胞里， 让胰岛素基因和大肠杆菌 的遗传物质相结合。 的遗传物质相结合。人的 胰岛素基因在大肠杆菌的 细胞里指挥着大肠杆菌生 产出了人的胰岛素。 产出了人的胰岛素。并随 着它的繁殖， 着它的繁殖，胰岛素基因 也一代代的传了下去， 也一代代的传了下去，后 代的大肠杆菌也能生产胰 岛素了。 岛素了。这种带上了人工 给予的新的遗传性状的细 被称为基因工程菌。 菌，被称为基因工程菌。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（ 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、 （ ， ）干扰素、链激酶、 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、 型肝炎检测试 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程产业化除上游构建工程菌之外， 基因工程产业化除上游构建工程菌之外，下 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破 目的产物的分离、纯化、 碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天 然结构使之具有生物活性， 然结构使之具有生物活性，有的表达产物还需进 一步加工修饰， 一步加工修饰，如人胰岛素原的化学切断与酶切 降钙素C-末端的酰胺化修饰 末端的酰胺化修饰， 断，降钙素 末端的酰胺化修饰，以及质量控制 等，没有这些下游技术的建立就没有基因工程产 品。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
工程菌
发酵时，随DO浓度的下降，细 胞生长减慢。 外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。 维持较高的DO值，才能提高工 程菌的生长，利于外源蛋白产物的 形成。
采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提高 活菌产量。
⒌ 热诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱 导表达。 要求在2min内让罐升温达到42 。 升温时间太长，会降低外源蛋白表达量， 也给提取纯化增加困难。
微生物发酵目的是为了获得初级或次 级代谢产物，细胞生长并非主要目标 应用发酵罐大规模培养基因工程菌是 为了获得最大量的基因表达产物。
发酵罐的组成有：
发酵罐体
保证高传质作用的搅拌器 精细的温度控制和灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制和连续操作系统。
发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
表达产物不稳定：
人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的
延长，干扰素活性反而下降。
影响工程菌稳定性的因素： （1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上
有重复序列等。
（2）宿主 ：宿主中重组基因的完整性、重组时有关
基因的变异等。
（3）环境因素 ：高温、去垢剂、某些药物(如利福
平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的 丢失。
b 抗生素依赖变异法
诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组 质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向
培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。
c 、营养缺陷型法
诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重
《基因工程菌发酵》课件
通过将目标基因插入宿主菌株的染色体，实现对目标基因的表达和调控。
2
发酵过程
利用菌株进行发酵过程，通过代谢产物合成目标化合物。
3
纯化和提取
通过有效的纯化和提取技术，获取目标化合物的高纯度。
基因工程菌发酵的优势
1 高效
菌体能够高效合成目标化合物，提高生产效率。
2 可控
通过基因调控和发酵条件优化，可以精确控制产品成分和质量。
总结和展望
基因工程菌发酵是一项具有广泛应用和巨大潜力的技术，将在医药、工业、 环境和农业等领域继续发展和创新。
《基因工程菌发酵》PPT课件
通过深入浅出的解释和精美的图片，本课件将详细介绍基因工程菌发酵的背 景、原理、应用领域以及发展前景。
背景介绍
基因工程菌发酵是一种重要的生物工艺技术，利用基因工程手段改造菌株， 通过发酵生产目标物质。
基因工程菌发酵的定义
基因工程菌发酵是指利用重组DNA技术构建具有特定基因组的菌株，并通过 菌体生物代谢过程来合成目标化合物的过程。
3 环保
利用菌株的生物降解能力，减少废弃物产生和环境污染。
基因工程菌发酵的发展前景
创新性
基因工程菌发酵将会不断结合新 技术和新领域，推动科技创新。
研究和发展
越来越多的研究机构和企业投入 基因工程菌发酵领域的研究和开 发。
生物技术发展
基因工程菌发酵是生物技术发展 的重要方向之一，有着广阔的应 用前景。
基因工程菌发酵的应用领域
制药业
利用基因工程菌发酵生产药物，提高药物生产 效率和纯度。
环境治理
利用基因工程菌发酵进行废水处理和有机废弃 物降解。
工领域
利用基因工程菌发酵生产化工原料和生化产品， 替代传统化工合成过程。
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（二）工程菌发酵工艺
基因工程菌的发酵与传统的微生物发
酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的
是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主
载体和克隆基因之间的相互关系还和环境
有关。
1、工程ห้องสมุดไป่ตู้培养的特点
工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模 为低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组 DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细 胞外分泌。 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或 维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生 某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培 养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生 长的代谢物，以保证细胞正常生长。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
第八章 发酵工程在现代生物技 术中的应用
第一节 基因工程菌发酵
第一节 基因工程菌发酵
一、基因工程基本知识
基因工程(genetic engineering)的定义
基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种 或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来．或者人工 合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外 加工重组，转移到另一种生物体(受体)的细胞内，使之能 在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。又称重组 DNA技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
衔接物连接法
cDNA链的合成
通过DNA聚合酶合成第二链
加入Sal I衔接物 S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I
双衔接物连接 法的基本程序
优点：可以实现定向克隆，防止发生 自连，同时对克隆片断的再删除也比 较方便。
在用DNA衔接物连接法时，如果待克
常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法
和接头连接法
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP和dTTP 末端转移酶
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
同聚物加尾法或T4连接酶的平末 端连接法，无法用原来的限制酶作 特异性的切割，获得插入片断进行 进一步的研究。
衔接物连接法
环状
环状 环状
35- 45kb
≈300 kb
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列 PCYPAC1
100 - 2000 kb 100 - 2000 kb 〉 1000 kb
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
基因有影响。
无机磷在许多代谢反应中是一个效应因
子，磷浓度不同，影响菌体生长。
（2）接种量的影响
接种量是指移入的种子液体积和培养液体 积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。
接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基 因表达。
接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入 对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会 抑制后期菌体的生长。
2、工艺要求
外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯
化。对发酵影响较大的几个因素有：
（1）培养基的影响
（2）接种量的影响
（3）温度的影响 （4）溶解氧的影响 （5）诱导时机的影响 （6）pH的影响
（1）培养基的影响
• 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要
保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 • 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、 果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、 酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵
鉴 定
（一）载体
• 载体（vector）是由在细胞中能够自主复 制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通 过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在 它的上面，而进行复制。
作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：
1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效 的复制。 2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一 种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 3、有适合的标记（抗药性基因），易于选择。
– 抗生素添加法 – 抗生素依赖变异法 – 营养缺陷型法
控制基因过量表达 控制培养条件（温度、pH、DO）
为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两
阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度；
⑵再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小 了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别， 增加了质粒稳定性。
衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20 个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切 酶的酶切位点的回文结构。如：
BamH I 或Sau3A Hpa IICCGGATCCGG Hpa II
GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切 位点。
对同一工程菌控制不同的比生长数率可改 变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频 率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定 性；
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频 率低但对稳定性不利。
3、质粒稳定性的分析方法
样品
不含抗性标记抗生素 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素
平 板 培 养基
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
（6）pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有 影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对 pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程 菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培养 后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH 为6.0～6.5。
总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最 大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最 低失败率等。
其他条件：
分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8* 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列
等。还有无机盐、维生素等。
不同的碳源对菌体的生长和外源基因表 达有较大的影响。 使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼 吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较 大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。
葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对 lac启动子有利。
在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的
合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的
线性染色体
线性染色体 环状 环状
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
（二）载体DNA与外源基因片段的连接
1 、 黏 性 末 端 分 子 之 间 的 连 接 DNA
2、平末端DNA片断的连接
（1） T4DNA连接酶
（2） 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同
聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。
隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔
接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物
产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因
切断。
DNA接头（adapter）连接法： 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系 的教授吴瑞 博士发明的。 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶 粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核 苷酸短片断。 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔 接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末 端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴 露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
（5）诱导时机的影响
对于λ PL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感 型突变株（clts857），在28～30℃下培养时，该突变体 能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升 高42℃时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目 的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升 温诱导表达。 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个 为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养 和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。