褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SFLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析

摘要褐藻羊栖菜对淡水浸泡有很强的耐受能力，利用此特性，养殖户们用淡水浸泡的方法清除沙蚕等敌害生物，而对羊栖菜幼苗则无不良影响，而藻类独特的水通道蛋白在其中可能扮演重要角色。

通过克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，其包含678 bp的开放阅读框，编码225个氨基酸，sflip蛋白结构域预测表明其含有6个跨膜区域并且含有2个npa水通道特征性单元，但其中第二npa被npm取代；基因结构分析发现sflip基因含有5个内含子，与长囊水云的同源性很高；sflip基因在淡水浸泡过程中的表达先升后降，但随着时间延长则又显著上升。

上述结果表明，sflip属于藻类中发现的一类新的水通道蛋白，其在羊栖菜耐受低渗胁迫中可能有种特殊的作用机制。

关键词羊栖菜；水通道蛋白；基因克隆；淡水胁迫；基因表达中图分类号 q943.2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2016）11-0228-04水通道蛋白（aquaporins，aqps）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白通道，属主要内在蛋白（major intrinsic proteins，mips）家族成员，除水分子外，aqps还能转运甘油、硼酸、二氧化碳、尿素和过氧化氢等多种小分子。

高等植物中存在大量aqps基因，如拟南芥（arabidopsis thaliana，35个）[1]、水稻（oryza sativa，34个）[2-3]、玉米（zea mays，35个）[4]，根据亚细胞定位和转运能力的不同，主要分为pip（plasma membrane intrinsic protein）、tip（tonoplast intrinsic protein）、nip（nodulin-26 like intrinsic protein）、sip（small intrinsic proteins）和xip（x intrinsic proteins）等6类[5]。

目前的研究较少关注低等植物――藻类的aqps，它们的数量明显少于高等植物，如长囊水云（ectocarpus siliculosus，3个）、三角褐指藻（phaedactylum tricornutum，5个）、假微型海链藻（thalass-iosira pseudonana，2个）等[6]。

对高等植物而言，组织、器官高度分化，不同的膜、组织，甚至不同的外界条件及胁迫时间，都可能需要有不同的aqps，因此目前高等植物中发现庞大数量的aqps符合它们应对不同外界胁迫的要求；而藻类等低等植物，形态、结构和生活方式较简单，一般没有根、茎、叶的分化，它们体内aqps的数量就相对较少。

另一方面，由于藻类与陆生高等植物在生长环境上存在巨大差异，藻类特别是海洋藻类中的aqps，在其应对渗透胁迫上的作用机制与高等植物也会有所区别。

本研究克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，分析了该基因的氨基酸序列特征、基因结构及其在淡水浸泡过程中的表达模式，并预测了其蛋白结构域。

1 材料与方法1.1 试验材料羊栖菜采集自温州市洞头县鹿西岛。

收集后，用保温箱在2 h内将海藻运回实验室。

接着马上用过滤过的天然海水洗涤藻体，在用淡水处理前将其置于20 ℃装有灭菌天然海水的高密度聚丙烯箱中暂养2 d，光周期为12 h∶12 h，并向培养基中通气，同时每天更换新鲜灭菌海水。

1.2 羊栖菜总rna提取和cdna合成样品在液氮中研磨后采用ctab法提取总rna[10]，经dnase消化去除dna，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的浓度和完整性。

cdna合成采用roche公司cdna合成试剂盒。

1.3 sflip编码区序列的扩增以羊栖菜cdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip编码区外显子全序列。

pcr反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。

以羊栖菜gdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip基因组全序列。

采用neb公司超保真pcr试剂盒。

将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。

1.4 序列分析及比较根据已知的cdna序列设计合适引物，获得sflip的基因组序列，继而对基因结构进行分析；通过protscal软件[11]预测分析sflip蛋白的疏水域；同时，用octopus[12]软件对aqps 蛋白拓扑结构进行预测。

1.5 羊栖菜基因的实时定量pcr分析以正常盐度海水处理为对照和淡水处理时间为5、15、30、60、300 min的藻体cdna为模板，对sflip基因在淡水处理不同时间后的表达进行荧光实时定量pcr分析。

荧光实时定量pcr试剂盒采用bio-rad公司的，pcr反应体系按照试剂盒说明书。

以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，利用bio-rad iq 5多重荧光定量pcr进行目标基因表达情况的分析。

反应程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，54 ℃退火20 s，40个循环；65～95 ℃，每次上升0.5 ℃作溶解曲线。

54 ℃收集荧光信号。

每个样品重复3次，取其平均值。

所用的基因特异引物参照表1。

2 结果与分析2.1 sflip基因编码区序列前期，在羊栖菜转录组数据中发现了一个可能编码aqp的基因，深入分析，发现其与藻类中发现的一类新的aqp――lip的序列同源性非常高[6]，因此将该基因命名为sflip。

根据该序列设计特异性引物sflip1和sflip2，并以羊栖菜cdna为模板进行pcr扩增，测序后确认序列的同源性达100%，克隆获得的sflip基因编码区序列包含了678 bp的开放阅读框（orf），编码225个氨基酸（图1）。

为了解sflip基因的结构，以羊栖菜gdna为模板进行pcr扩增，测序结果发现，sflip 基因包含5个内含子，并且都符合gt-ag规则，所有内含子的碱基都以gt起始和ag终止，长度为507～1 894不等（图2）。

2.2 基因序列分析及结构域预测经protparam软件分析，sflip蛋白分子量为24.03 kd，理论等电点为5.69，负电荷的氨基酸残基总数（asp+glu）为11，带正电荷的氨基酸残基总数（arg+lys）为10，不稳定系数（instability index，ⅱ）为21.24，是一类稳定的蛋白。

按照octopus对sflip跨膜结构的预测，该蛋白具有6个跨膜区，分别位于15―23、34―64、75―95、119―139、148―168和195―215氨基酸位置，有2个aqp家族成员高度保守的npa（天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，asn-pro-ala）单元，分别位于58―60和174―176氨基酸位置，其中，第2个npa中的丙氨酸被甲硫氨酸替换（图3）。

2.3 sflip基因序列同源性分析通过氨基酸序列比对显示（图4），羊栖菜sflip与其他藻类lip的同源性为长囊水云（ectocarpus siliculosus，cbj-27953）84%、微绿球藻（nannochloropsis gaditana，xp_005853 759）43%、三角褐指藻（phaeodactylum tricornutum，xp_0021 76929）34%、柱状脆杆藻（fragilariopsis cylindrus）33%、针尖杆藻（synedra acus，aeq27900.1）31%、假微型海链藻（thala-ssiosira pseudonana，xp_002287257）30%、大洋海链藻（thal-assiosira oceanic，ejk66519）30%、多列拟菱形藻（pseudo-nitzschia multiseries）29%以及褐潮藻（aureococcus anophage-fferens，xp_009034432）25%。

对其氨基酸序列与其他藻类lip蛋白利用clustal x构建进化树（图5）。

结果显示，10个藻类lip类aqp基因被聚为三大类群，其中sflip蛋白与长囊水云esmip聚为一类，亲缘关系最近。

2.4 sflip基因的表达特异性分析为了检测羊栖菜淡水浸泡过程中sflip基因表达量的变化，以不同处理时间羊栖菜的cdna为模板，以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，对sflip基因进行实时荧光定量pcr分析。

结果（图6）显示，在短时间内（5 min），与对照组相比，sflip基因的表达量迅速上升了1.29倍，之后呈下降趋势，淡水浸泡30 min后，sflip基因表达量恢复到浸泡前水平，而1 h后则降至对照的39%，但更长时间（5 h）的浸泡又使得sflip基因的表达量显著上调。

表明sflip基因对淡水胁迫存在瞬时的应激反应，表达量迅速上调，随着胁迫时间的延长，该基因的表达受到显著抑制，表达量急剧下调，但更长时间的胁迫则又使得其表达量逐渐恢复并成倍上调表达，这可能与该基因所行使的功能有关。

3 结论与讨论aqps在植物应对渗透胁迫中起着重要作用，以往的研究主要集中在高等植物身上，较少涉及藻类，而藻类、特别是潮间带的海洋藻类，由于其生活环境与陆生高等植物间存在巨大差异，既会经历各种高盐、脱水等高渗，也需经受雨水等低渗在内的极端环境的胁迫，因此藻类在应对外界环境胁迫的机制上应区别于高等植物，对于aqps同样如此，研究aqps有助于解析此类低等植物耐受渗透胁迫的应对机制。

aqps通常含有6个α螺旋跨膜结构（h1-h6），而每个α螺旋由20个左右氨基酸组成，aqps的-nh和-cooh末端位于胞质侧，跨膜结构间由环连接，分为3个胞外环（a、c、e环）和2个胞内环（b、d环），其中b、e环各有一段高度保守的npa单元串联序列[13]。

此外，特定的4个氨基酸，包括h2、h5各1个外加le环上2个，形成了一个特殊的ar/r（芳香类氨基酸/精氨酸）过滤结构，对aqps的底物特异性起到重要影响[14]。

本研究获得的羊栖菜aqp与藻类中发现的一类新的aqps亚家族成员lips同源性极高，因此将其命名为sflip。

lips 虽然在氨基酸序列上与sip非常接近，但在aqps家族中高度保守的特征性序列上却存在显著差异，其第2个npa单元中的丙氨酸被替换成了疏水性更强的甲硫氨酸，后者的侧链更长；同时，对于sflip结构域的预测则显示其与其他aqps的差异，特别是对于h1和h2的推测，不同软件（如octopus和thmm等）预测的结果存在不一致性，表明该区域的不确定性；此外，sflip在ar/r过滤结构上也与lips非常接近，由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸和异亮氨酸组成。