噬菌体效价的测定 优质课件
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体效价的测定
实验器材
• 菌种
大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体裂解液原液
• 培养基
LB培养基，素琼脂
• 试剂仪器
Eppendorf管，移液器，水浴锅 振荡器，煤气灯等
实验步骤
• 稀释噬菌体原液 取0.1ml噬菌体原 液于0.9mlLB液体 培养基，得到10-1噬 菌体稀释液。依此类 推，稀释到10-7。
• 噬菌体与菌液混合: 取0.5ml大肠杆菌液 至50℃保温素琼脂培 养基中， 另取0.5ml 噬菌体稀释液混合。 做10-5，10-6，10-7 梯度。 。
• 手搓快速混合。
• 将已接种的上层培养基倒入底层培养基上 • 静置凝固后37℃培养24小时 • 观察噬菌斑并计数
实验结果
• 记录平板中每稀释浓度的PFU数于下表中： • 计算噬菌体效价
噬菌体稀释度 PFU数 10-2 10-3 10-4 10-5 对照
思考题
• 什么因素决定噬菌斑的大小？ • 测定噬菌体的效价，操作时要注意什么才能测定 准确？ • 计算噬菌体效价时，选择30～300个PFU的平板 计数较好，为什么？ • 在测定平板上出现其它细菌的菌落是否影响你的 效价测定？
实验 7 噬菌体效价的测定
实验目的
• 学习噬菌体效价测定的基本方法
实验原理
• 噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。 • 效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特 异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能进行噬菌体的计数。 • 噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低， 因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达 病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Formin
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定
1 目的
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规 微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出 大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速 检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体 数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需 12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养） 液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养） 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1 菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2 培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
实验十二 噬菌体效价的测定
4、将E. coli过夜菌摇匀，用吸管取菌液0.9ml分别加 入上面的10-4,10-5,10-6,10-7和对照试管中，摇匀；
5、将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5,106,10-7和对照，分别将4管混合液和对照管加入对应 的上层培养基试管中，每加入一管就要立即摇匀；
6、将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 放在台面上摇匀，使上层培养基布满平板，待平 板凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml 10-3 0.1ml
0.5ml 10-4
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A
稀释噬菌体 试管中装4.5ml水
0.1ml
0.1ml
灭菌后待用
B 空EP管中加入： 大肠杆菌0.9ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
噬菌体0.1ml 对照中换成0.1ml水 C 将全部混合液 （1ml）加入上层 培养基内
10-4
10-5
10-6
7
对照
D
倒板，37℃培养
E 观察并记数噬菌斑
噬菌体效价测定流程图
五 实验结果
1、观测平板中的噬菌斑,将每一个噬菌斑形成单位 (pfu),记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板 记数每ml未稀释的原液的噬菌体的效价. 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数
2、实验数据
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌噬菌体原液，大肠杆菌；
2、培养基：上层培养基（5管/组），LB平板（5个/ 组）；
3、4.5mL无菌水（7管/组）；
4、EP管（5管/组）。
四、实验步骤
1、过夜培养物出现澄清，用无菌滤头过滤纯化获得噬 菌体滤液；
噬菌体的检查与效价鉴定
噬菌体的检查与效价鉴定噬菌体的检查与效价鉴定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
噬菌体的检查及效价测定
5.1.4.1双层琼脂平板法
5.1.4.1.1 倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
5.1.4.1.3恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
5.1.4.1.4 观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──%26not;%26not;%26not;%26not;噬菌斑。
5.1.4.2 单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.3 噬菌体与菌液混合：
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀， 置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
实验七 噬菌体效价的测定
实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定杨明轩生物111 1102040128一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑，即为噬菌斑。
人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。
噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。
该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。
只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
公式为：噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验选择的是λ噬菌体EA94，它是一种被改造过的烈性噬菌体。
三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392；2、噬菌体：λ噬菌体EA94；3、培养基：300ml三角瓶中分装100ml LB培养基，15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖；4、灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装4.5ml和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。
四、实验方法1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌 MgSO4・7H20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中，备用。
噬菌体效价的测定在菌苔上逐步形成的噬菌体群体由于其21页PPT
（1）双层平板法 是一种被普遍采用并能精确测定效价的方法。预先分别配制
含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用前者在培养 皿上浇一层平板，再在后者(须先融化并冷却到45℃以下)中加入 较浓的对数期敏感菌和一定体积的待测噬菌体样品，于试管中 充分混匀后，立即倒在底层平板上铺平待凝，然后保温。一般 经十余小时后即可进行噬菌斑计数。现把双层平板法简括如下:
(2)裂解期 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬
菌体粒子急剧增多的一段时间。噬菌体或其他病毒因没有 个体生长，只有个体装配再加上其宿主细胞裂解的突发性， 因此，从理论上来分析，裂解期应是瞬时的。但事实上因 为细菌群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故实际上 的裂解期还是较长的（见图）。 (3)平稳期(plateau)
概括地说，温和噬菌体的特点为：
①具有整合能力，当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞 后，前者的核酸可整合到后者的核基因组(genome，即 核染色体)上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作前噬 菌体(prophage）； ②具有同步复制能力，前噬菌体在一般情况下不进行复 制和增殖， 而是随宿主细胞的核基因组的复制而同步复 制，并平均分布到两个子代细胞中去，如此代代相传。
由此可见，温和噬菌体的存在形式有三种： ①游离态：指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子； ②整合态：指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态 （一种潜伏的形式） ③营养态：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核 基因组而处于积极复制和装配的状态。
温和噬菌体的种类很多，常见的有E.coli的λ Mu-1、P-1和 P-2噬菌体等。其中， λ噬菌体是研究最为透彻的一种温和噬 菌体。
噬菌体的效价测定PPT共24页
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
bacterium's nucleoid.
Fig. 1: Lysogenic Life Cycle of a Temperate Bacteriophage
温和噬菌体与溶源性①
★温和噬菌体(temperate phage)----吸附并
侵入细胞后，噬菌体的DNA整合在宿主的 染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制 而同步复制，因而在一般情况下不进行增殖 和引起宿主细胞裂解的噬菌体, 如E.coli的 、P1、P2，Salmonella typhimurium的P22 等。
就目前所知，所有温和噬菌体的核酸都是双链DNA。按 照温和噬菌体DNA与细菌DNA结合部位的不同，又可将其分 成两类：
①只有一个特定结合部位的温和噬菌体：
如： 大肠杆菌的 噬菌体
②具有多个或不定部位的温和噬菌体：
如： 大肠杆菌的P1噬菌体 鼠伤寒沙门氏菌 P22 噬菌体 。
Lambda attachment sites
Hale Waihona Puke (2).The Lysogenic Life Cycle of Temperate Bacteriophages
Adsorption Penetration Prophage Formation
Replication Maturation Release
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3、稀释噬菌体
取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。
4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合
将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板 （ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。
温和噬菌体（temperate phage）
噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。
针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、 溶源菌
2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单技术。
3、细菌感染的诊断与治疗
利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用）
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补；
②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象；
③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
T4
大 肠 杆 菌 噬 菌 体 结 构 示 意 图
大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 及电镜照片
头部
核心或管 （中空） 尾丝
尾刺或刺突
领环 螺旋形尾鞘
六角形基板
噬菌斑示意照片
噬菌斑
宿主细 菌菌苔
T
大 肠 杆 菌 噬 菌 斑 的 表 型 形 态
三、噬菌体的分类 ——根据噬菌体与宿主菌的相互关系
烈性噬菌体（virulent phage）
四、噬菌体繁殖（生活周期）
1、吸附 2、侵入 3、增殖（生物合成） 4、成熟装配 5、裂解释放
T4噬菌体吸附和DNA的注入
T
偶
的 扫 描 电 镜 照 片
数 噬 菌 体 感 染 大 肠
杆
菌
T4
噬 菌 体 的 生 活 周 期
T4
噬 菌 体 的 装 配
五、噬菌体的应用
1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。
3、噬菌体效价：
指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成 单位（pfu，plaque-forming unit）。
效价（titre，titer）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）。
二、病毒粒子的构造（模型）
噬 菌 体 的 形 态 及 分 类 科 属
实验九 噬菌体效价的测定
目的要求
1、掌握噬菌体效价测定的原理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法 2、观察噬菌斑的形态
实验内容一 培养基和实验物品的准备
本次实验准备工作（2人/组）
1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。
2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 2支/组，分装于18×180mm试管；
轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量， 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。
七、以防为主的措施：
1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生； 3、决不排放或随便丢弃活菌液； 4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常
进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在 30～40米高空； 5、加强管道及发酵罐的灭菌； 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7、严格执行会客制度。
3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用， 150ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备9个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，10 支/组；（上周已准备好）。
5、1ml无菌吸管 4支/组。
实验内容二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等
微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
2、噬菌斑：
在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。
三、实验原理
一个噬菌体→侵染细胞→引起裂解→扩 散重复裂解→形成一个噬菌斑（琼脂凝 胶中）
宿主细胞数远远大于噬菌体数？ 噬菌体效价（pfu/ml）=
噬菌斑数×10×稀释倍数
四、实验步骤
1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培
养基平板9个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌
但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。
六、噬菌体的危害
在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。
表现形式：①发酵周期明显延长；②碳源消 耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
斑点试验法 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） 双层平板法——最常用，优点较多 单层平板法 载玻片法——快速 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
5、加入上层培养基
将5mL溶化的半固体培养基中迅速 倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板 中（45~50℃），并混合均匀。静止 凝固。
6、培养
37℃培养2.5小时或室温培养12小时。
7、观察、计数