噬菌体效价的测定

二、病毒粒子的构造（模型）
噬 菌 体 的 形 态 及 分 类 科 属
大 肠 杆 菌 噬 菌 体 结 构 示 意 图
T4
大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 及电镜照片
头部 领环 螺旋形尾鞘 核心或管 （中空） 尾丝 六角形基板 尾刺或刺突
噬菌斑示意照片
噬菌斑
宿主细 菌菌苔
大 肠 杆 菌 噬 菌 斑 的 表 型 形 态
实 验 九 噬菌体效价的测定
来自百度文库
目的要求
1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法
2、观察噬菌斑的形态
实 验 内 容 一 培养基和实验物品的准备
本次实验准备工作（2人/组）
1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）；
（已准备好）。
2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 2支/组，分装于18×180mm试管； 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用， 150ml/组，装于250ml三角瓶，
三、实验原理
一个噬菌体→侵染细胞→引起裂解→扩 散重复裂解→形成一个噬菌斑（琼脂凝 胶中） 宿主细胞数远远大于噬菌体数？ 噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数×10×稀释倍数
四、实验步骤
1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培 养基平板9个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板 上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液 0.9mL。
实 验 内 容 三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
斑点试验法 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） 双层平板法——最常用，优点较多 单层平板法 载玻片法——快速 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、 电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补； ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象； ③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
3、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用） 但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。
六、噬菌体的危害
在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。 表现形式：①发酵周期明显延长；②碳源消 耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量， 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。
实验步骤框图（教师进行演示操作）
用牛肉膏蛋白胨固 体培养基倒平板9 皿（薄一点） 敏感菌菌悬液 0.9mL
噬菌体稀释液（10-5、10-6、10-7） 0.1mL
放入已有底层固体培养基的 平板中
混匀放置5分钟
将5mL溶化的半固体培养基中倒入 上述平板中（45~50℃）
混匀（动作？）
37℃培养5小时或 室温培养12小时
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
2、什么因素决定噬菌斑的大小？
3、如果在你的测定平板上，偶尔出现 其他细菌的菌落，是否影响你的噬 菌体效价测定？ 4、噬菌体效价测定实验中所用操作方 法和书上介绍的操作方法比较有什 么优缺点？
下周实验内容 微生物（细菌）的常见生理生化反应
要点： 1、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。 3、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微 生物的方法。 4、了解IMViC（吲哚、甲基红、伏-普、柠檬酸）与硫化 氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。
观察结果计数
教科书介绍方法的操作步骤
噬菌体稀释液 0.1ml 大肠杆菌培养液 0.9ml
混匀吸附5min
45~48℃溶化好牛肉膏 蛋白胨半固体培养基 4ml
搓动混匀后倒于 有底层的平板中
铺平
37 ℃培养5~6 小时，观察计数
思考题
1、记录结果，并进行统计分析。
10-5 噬菌体稀释度 pfu数/平板 每毫升中的pfu数 10-6 10-7
2、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。 3、噬菌体效价： 指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成 单位（pfu，plaque-forming unit）。 效价（titre，titer）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）。
五、噬菌体的应用
1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。 2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单得多，且易获得大量的突变体—— 构建基因文库（λ噬菌体）；基因工程载 体；噬菌体展示技术。
5、加入上层培养基
将5mL溶化的半固体培养基中迅速 倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板 中（45~50℃），并混合均匀。静止 凝固。 6、培养
37℃培养2.5小时或室温培养12小时。
7、观察、计数
观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度 的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格 内。
8、计算噬菌体的效价 选取30~300个pfu数的平板计算每 毫升未稀释的原液的噬菌体效价。 噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数×10× 稀释倍数
（用于制备9个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，10 支/组；（上周已准备好）。 5、1ml无菌吸管 4支/组。
实 验 内 容 二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等 微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
T
三、噬菌体的分类 ——根据噬菌体与宿主菌的相互关系
烈性噬菌体（virulent phage）
能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。
温和噬菌体（temperate phage）
噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。
3、稀释噬菌体 取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。 4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板 （ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
七、以防为主的措施：
1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生； 3、决不排放或随便丢弃活菌液； 4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常 进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在 30～40米高空； 5、加强管道及发酵罐的灭菌； 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7、严格执行会客制度。
针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、 溶源菌
四、噬菌体繁殖（生活周期）
1、吸附 2、侵入 3、增殖（生物合成） 4、成熟装配 5、裂解释放
T4噬菌体吸附和DNA的注入
偶 数 的噬 扫菌 描体 电感 镜染 照大 片肠 杆 菌
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T4 噬 菌 体 的 生 活 周 期
T4 噬 菌 体 的 装 配