人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用
人源化抗体与单克隆抗体制备的主要方法
ELISA
抗體生產： 1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右； 腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。 2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫時 間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。 4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰ • 硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 • 離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。 • 膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。 • 親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。
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基因工程抗体的优点和缺点 • 优点：
不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。 利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。 全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。
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• 目的：
缺点：
抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。
克隆化的原则是对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失
单克隆抗体的制备及其应用
单克隆抗体的制备及其应用单克隆抗体是一种能够识别特定抗原并结合于它的单一克隆抗体分子。
相对于传统的混合抗体，单克隆抗体具有更加精准的特异性和较高的亲和力，因此在现代医学中应用广泛，尤其在疾病的诊断、治疗和预防方面发挥着重要的作用。
制备单克隆抗体的过程可以分为四个主要步骤：免疫原的制备、小鼠的免疫、脾细胞的融合和单克隆抗体的筛选和鉴定。
免疫原制备免疫原是指能够引起免疫反应并且激发机体产生抗体的物质。
制备免疫原主要有两种方法：一是纯化目标分子，二是化学合成人工抗原。
纯化目标分子是指从生物体内提取目标蛋白质，包括人类血清、细胞培养上清液或从组织中分离的蛋白质，通过高效液相层析或离子交换层析等技术达到纯度要求。
化学合成人工抗原需要建立三级结构，并且通过光谱分析等技术进行鉴定。
小鼠的免疫制作单克隆抗体时，一般使用小鼠进行免疫。
将免疫原注射到小鼠体内，通过免疫系统的识别和选择，产生能够与目标分子特异性结合的抗体，这些抗体被称为多克隆抗体。
免疫时间和免疫剂量都是需要精细控制的参数，以确保得到的多克隆抗体可以覆盖免疫原的所有表位。
脾细胞的融合脾细胞是一个重要的免疫细胞，当它遇到免疫原时，会产生抗体。
将免疫小鼠的脾脏取出，制成单细胞悬液，然后与能够维持无限增殖的癌细胞融合。
融合细胞将产生能够继承小鼠脾细胞产生的抗体特异性和癌细胞的无限增殖能力的“嵌合抗体细胞”。
单克隆抗体的筛选和鉴定通过将“嵌合抗体细胞”进行单细胞分离和分层培养，筛选出特异性结合目标分子的单抗，并经过多重鉴定，包括酶联免疫吸附实验、亲和力检测试验、特异性试验、同工酶分析、生物学鉴定和单克隆抗体的特性鉴定等多项检测，确保得到的单克隆抗体具有较高的特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体的应用单克隆抗体可应用于医学、生物技术及科学研究等领域，例如基因工程药物、免疫诊断、癌症治疗、疫苗研发、食品安全检验、环境检测和生物学研究等方面。
在基因工程药物开发中，单克隆抗体能够定位特定的蛋白质，从而研制出精确治疗某种疾病的药物，例如格拉西米布是一种单克隆抗体，用于治疗类风湿性关节炎和肠炎。
破伤风毒素C片段单克隆抗体的研制
・论著・文章编号:1007-8738(2009)02-0161-03破伤风毒素C 片段单克隆抗体的研制单艳菊,潘志明,程宁宁,张成全,孙 林,焦新安3(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州225009)收稿日期:2008-05-26; 接受日期:2008-06-30基金项目:国家自然科学基金资助项目(30425031);全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目(200358)作者间介:单艳菊(1982-),女,江苏大丰人,硕士生,现在江苏省家禽科学研究所工作3Corres ponding author,E 2mail:jiao@yzu .edu .cnTel:0514287971136[摘要] 目的:研制抗破伤风毒素C 片段(Tet C )的单克隆抗体(mAb )。
方法:以纯化蛋白H is 2Tet C 免疫6周龄雌性BALB /c 小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/02Ag 214融合,应用间接E L I S A 筛选阳性克隆。
W estern bl ot 鉴定mAb 的特异性,并用mAb 亚类试剂盒鉴定mAb 亚类。
结果:共获得5株稳定分泌抗Tet C 的杂交瘤细胞株,分别命名为1E5、5G10、6B9、7D6、7F5,其腹水效价除1E5为3×210外,其余均为1×105,亚类鉴定结果均为I gG 1。
W est 2ern bl ot 分析结果显示,5株mAb 均与融合蛋白H is 2Tet C 发生特异性反应。
结论:成功制备了抗Tet C 的mAb,为进一步研究Tet C 的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系以及建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法奠定了基础。
[关键词]破伤风毒素C 片段;单克隆抗体;研制[中图分类号]R392.11 [文献标识码]B 破伤风毒素(tetanus t oxin,TT )是破伤风梭菌感染伤口后,在缺氧的条件下产生的神经毒素,是已知最毒的毒素之一。
人单克隆抗体制备
人单克隆抗体制备一、引言人单克隆抗体是由一种单一的免疫细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
与传统的多克隆抗体相比，人单克隆抗体具有更好的一致性和稳定性，因此在医学研究和临床应用中具有重要意义。
二、制备方法人单克隆抗体的制备可以通过以下步骤完成：1. 免疫原选择：选择与目标疾病相关的适当免疫原，如病毒、细菌、肿瘤抗原等。
2. 免疫动物免疫：将免疫原注射到合适的动物体内，如小鼠、大鼠等，以激发免疫反应。
3. 混合细胞免疫：从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，与骨髓细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：使用选择性培养基筛选出能够产生目标抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆细胞扩增：将合适的杂交瘤细胞注射到小鼠或裸鼠体内，获得单个克隆的杂交瘤细胞。
6. 抗体表达和纯化：将单克隆细胞培养并收集上清液，通过亲和层析、离子交换层析等技术纯化目标抗体。
三、应用领域人单克隆抗体在医学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 治疗：人单克隆抗体可以用于治疗各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病等。
通过与靶标分子结合，抑制病理过程或刺激免疫系统，达到治疗效果。
2. 诊断：人单克隆抗体可以作为诊断试剂，用于检测疾病的标志物或特定分子。
例如，通过检测血清中的特定抗体可以判断是否感染某种病原体。
3. 研究工具：人单克隆抗体可以作为研究工具，用于研究特定分子的功能、相互作用等。
例如，可以使用单克隆抗体来检测蛋白质在细胞中的定位和表达水平。
4. 药物研发：人单克隆抗体也可以作为药物研发的载体。
通过将药物结合到抗体上，可以提高药物的靶向性和稳定性，减少副作用。
四、发展前景人单克隆抗体制备技术的不断发展，为医学研究和临床治疗带来了巨大的机遇。
随着基因工程和生物技术的进步，越来越多的人单克隆抗体将被制备出来，并在各个领域得到广泛应用。
然而，人单克隆抗体的制备过程还存在一些挑战和限制。
例如，制备过程中可能出现杂交瘤细胞的不稳定性和纯化困难等问题。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
人源抗破伤风毒素单链抗体_ScFv_的原核表达_纯化及功能鉴定
Key words: Single chain Fv ( ScFv) ; Prokaryotic exp ression; Neutralizing activity
破 伤风 ( Tetanus) 是 由 破 伤 风 梭 状 芽 胞 杆 菌 (C lostrid ium tetan i) 感染所引起的常见性疾病且病 死率很高 ,破伤风杆菌在自然界广泛存在 ,很容易随 创伤 ,如一般性外伤 ,妇女生产婴儿时的创伤等感染 人体 ,其病死率高达 90%以上 。一但感染破伤风杆 菌 ,唯一有效的治疗方法是使用破伤风抗毒素 。中 国用于临床的破伤风抗毒素为马抗血清和人破伤风 免疫球蛋白 ,前者为异源蛋白 ,易引起人体过敏反 应 ,后者由于是人血生产存在血源不足或可能存在 潜在病毒污染的问题 。杂交瘤技术制备抗体的技术 目前还不理想 。鼠源单克隆抗体由于是异源蛋白 , 易引起过敏 ,应用受到局限 ,人源杂交瘤细胞由于细
that the penetrating power is strong, is not easy to induce the allergic reaction and can be directly targeted to toxin. It is
suitable for the p revention and treatment of tetanus.
微生物学免疫学进展 2009年第 37卷第 4期 Prog in M icrobiol Immunol Nov. 2009, Vol. 37 No. 4
5
兰州生物制品研究所第五研究室保存 。 1. 2 工具酶与化学试剂
Taq酶 、核 酸 内 切 酶 、T4 DNA 连 接 酶 、DNA M arker 、IPTG、卡那霉素 、购自大连宝生物公司 ; 胶 回收试剂盒购自 Roche 公司 ; 蛋白质 M arker及 N i 亲和层析柱 ,购自 GE公司 ; TR Izol试剂购自 Invitro2 gen公司 。 1. 3 PCR引物
破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定
ｓ ｉｓ：Ａ ｆｅ ｅｌｆ ｓｏ ｎ ｕ ｌｎｉ ｕｔ ｔ ｒｃ ｌ ｕ ｉｎ ａ ｄ ｓ ｂｃｏ ｎｇ， ｔ ｅ ｈ ｂｒｄｏ ａ ｅｌｌｎｅ ｓ ｃ ｅ ｉ ｈｒ ｅ ｙ ｉ ｍ ｃ ｌ ｉ ｓ ｅ ｒ ｔｎｇ ｍｏｎ ｌｎａ ｎ ｉ ｏ ｅ ｐｅ ｉｉａｌ ｏｃｏ ｌａ ｔｂ ｄｉｓ ｓ ｃｆｃ ｌｙ ａ ａ ｎ ｔｔ ｔ ｎｉ ｏｘ ｄ ｗ ｅ ｅ ｏ ａｎ ｄ， ａ ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ｍ ｅ ｓ Ｅ１ １ ｌ ｎｄ １ ，． Ｉ ｒ ｃ ＥＬ Ｉ ｇ ｉ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｏｉ ｒ ｂｔ ｉｅ ｎｄ ｅ ｐ ｃ ｉｅ ｙ ｎａ ｄ ａ １ ２， Ｅｌ ａ Ｇ ｏ ｎｄｉｅ ｔ ＳＡ ａ ｎｄ Ｗ ｅ ｔ ｒ — ｏ ａ ｓ ｙ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｔ Ｍ ｃ ｂ １ ２， １ 】 ａ ｄ Ｇ１０ ｃ ｌ ｐｅ ｉｉａｌ ｅ ｏｇ ｚ ｅ ａ ｃ ｏｘ ｄ． ｓ ｅ ｎ ｂｌｔ ｓ ａ ｈ ｄ ｔ ｔ ｈｅ Ａ ｓ Ｅ１ Ｅ１ ｎ １ ｏｕ ｄ ｓ ｃｆｃ ｌｙ ｒ ｃ ｎｉｅ ｔ ｔ ｎｉ ｔ ｏｉ Ｃｏ ｌ ｓｏ ｎｃｕ ｉｎ：Ｔ ｈ ｐ ｃｆｃ ａ ｉｔ ｔ ｉ ｏｘ ｉ ｃ ｅ ｓ ｅ ｉｉ ｎｔ ｅａｎｃ ｔ ｏｄ Ｍ Ａｂｓａ ｅ ｄ ｖ ｌ ｐ ｄ ａｎ ｈｅ ｅＭ ｃ — ｒ ｅ ｅ ｏ ｅ ｄ ｔ ｓ Ａｂｓｍ ａ ｓ ｆ １ｉ ｈｅｄｅ ｅ－ ｙ ｂｅ ｕ ｅ ｕ ｎ ｔ ｖ ｌ ｏｐｍｅ ｆｄｅ ｅ ｔｏｎ ａ ｓ ｙ ａ ｄ ｂ ｉ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏｆｔ ｅ ｐａ ｈ ｅ ｅ ｉ ｆＴｅ ａ ｎｔｏ ｔｃ ｉ ｓ ａ ｎ ａｓｃ ｒ ｓ ａ ｃ ｈ ｔ ｏｇ ｎ ｓｓ ｏ ｔ ｎｕｓ ．
抗破伤风毒素人源单克隆抗体中和效力的研究
抗破伤风毒素人源单克隆抗体中和效力的研究程洁X赵红谢小梅孟筱琦(兰州生物制品研究所,兰州730046)摘要:对抗破伤风毒素人源单克隆抗体G2、G6、G2+G6与精制破伤风抗毒素进行了中和效力比较试验。
结果表明,G2、G6二株单抗的中和毒力活性均比精制破伤风抗毒素的高。
G2和G6混合后呈完全中和。
表明这些人源单抗在中和毒力方面能够取代精制破伤风抗毒素,可满足临床试验需求。
关键词:抗破伤风毒素人源单克隆抗体;中和效力;精制破伤风抗毒素(T AT)中图分类号:R51713文献标识码:A文章编号:1005-5673(2000)01-0058-02Study of protective ability of ant-i tetanus humans m onoclonal antibodies with neutralizing activity CH EN G Jie,Z H A O H ong,XI E X iaomei et alAbstract:T he toxin-neutralizing act ivity was detected by human MA bs G2、G6、G2+G6and horse ant-i tetanus antitoxin. T he result sho wed that human MA bs G2、G6、G2+G6w ere significantly hig her t han that of T A T.T hese human mo no-clonal antibo dies were no vel replacement for clinical trial.Key words:A nt-i tetanus human monoclonal antibodies;Neutralization-titer;TA T破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病。
抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备与鉴定
抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备与鉴定①董国霞张华捷晁哲田霖侯启明谭亚军②马霄②（中国食品药品检定研究院百白破疫苗和毒素室，卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京102629）中图分类号R392.1文献标志码A文章编号1000-484X（2021）18-2252-05［摘要］目的：制备抗破伤风类毒素单克隆抗体，并对其进行鉴定。
方法：用破伤风类毒素免疫BALB/c小鼠，经细胞融合及筛选，将阳性杂交瘤细胞株扩大培养后免疫BALB/c小鼠，收获的腹水用Protein G柱纯化；对获得的单克隆抗体进行鉴定，对杂交瘤细胞株进行稳定性检测。
结果：筛选出5株稳定分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为T1、T2、T3、T4、T5，其分泌的单克隆抗体分别为IgG1、IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG1亚类，轻链均为к型；均与百白破疫苗中的T抗原具有较好的反应，与D抗原、PT抗原、FHA抗原和PRN抗原无交叉反应；其中2株单克隆抗体为中和性抗体。
结论：获得5株抗破伤风类毒素单克隆抗体，其中2株为中和性抗体，为破伤风疫苗效价检测新方法的建立等奠定了基础。
［关键词］破伤风类毒素；单克隆抗体；制备；鉴定Preparation and identification of monoclonal antibodies against tetanus toxoid DONG Guo-Xia，ZHANG Hua-Jie，CHAO Zhe，TIAN Lin，HOU Qi-Ming，TAN Ya-Jun，MA Xiao.Division of DTP Vaccine and Toxins，Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products，National Institute for Food and Drug Control，Beijing102629，China［Abstract］Objective：To prepare and identify monoclonal antibodies against tetanus toxoid.Methods：BALB/c mice were immunized with tetanus toxoid，cells were fused and the positive hybridoma cell strains secreting tetanus antibodies were screened out. After the positive hybridoma cell strains were cultured on expansion，BALB/c mice were immunized，ascites were harvested and puri‐fied by Protein G-column，and monoclonal antibodies were obtained.The monoclonal antibodies were identified and the hybridoma cell strains were tested for stability.Results：Five hybridoma cell strains secreting monoclonal antibodies against tetanus toxoid were screened out，named T1，T2，T3，T4and T5respectively.The monoclonal antibodies were IgG1，IgG2b，IgG1，IgG2b and IgG1sub‐classes respectively and all light chains wereкtype.All of them had good reaction with T antigen and had no cross reaction with D anti‐gen，PT antigen，FHA antigen and PRN antigen in DTP vaccine.Two of them were neutralizing antibodies.Conclusion：Five mono‐clonal antibodies against tetanus toxoid have been obtained and two of them are neutralizing antibodies，which provides the foundation for the new method establishment of the potency test of tetanus vaccine etc.［Key words］Tetanus toxoid；Monoclonal antibody；Preparation；Identification破伤风疫苗是预防破伤风的有效途径，破伤风类毒素是破伤风疫苗的主要有效组分，破伤风疫苗效价检测是疫苗有效的重要指标。