噬菌体效价的测定
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体效价的测定
实验器材
• 菌种
大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体裂解液原液
• 培养基
LB培养基，素琼脂
• 试剂仪器
Eppendorf管，移液器，水浴锅 振荡器，煤气灯等
实验步骤
• 稀释噬菌体原液 取0.1ml噬菌体原 液于0.9mlLB液体 培养基，得到10-1噬 菌体稀释液。依此类 推，稀释到10-7。
• 噬菌体与菌液混合: 取0.5ml大肠杆菌液 至50℃保温素琼脂培 养基中， 另取0.5ml 噬菌体稀释液混合。 做10-5，10-6，10-7 梯度。 。
• 手搓快速混合。
• 将已接种的上层培养基倒入底层培养基上 • 静置凝固后37℃培养24小时 • 观察噬菌斑并计数
实验结果
• 记录平板中每稀释浓度的PFU数于下表中： • 计算噬菌体效价
噬菌体稀释度 PFU数 10-2 10-3 10-4 10-5 对照
思考题
• 什么因素决定噬菌斑的大小？ • 测定噬菌体的效价，操作时要注意什么才能测定 准确？ • 计算噬菌体效价时，选择30～300个PFU的平板 计数较好，为什么？ • 在测定平板上出现其它细菌的菌落是否影响你的 效价测定？
实验 7 噬菌体效价的测定
实验目的
• 学习噬菌体效价测定的基本方法
实验原理
• 噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。 • 效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特 异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能进行噬菌体的计数。 • 噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低， 因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达 病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Formin
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定
1 目的
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规 微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出 大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速 检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体 数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需 12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养） 液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养） 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1 菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2 培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体的检查及效价测定
5.3 噬菌体与菌液混合：
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀， 置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.4 接种上层平板：
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数：
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于 计算公式：N=Y/V%26#8226;X
1、目的：
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板Байду номын сангаас测定噬菌体效价的操作技能。
双层平板法测定噬菌体效价的原理
双层平板法测定噬菌体效价的原理一、引言噬菌体是一种专门寄生于细菌体内的病毒，可以通过感染和杀死宿主细菌来控制细菌数量。
测定噬菌体效价是评估噬菌体活性和浓度的重要方法之一。
双层平板法是常用的测定噬菌体效价的方法之一，本文将详细介绍双层平板法测定噬菌体效价的原理。
二、仪器与试剂1. 噬菌体悬液：含有足够数量的噬菌体，用于感染宿主细胞。
2. 宿主细胞：适合噬菌体生长和复制的细胞。
3. 导管或微量移液器：用于移液。
4. 烧杯或容量瓶：用于配制琼脂。
5. 琼脂：用于制备双层平板。
6. 加热设备：用于消毒琼脂和灭活宿主细胞。
三、实验步骤1. 制备下层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
2. 制备上层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基和宿主细胞悬液，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
3. 取下层琼脂约1-2mL放入试管中，倒置试管使琼脂均匀附着于试管壁。
4. 等待下层琼脂凝固。
5. 将上层琼脂与宿主细胞悬液混合均匀后取出适量液体（通常为0.1-0.2mL），加入噬菌体悬液中并混合均匀。
6. 取出一定数量的上述混合液滴到已经凝固的下层琼脂表面上，并轻轻晃动试管使混合液均匀分布于下层琼脂表面上。
7. 等待双层平板凝固并在恰当的条件下培养宿主细胞和噬菌体。
通常在37℃、5%CO2、湿度100%的条件下培养16-20小时。
8. 观察双层平板上的细胞和噬菌体生长情况，记录噬菌体效价。
四、原理1. 下层琼脂：下层琼脂是一种固态培养基，用于支撑和定位上层琼脂。
下层琼脂通常不含任何添加物，以便于观察宿主细胞和噬菌体的生长情况。
2. 上层琼脂：上层琼脂是一种含有宿主细胞悬液的固态培养基，用于感染噬菌体并观察其效应。
在上层琼脂中加入宿主细胞悬液可以提供足够数量的宿主细胞，并为噬菌体复制提供必要的条件。
3. 噬菌体悬液：噬菌体悬液中含有足够数量的噬菌体，可以感染并杀死宿主细胞。
实验十二 噬菌体效价的测定
4、将E. coli过夜菌摇匀，用吸管取菌液0.9ml分别加 入上面的10-4,10-5,10-6,10-7和对照试管中，摇匀；
5、将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5,106,10-7和对照，分别将4管混合液和对照管加入对应 的上层培养基试管中，每加入一管就要立即摇匀；
6、将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 放在台面上摇匀，使上层培养基布满平板，待平 板凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml 10-3 0.1ml
0.5ml 10-4
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A
稀释噬菌体 试管中装4.5ml水
0.1ml
0.1ml
灭菌后待用
B 空EP管中加入： 大肠杆菌0.9ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
噬菌体0.1ml 对照中换成0.1ml水 C 将全部混合液 （1ml）加入上层 培养基内
10-4
10-5
10-6
7
对照
D
倒板，37℃培养
E 观察并记数噬菌斑
噬菌体效价测定流程图
五 实验结果
1、观测平板中的噬菌斑,将每一个噬菌斑形成单位 (pfu),记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板 记数每ml未稀释的原液的噬菌体的效价. 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数
2、实验数据
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌噬菌体原液，大肠杆菌；
2、培养基：上层培养基（5管/组），LB平板（5个/ 组）；
3、4.5mL无菌水（7管/组）；
4、EP管（5管/组）。
四、实验步骤
1、过夜培养物出现澄清，用无菌滤头过滤纯化获得噬 菌体滤液；
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
实验七 噬菌体效价的测定
实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定杨明轩生物1111102040128一、实验目的1、自学并掌控噬菌体效价的含义及其测量原理。
2、自学并掌控双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属细菌病毒，侵染细菌细胞后，可以引致宿主细胞熔化丧生，并在琼脂培养基表面构成空斑，即为噬菌斑。
人们可以根据噬菌斑去推论噬菌体的存有。
噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。
该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。
只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
公式为：噬菌斑构成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×吸收倍数×10（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验挑选的就是λ噬菌体ea94，它就是一种被改建过的烈性噬菌体。
三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（escherichiacoli）le392；2、噬菌体：λ噬菌体ea94；3、培养基：300ml三角瓶中分装100mllb培养基，15×150mm试管分装4ml0.7%琼脂糖；4、杀菌物品：20%麦芽糖，1mol/lmgso4，10mmol/lmgso4，18×180mm试管灌装4.5ml和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。
四、实验方法1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20%8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/l灭菌mgso47h20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/lmgso4中，备用。
双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本原理
双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本原理双层琼脂平板法的基本原理是将待测噬菌体样品与特定细菌菌株混合，然后将混合物均匀涂布在琼脂平板上。
其中，第一层琼脂是富含营养物质的培养基，用于细菌生长。
第二层琼脂富含琼脂和补充有适当浓度的缓冲液、碳源和试剂等，以保持细菌的活性。
接种后，平板需要在适宜的温度下孵育，以促进细菌的生长。
在平板上形成的细菌克隆将以菌落的形式可见。
每个菌落则代表着一次噬菌体感染。
而待测噬菌体样品所含有的噬菌体颗粒会感染和破坏部分细菌，导致细菌无法生长形成菌落，从而形成“清除”的区域。
这样的清除区域可以帮助我们确定噬菌体溶解单位（PFU）或细菌杀灭单位（TU）。
为了准确测定噬菌体效价，通常需要操作多个稀释度的样品。
我们从最初的噬菌体样品中制备一系列稀释度，通常采用十倍序列进行缩倍稀释。
对于每个稀释度，我们都需要重复菌落的计数，并计算每毫升待测噬菌体样品中的噬菌体个数。
根据稀释度和噬菌体个数的关系，我们可以计算出每毫升待测噬菌体样品中的噬菌体颗粒数。
然后，进一步根据测定得到的噬菌体溶解单位或细菌杀灭单位的数值，我们可以计算出待测噬菌体样品的噬菌体效价。
双层琼脂平板法具有操作简便、结果直观等优点，常常用于测定噬菌体效价。
它可以为噬菌体疗法的开发和应用提供重要的参考数据。
同时，该方法也具有一些局限性，如无法区分有效噬菌体和无效噬菌体、无法测定噬菌体的特异性等。
因此，在进行测定时需要综合考虑这些因素以获取可靠的结果。
总之，双层琼脂平板法是一种基于细菌生长和噬菌体感染原理的测定噬菌体效价的常用方法。
通过该方法，我们可以获得待测噬菌体样品的噬菌体溶解单位或细菌杀灭单位，为噬菌体疗法的开发和应用提供参考数据。
噬菌体的效价测定
裂解 成熟
增殖
侵入 吸附
⑤
★烈性噬菌体与温和噬菌体旳生活史比较：
裂解性循环 屡次循环
溶原性循环
自发或诱导
同步复制 整合
⑥★溶源性菌株旳检验：
措施：在合适旳培养基中培养待测菌样→→在对 数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制→→进 一步培养→→过滤培养物，去处活菌体→→滤液 与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指 示菌旳液体培养物中）→→观察是否有噬菌斑出 现（或使菌液变清）.
★一步生长（One-step growth)
成 熟 的 噬 菌 体 粒 子 ， 除 M13 等 少 数 噬 菌 体 外 ，均 借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可 见 的培养物溶解。 噬菌体的这种生长 (繁 殖 )方 式 称 为 一步生长。
如果只观察一个被感染的细胞，噬菌体数目的增 殖过程将是一条垂直于时间的直线：
A mob of bacteriophage attacking E. coli
The oval object that stretches diagonally across the micrograph top-to-bottom is a single bacterium. The much smaller and far more numerous round guys, practically paving the surface of the bacterium, are the bacteriophage heads.
●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放旳温和噬菌体 会裂解性生活周期旳非溶源性菌株，这些菌株能够从自然 界或菌种库中取得。
⑦★溶源菌有下列特征：
☆可稳定遗传，即溶源菌旳子细胞一般也是溶原性 旳。 ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体旳潜在能 力） ☆具有抗同原噬菌体感染旳“免疫性” ☆溶源性细菌旳复愈 ☆取得新旳生理特征（溶源性转变） ☆不足转导
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导
4、转导频率的测定
向一支空试管中加入 0.5mL E. coli K12S，在 37℃恒温培养箱中培养 10min。用牛肉膏 蛋白胨液体培养基将原液稀释至 10-3、10-4，每个稀释度用 0.2mL 裂解液涂两个平板，在 37℃恒温箱中培养 48h，观察结果并计算转导频率： 转导子/mL = 每皿平均转导子数 ∗ 稀释度 ∗ 2 0.2mL
2、噬菌体效价的测定 将噬菌体裂解液活化后，取 0.5mL，用 4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行 10 倍 系列稀释至稀释到原液的 10-4。 将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入 4mL50℃的素琼脂 液体，并向每支试管中加入 0.5mL E. coli K12S，振荡使之混合均匀，再分别取 10-2、10-3、 10-4 三个稀释度的噬菌体菌悬液 0.5mL 介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在 含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。 倒置与 37℃恒温培养箱中培养 24h。 噬菌体效价计
噬菌体裂解液经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期， 在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离 的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指 1ml 噬菌体裂解液中所含 噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌 斑形成单位，进行噬菌体效价测定。 转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源 性细菌 E.coli K12F(λ )gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种 类型的噬菌体， （λ 和λ dg） ，λ dg 是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的 基因（gal） ，当缺陷性噬菌体λ dg 再次侵染敏感菌大肠杆菌 K12S 时，会将发酵半乳糖的基 因转移到 S 菌，使 S 菌获得 gal 基因，从而使得 S 菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在 EMB 培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
噬菌体效价的测定在菌苔上逐步形成的噬菌体群体由于其
（二）植物病毒
1、大多为 ssRNA 病毒。
2、基本形态为杆状、丝状、球状。
3、对宿主的专一性较差，如 TMV 等。 4、引起植物病害症状：破坏植物的叶绿体或叶绿素， 是植 物叶片发生黄化、红化或发生花叶；使植物 发生矮化、丛枝或畸形；形成枯斑或坏死。
5、增值中的侵入是被动方式。
6、已知植物病毒有 700 多种（ 1989 ）。
（三）人类和脊椎动物病毒
1、核酸类型很多， dsDNA ，ssDNA ，dsRNA ，
ssRNA 。
2、一般呈球状。 3、种类： 300+900 4、常见的人病毒 引起的疾病：感冒、肝炎、疱疹、 流行性乙型脑炎、狂犬病以及艾滋病等。动物疾病：
非溶源化，复愈后的细胞其免疫性也随之丧失；
还有其他特征，以后的章节将有陆续介绍。在自然界中各 种细菌、放线菌等都有溶源菌存在。
检验溶源菌的方法是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（遇溶源 菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，
然后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌 落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释 放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生
复制，并平均分布到两个子代细胞中去，如此代代相传。
由此可见，温和噬菌体的存在形式有三种： ①游离态 ：指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子； ②整合态 ：指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态 （一种潜伏的形式） ③营养态 ：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核 基因组而处于积极复制和装配的状态。
2.噬菌体效价的测定
在菌苔上逐步形成的噬菌体群体，由于其侵蚀宿主细胞的
9噬菌体效价学习资料
噬菌体效价的测定一、实验目的1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系；2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液方法；3、学习双层平板法测定噬菌体效价的方法；4、以局限性转导为例来，学习转导的基本原理；掌握转导实验的基本方法，测定转导率。
二、实验原理▪细菌转导：由噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。
▪转导可分为局限性转导和普遍性转导两大类。
普遍性转导：▪噬菌体能转导供体细菌的任何基因；如鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体、枯草杆菌的PBS1、PBS2、SP10噬菌体等；▪其机制在于这些噬菌体可以整合在供体菌染色体DNA的任何位置上。
P22噬菌体局限性转导：噬菌体只能转导供体菌染色体DNA上的某些特定基因；如λ噬菌体只能转导供体菌E.coli K12染色体上的半乳糖基因和生物素基因。
产生局限性转导的原因在于这些噬菌体仅能整合在供体菌染色体DNA的特定位置上。
λ(dgal +)λ(dbio +)λ原噬菌体▪转导实验中常用的是λ噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA 上的半乳糖基因（gal ）和生物素基因(bio) 之间，因此，它能转导gal 基因又能转导bio 基因。
噬菌体的溶原▪温和噬菌体侵染细胞后整合到宿主的染色体组中，使宿主细菌成为溶源性细菌。
▪溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具有感染力的噬菌体。
可以用物理或化学的方法诱导，使其大部分或全部裂解。
▪检测时需要有对此温和噬菌体敏感的细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体，被称为受体菌。
λ(dgal +)λ裂解液中λ(dgal +)(转导噬菌体)占50%λ(正常噬菌体)占50%宿主菌染色体供体菌E.coli k 12(λ) gal+▪是一种双重溶源菌▪此菌中λ噬菌体与gal +基因紧密连锁，当其受紫外线照射后即产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有gal 基因的转导噬菌体和完整噬菌体。
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三、噬菌体的分类 ——根据噬菌体与宿主菌的相互关系
烈性噬菌体（virulent phage）
能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。
温和噬菌体（temperate phage）
噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。
（用于制备9个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，10 支/组；（上周已准备好）。 5、1ml无菌吸管 4支/组。
实 验 内 容 二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等 微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
实 验 九 噬菌体效价的测定
目的要求
1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法
2、观察噬菌斑的形态
实 验 内 容 一 培养基和实验物品的准备
本次实验准备工作（2人/组）
1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）；
（已准备好）。
2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 2支/组，分装于18×180mm试管； 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用， 150ml/组，装于250ml三角瓶，
实 验 内 容 三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
斑点试验法 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） 双层平板法——最常用，优点较多 单层平板法 载玻片法——快速 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、 电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
3、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用） 但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。
六、噬菌体的危害
在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。 表现形式：①发酵周期明显延长；②碳源消 耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量， 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补； ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象； ③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
3、稀释噬菌体 取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。 4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板 （ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
实验步骤框图（教师进行演示操作）
用牛肉膏蛋白胨固 体培养基倒平板9 皿（薄一点） 敏感菌菌悬液 0.9mL
噬菌体稀释液（10-5、10-6、10-7） 0.1mL
放入已有底层固体培养基的 平板中
混匀放置5分钟
将5mL溶化的半固体培养基中倒入 上述平板中（45~50℃）
混匀（动作？）
37℃培养5小时或 室温培养12小时
五、噬菌体的应用
1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。 2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单技术。
七、以防为主的措施：
1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生； 3、决不排放或随便丢弃活菌液； 4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常 进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在 30～40米高空； 5、加强管道及发酵罐的灭菌； 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7、严格执行会客制度。
5、加入上层培养基
将5mL溶化的半固体培养基中迅速 倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板 中（45~50℃），并混合均匀。静止 凝固。 6、培养
37℃培养2.5小时或室温培养12小时。
7、观察、计数
观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度 的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格 内。
8、计算噬菌体的效价 选取30~300个pfu数的平板计算每 毫升未稀释的原液的噬菌体效价。 噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数×10× 稀释倍数
观察结果计数
教科书介绍方法的操作步骤
噬菌体稀释液 0.1ml 大肠杆菌培养液 0.9ml
混匀吸附5min
45~48℃溶化好牛肉膏 蛋白胨半固体培养基 4ml
搓动混匀后倒于 有底层的平板中
铺平
37 ℃培养5~6 小时，观察计数
思考题
1、记录结果，并进行统计分析。
10-5 噬菌体稀释度 pfu数/平板 每毫升中的pfu数 10-6 10-7
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
2、什么因素决定噬菌斑的大小？
3、如果在你的测定平板上，偶尔出现 其他细菌的菌落，是否影响你的噬 菌体效价测定？ 4、噬菌体效价测定实验中所用操作方 法和书上介绍的操作方法比较有什 么优缺点？
下周实验内容 微生物（细菌）的常见生理生化反应
要点： 1、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。 3、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微 生物的方法。 4、了解IMViC（吲哚、甲基红、伏-普、柠檬酸）与硫化 氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。
三、实验原理
一个噬菌体→侵染细胞→引起裂解→扩 散重复裂解→形成一个噬菌斑（琼脂凝 胶中） 宿主细胞数远远大于噬菌体数？ 噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数×10×稀释倍数
四、实验步骤
1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培 养基平板9个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板 上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液 0.9mL。
针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、 溶源菌
四、噬菌体繁殖（生活周期）
1、吸附 2、侵入 3、增殖（生物合成） 4、成熟装配 5、裂解释放
T4噬菌体吸附和DNA的注入
偶 数 的噬 扫菌 描体 电感 镜染 照大 片肠 杆 菌
T
T4 噬 菌 体 的 生 活 周 期
T4 噬 菌 体 的 装 配
2、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。 3、噬菌体效价： 指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成 单位（pfu，plaque-forming unit）。 效价（titre，titer）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）。
二、病毒粒子的构造（模型）
噬 菌 体 的 形 态 及 分 类 科ห้องสมุดไป่ตู้属
大 肠 杆 菌 噬 菌 体 结 构 示 意 图
T4
大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 及电镜照片
头部 领环 螺旋形尾鞘 核心或管 （中空） 尾丝 六角形基板 尾刺或刺突
噬菌斑示意照片
噬菌斑
宿主细 菌菌苔
大 肠 杆 菌 噬 菌 斑 的 表 型 形 态