克隆基因表达及基因干扰-修
克隆基因的表达
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
基因工程育种的原理及应用
基因工程育种的原理及应用1. 基因工程育种的原理基因工程育种是通过改变生物体的遗传信息来改良和改变其性状的一种育种方法。
其原理主要涉及以下几个方面：1.基因克隆：基因工程育种的核心技术之一是基因克隆。
基因克隆是指将目标基因从一个生物体中提取并复制到另一个生物体中。
这样做可以将某种有益基因导入到目标生物体中，使其表达具有该基因所编码的特定蛋白质或其他功能分子。
2.基因编辑：基因编辑是指通过针对目标基因进行精确的DNA序列修改来改变生物体的性状。
常用的基因编辑技术有CRISPR-Cas9和TALEN等。
这些技术可以在生物体的基因组中精确地切割和修改DNA序列，以实现对目标基因的特定改造。
3.遗传转化：遗传转化是将外源基因导入到目标生物体中，并使其在细胞内正常表达的过程。
常用的遗传转化技术包括农杆菌介导的基因转化和生物颗粒枪介导的基因转化等。
这些技术使得研究人员可以将具有特定功能的基因引入到目标生物体，从而改变其性状。
4.基因表达调控：基因表达调控是指通过对目标基因的转录和转译过程进行调控，以改变生物体的性状。
常用的基因表达调控技术包括启动子工程、转录因子介导的调控和RNA干扰等。
这些技术能够使研究人员能够精确地调控目标基因的表达水平，从而改变生物体的性状。
2. 基因工程育种的应用基因工程育种已经在许多领域得到了广泛的应用，其应用主要包括以下几个方面：1.农作物育种：基因工程育种已经成功地应用于农作物的改良。
通过导入与抗虫、抗病、耐逆等性状相关的基因，可以使农作物具有更好的抗病虫害能力和逆境适应性。
例如，将Bt基因导入到作物中，可使其对昆虫害虫具有抗性，从而降低对农药的依赖。
2.畜禽养殖：基因工程育种也广泛应用于畜禽养殖中。
通过引入与生长速度、肌肉质量、抗病能力等性状相关的基因，可以提高畜禽的生产性能和抗病能力。
例如，通过导入生长激素基因，可使畜禽生长速度加快，从而提高养殖效益。
3.医药研发：基因工程育种在医药研发领域也有重要应用。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
克隆技术及基因表达专题
General features of a Vector
1. They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of host’s genome. 2. Easily to be isolated from the host cell. Most are circular, some are linear (e.g. YAC vector). 3. Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not. 4. Contains a multiple cloning site (MCS) to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation.
1.Transformation (转化) : introduction of plasmids into bacteria. 2.Transfection (转染): introduction of plasmids and other exogenous nucleic acids into eukaryotes such as mammalian cells.
1 Kb+ ladder
2 Positive clones digested with different restriction enzymes
Restriction mapping
Empty vector
基因工程7克隆基因的表达概述
7.3.1.2 终止子
提供转录停止信号的DNA序列称为终 止子，它可被RNA聚合酶识别并停止合成 mRNA。通常终止信号是一小段DNA片段 ，它的RNA转录本上碱基对可自身相互配 对形成柄-环结构。
强启动子是能维持高频率转录的启动子 ，通常控制那些细胞需要其大量转译产物的 基因转录；而弱启动子具有相对较低的转录 效率，指导那些仅需要其少量转译产物的基 因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所 控制的基因放在强启动子的下游，从而获得 高效表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能 也有影响，各启动子都需要一些最适的间隙 ，通常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
(1) 能识别和除去外源基因中的内含子，加工 形成成熟的mRNA，即带内含子的天然基因是 可以利用的；
(2) 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆 菌表达的蛋白是无糖基化的，糖基化对某些表 达蛋白的免疫原性影响很大。
真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问 题：
(1) 转化真核细胞的效率低； (2) 表达效率不够高； (3) 细胞培养(动植物) 工艺较复杂，成本高； (4) 选择标记及选择系统较少。
2. 影响mRNA转译效果的因素：
(1) SD序列与反SD序列的互补程度：互补程 度高，则表达强。
(2) SD序列与AUG之间的间隔距离(spacer)， 使用不同的启动子，表达不同的基因，其 最佳间隔不一样。
(3) –20 bp到＋13 bp这一段序列中不要有二级 结构（发卡结构）。
(4) 连接在SD序列后面的4个碱基的改变，会 对转译效率发生很大的影响，如果这个区 域由4个A组成，其转译作用最为有效；而 当其被4个C或G替代，则转译效率仅为最高 值的25~50%。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因克隆：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
基因工程的原理及技术
基因工程的原理及技术导言基因工程是一门重要的生物学分支，通过改变生物体内的基因组成，使其具有特定的性状和功能。
随着基因工程领域的不断发展，人类已经可以利用基因工程技术来改良农作物、研发新药、治疗基因疾病等。
本文将介绍基因工程的基本原理和常用技术。
基本原理基因是生物体内控制遗传信息的载体，基因工程的核心原理是通过改变特定基因的组成及其表达方式来改变生物体的性状和功能。
基因工程的基本原理包括以下几个方面：1.基因克隆：基因克隆是基因工程的重要手段之一。
通过将特定基因从一个生物体中剪切出来，并将其插入另一个生物体的染色体中，实现对目标基因的复制和表达。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割和连接、PCR 扩增等。
2.DNA序列分析：DNA序列分析是基因工程研究的基础。
通过对基因组DNA的测序和分析，可以对基因的结构、功能和调控进行深入研究。
DNA 序列分析常用的技术包括Sanger测序、高通量测序、基因芯片等。
3.基因敲除和突变：通过基因敲除和突变技术，可以特异性地删除或改变目标基因，从而观察其对生物体性状和功能的影响。
常用的基因敲除和突变技术包括RNA干扰、CRISPR-Cas9系统等。
4.基因表达和调控：基因的表达和调控是生物体内基因功能发挥的关键环节。
基因工程可以通过改变基因的启动子、增强子等序列，实现对基因表达和调控的精确操控。
常用的基因表达和调控技术包括质粒转染、转基因技术等。
常用技术基因工程领域有多种常用技术，以下列举几个代表性的技术：1.质粒转染技术：质粒转染技术是一种常用的基因工程技术，通过将外源基因表达载体（质粒）导入宿主细胞，实现基因的表达和功能研究。
该技术广泛应用于基因治疗、农作物遗传改良、疫苗研发等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体中，实现特定性状的引入或改良。
转基因技术在农作物育种和药物研发中发挥了重要作用，成功开发出了多种转基因作物和转基因药物。
3.CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，具有高效、精确和可编程的特点。
基因克隆
基因克隆的方法基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA 技术。
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。
针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1当目的基因的序列完全已知时。
则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查找该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。
然后查找到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。
然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。
接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。
然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以找到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。
其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备※基本流程提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。
1）实验前准备预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。
2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。
（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。
（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。
分子生物学常用检测技术
分子生物学常用检测技术分子生物学是一门研究生物体内分子互动和功能的科学，其研究领域涵盖了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等。
这些领域的研究需要借助各种检测技术来实现，以下是几种常用的分子生物学检测技术。
1、基因测序技术：基因测序技术是测定DNA序列的技术，它可以直接读出基因序列，是分子生物学研究的重要工具。
基因测序技术可用于基因组学研究，解析物种的基因组结构和功能，也可以用于疾病的诊断和治疗。
2、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于快速、灵敏地扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
通过PCR，我们可以将微量的DNA片段进行数百万倍的扩增，从而可以进行后续的分析和检测。
PCR技术广泛应用于基因克隆、突变分析、疾病诊断等领域。
3、生物芯片技术：生物芯片是一种高密度DNA阵列技术，可以同时对大量基因进行检测和分析。
生物芯片技术可用于基因表达谱分析、基因多态性研究、疾病预测和诊断等。
4、质谱技术：质谱技术是一种用于分析生物样品中分子质量和组成的技术。
通过质谱技术，我们可以对蛋白质、多糖、脂质等生物分子进行定性和定量分析。
质谱技术广泛应用于蛋白质组学研究、药物发现、疾病诊断等领域。
5、细胞荧光染色技术：细胞荧光染色技术是一种用于观察细胞内生物分子活性的技术。
通过荧光染料对目标分子进行标记，我们可以在显微镜下观察到细胞内分子的分布和活性。
细胞荧光染色技术广泛应用于细胞信号转导、药物筛选等领域。
以上仅是分子生物学领域中的几种常用检测技术，实际上还有许多其他的实验技术和方法如核磁共振技术、双向电泳、免疫沉淀等等，这些技术的发明和发展都为分子生物学的研究提供了强有力的支持。
各种技术的选择和使用主要取决于研究目的和研究样本的类型。
随着科学技术的发展，未来的分子生物学检测技术将更加灵敏、高效和个性化。
分子生物学常用技术及其应用分子生物学是一门研究生物大分子结构和功能的科学，包括DNA、RNA 和蛋白质等。
基因克隆和表达的实验设计
基因克隆和表达的实验设计实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
材料与方法：实验材料克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not I仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管。
实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。
经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。
实验步骤1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。
分子生物学 基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
A
+GATCT
TCTAG
ALOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
LOGO
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
3’
3’
5’
上游引物、5’ 引物、Sense primer
PCR反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段，PCR反应 成功扩增的关键在于引物的正确设计。
引物设计的总原则——提高引物与模板结合的特异性。
LOGO
PCR引物设计的基本原则： 1.引物与模板的序列要紧密互补。 2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。 3.引物不能在模板的非目的位点引发PCR。
LOGO
分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术
1972年， 世界上第一个重组DNA分子诞生
1980年， 获诺贝尔化学奖
猿猴病毒DNA
噬菌体DNA
限制性内切酶
限制性内切酶
DNA连接酶 重组DNA分子
荧光蛋白基因的克隆和表达实验一
提示
质粒提取的菌种培养时间为16-18h 相关器材灭菌及使用器皿的清洁干净，不
确定是否干净的坚决不用 了解样品的保存方法，根据自己的需要进
行保存 EP管标识：样品名称、制备人、制备日期 实验过程中做到胆大心细，关键步骤不能
忽视
每组试剂配制量（3人一组）
LB培养液（100ml），共五瓶 (1L溶液中)：Tryptone(胰蛋白胨)：10g,
pET- 28a质粒
载体(Vector)： 要把一个有用
的外源基因通过 基因工程手段， 转化到细胞中去 外源基因进入受 体进行繁殖和表 达，需要运载工 具，携带细胞的 这种工具就叫载 体。
质粒pET-28a
pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统 之一。 目的基因被克隆到pET质粒载体上， 受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达 由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿 主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基 因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的 蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通 常可以占到细胞总蛋白的5们 三 人 在 发
科 学 家 下 村 修 、 美 国 科 学 家 马
日 ， 瑞 典 皇 家 科 学 院 宣 布 ，
2008 ·
现丁
和 研 究 绿 色 荧
沙 尔 菲 和 美
年 诺 贝 尔 化
什么是绿色荧光蛋白？
绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein，GFP）是 一类存在于包括水母、 水螅和珊瑚等腔肠动 物体内的生物发光蛋 白。当受到紫外或蓝 光激发时，GFP 发 射绿色荧光。
实验一 自主选择实验内容，预习准备，试剂配制 实验二 交实验计划报告及每次实验详细步骤，质
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用：PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。
（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。
应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。
（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
第六章克隆基因的表达ppt课件
起始密码子及其5端若干密码子的影响：
90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。
AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与 mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。
4. 生物体对密码子的偏爱性：
简并密码子使用频率在不同 不
同蛋白质翻译时不同，具有偏
➢外源基因密码子在大肠杆菌细胞中获得
最佳表达：
简单，便于基因操作和分析。
（2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应
表达载体， 目标基因表达水平高。
（3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 表达载体的必要元件 密码子 质粒拷贝数
3、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程
度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的
拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的效表达外源基因？ 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ 什么是包涵体？其形成机理是什么？ 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？
➢ DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型
染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。
➢同源重组有整合和交换两种形式，前者只
需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。
标记基因
目的基因
同源交换
标记基因
目的基因
三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因重组技术生产胰岛素
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA聚合酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。 2. 以操纵子为单位
很多功能上相关的基因前后相连成串， 由一个共同的控制区进行转录的控制。
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
（1）A链和B链分别表达法
化学合成:
A、B链的编
码序列
AApprr
ttaacc MMeett
--GGaall MMeett AApprr
AA oorrii ppeeppttiiddee
ttaacc MMeett
--GGaall MMeett
BB oorrii ppeeppttiiddee
七、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
1. 胰岛素的结构及其生物合成 2. 人胰岛素的生产方法 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程
菌的构建
1. 胰岛素的结构及其生物合成
N
信号肽
B 肽 信号肽酶C 肽
C
A肽
C 肽（31）
K R
SS
A 肽（21）
S
S
N
SS N
S S N
R R
C S S
B 肽（30） 高尔基体内的特异性肽酶
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
（2）人胰岛素原表达法
ttaacc MMeett
转化
--GGaall
AApprr
MMeett
BB ppeeppttiiddee
CC ppeeppttiiddee
AA ppeeppttiiddee oorrii
生物技术改良基因的关键技术方法
生物技术改良基因的关键技术方法基因改良是一种能够通过调整和修改生物体的基因组来改善其性状和特性的技术。
随着生物技术的发展，一系列关键技术方法被广泛应用于基因改良。
本文将介绍其中的几种重要技术方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是基因改良的关键方法之一。
通过基因克隆技术，可以获取特定目的基因的DNA片段，并进行进一步的研究和应用。
基因克隆的过程主要包括将目标基因从DNA源中提取，将其插入载体中，再将载体转化到宿主细胞中等。
最终通过筛选和鉴定，得到所需的基因克隆产物。
二、基因编辑技术基因编辑技术是近年来崭露头角的一种基因改良方法。
它通过对生物体中特定位点的基因进行精确的编辑和修饰，实现对遗传特性的准确改变。
基因编辑技术常用的工具包括CRISPR-Cas9系统和TALENs 等。
通过这些工具，可以实现基因的突变、插入或删除，从而改变生物的性状和特性。
三、转基因技术转基因技术是一种常用的基因改良方法，它将外源基因导入到目标生物的基因组中，使其表达并产生所需的性状或功能。
转基因技术的关键步骤包括筛选和获得目标基因、导入目标基因到宿主生物、确保目标基因在宿主生物中的稳定及高效表达。
转基因技术已经成功地应用于改良作物的抗病性、抗虫性以及增加产量等方面。
四、RNA干扰技术RNA干扰技术是一种基因沉默的方法，通过引导RNA分子识别和降解特定的RNA分子，从而抑制或阻断目标基因的表达。
RNA干扰技术可以通过转基因方式应用于生物体，也可以通过外源给予RNA分子进行基因沉默。
该技术在功能基因的研究以及病毒基因的治疗方面具有广泛的应用前景。
五、基因合成技术基因合成技术是一种通过化学方法合成指定序列的DNA片段的方法。
该技术可以用于合成目标基因的序列，进而进行基因改良的研究和应用。
基因合成技术可以人工合成大片段的基因，也可以合成人工序列的基因，从而为研究和改良基因提供了更大的灵活性和可操作性。
综上所述，基因改良的关键技术包括基因克隆技术、基因编辑技术、转基因技术、RNA干扰技术和基因合成技术等。
4 基因工程药物概述
4
1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组的 DNA分子 1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5质 粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒 DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同 时表现出两种抗性的细菌。 Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同 pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动 物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相 应的mRNA。
基因工程药物概述
1
名词解释：基因工程
基因工程是通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实 现遗传物质的重新组合，再借助病毒、细菌、质粒或 其他载体，将目的基因转移到新的宿主细胞系统，并 使目的基因在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的 技术。基因是DNA分子上的一个特定片断，因此基因 工程又称DNA分子水平上的生物工程，其主要研究任 务是有关基因的分离、合成、切割、重组、转移和表 达等。所以基因工程又称基因操作、基因克隆或DNA 重组等。
21
市场
欧美成熟市场占了71.4%，拉美及亚非市场虽然目前仅占 5.7%及12.7%，但其增长率分别为12.75和15%,远高于北 美1.9%的增长率。 IMS预测，药品支付者对医保体系的影响力更大，未来市 场增长的来源已经从欧美国家转移到新兴市场；在未来五 年内，新兴市场对利润的贡献将与与传统成熟市场平分秋 色。 制药业巨头已经在新兴市场投入多年，投资范围不仅限于 大家普遍看好的“金砖四国”（巴西，俄罗斯，印度，中 国），还进一步扩展到沙特阿拉伯、越南、智力、委内瑞 拉、马来西亚、泰国、土耳其和墨西哥等国家。
19
制药巨头的并购
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溶解包涵体 3.包涵体的复性 3.包涵体的复性 逐步降低变性剂浓度，使表达蛋白恢复其天然构型
27
二、真核生物表达体系
（一）酵母表达体系 （二）哺乳动物细胞表达体系 外源基因 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 信号 终止子
28
二、真核生物表达体系
（一）酵母表达体系 1.酵母表达载体 1.酵母表达载体 2.酵母表达外源性基因 2.酵母表达外源性基因 的形式
35
鼠成纤维细胞MOP 瞬时DEAE DEAE鼠成纤维细胞MOP 瞬时DEAE-葡聚糖 CHOCHO-DHFR 灵长/ 灵长/啮齿类 神经元细胞 稳定DHFR+转染 稳定DHFR+转染 DHFR+ 用氨甲喋呤扩增 痘病毒 EB病毒载体 EB病毒载体 HSV病毒载体 HSV病毒载体
二、真核生物表达体系
3
第一节 外源基因的表达
基因表达 遗传信息从DNA 遗传信息从 到蛋白质的传递 过程——中心法 过程——中心法 则（central dogma）。 ）。
4
第一节 外源基因的表达
克隆基因表达 外源基因在宿主细胞中表达。 外源基因在宿主细胞中表达。 外源基因 重组载体 表达载体 提取蛋白 宿主细胞： 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。 原核细胞或真核细胞。
30
二、真核生物表达体系
2.酵母表达外源性基因的形式 2.酵母表达外源性基因的形式 非分泌型 分泌型
分泌信号序列
31
酵母转化和表达的一般过程
Leu- 酵母 大肠杆菌
酶去壁 提取
原生质体
CaCl2、 PEG
感受态
转化
酵母载体
Leu营养缺 营养缺 陷型培养基 筛选
插入外源基因
转化子克隆生长
整合到染色体上或 独立在酵母细胞内
34
二、真核生物表达体系
2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式 2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式
细胞系 CVCV-1 CVCV-1/293 COS NIH3T3 DNA转染方式 DNA转染方式 SV40病毒感染 SV40病毒感染 腺病毒感染 瞬时DEAE瞬时DEAE-葡聚糖 DEAE 逆转录病毒感染 最初的应用 表达野生型、 表达野生型、突变蛋白 表达野生型、 表达野生型、突变蛋白 在哺乳类细胞中表达， 在哺乳类细胞中表达，快速鉴 cDNA克隆 表达突变蛋白。 克隆， 定cDNA克隆，表达突变蛋白。 转基因动物、 转基因动物、在不同类型细胞 中表达 快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋 快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋 cDNA 白 高效稳定表达 疫苗 克隆表达 基因转移
分离、 分离、 纯化
鉴定克隆
发酵表达
外源基因产物
32
二、真核生物表达体系
（二）哺乳动物细胞表达体系 1.哺乳动物细胞表达载体 1.哺乳动物细胞表达载体 2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式 2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式 3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统 3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统
12
一、原核生物表达体系
（三）真核生物基因在原核细胞中的表达 三 1.非融合型表达蛋白 1.非融合型表达蛋白 2.融合型表达蛋白 2.融合型表达蛋白 3.分泌型表达蛋白 3.分泌型表达蛋白
13
一、原核生物表达体系
（三）真核生物基因在原核细胞中的表达 1.非融合型表达蛋白 1.非融合型表达蛋白
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。 质融合在一起。 SD序列 ATG-外源基因-TAG
优点： 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋 白在结构、 白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致 缺点： 缺点：易被细菌蛋白酶破坏
14
一、原核生物表达体系
常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3 pKK223
• • • • •
抗氨苄青霉素基因 tac启动子(trp-lac) tac启动子(trp启动子(trp SD序列 SD序列 AUG起始密码 AUG起始密码 转录终止序列T1和 转录终止序列T1和T2 T1
20
21
一、原核生物表达体系
3.分泌型表达蛋白
载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在 分泌信号肽 一起，可被宿主菌分泌到细胞外。 一起，可被宿主菌分泌到细胞外。
pIN III系列载体 系列载体 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
29
二、真核生物表达体系
（一）酵母表达体系 1、酵母表达载体 选择性标志
大肠杆菌： 大肠杆菌： Ampr、Tetr 酵母： 酵母： Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
复制子 启动子 转录起始点上游， 上游活性序列 转录起始点上游，可促进转录 终止序列 信号肽序列、 蛋白结构域 如：信号肽序列、核定位序列
克隆基因的表达及基因干扰
北京协和医院检验科 吴洁
1
克隆基因的表达及基因干扰
第一节 外源基因的表达 第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定 表达产物的分离、 第三节 基因表达干扰技术
2
克隆基因的表达及基因干扰
第一节 外源基因的表达 第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定 表达产物的分离、 第三节 基因表达干扰技术
3、产物分离: 、产物分离
用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从 上切下来。 用凝血酶或 因子可以把外源蛋白从GST上切下来。 因子可以把外源蛋白从 上切下来 柱（column） GST 外源蛋白 ） 凝血酶 柱（column） GST ） 洗脱 柱（column） ） 可再利用
19
＋
外源蛋白
GST
His系统 系统 His-tag（组氨酸标签）： （组氨酸标签）：
24
1.包涵体的形成 1.包涵体的形成 表达产率过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积 聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。 原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子， 中间产物易大量积聚。 发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点
25
① 优点
有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、 有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、 免受蛋白酶降解、 免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞
33
二、真核生物表达体系
（二）哺乳动物细胞表达体系 1.哺乳动物细胞表达载体 1.哺乳动物细胞表达载体 (1)原核DNA序列 (1)原核DNA序列 原核DNA (2)启动子 (2)启动子 (3)增强子 (3)增强子 (4)剪接信号 (4)剪接信号 (5)遗传标记 (5)遗传标记 (6)终止信号和多聚腺苷化的信号 (6)终止信号和多聚腺苷化的信号
5
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
第一节 外源基因的表达
一、原核生物表达体系
大肠杆菌
二、真核生物表达体系 酵母， 酵母，哺乳动物细胞
6
一、原核生物表达体系
（一）对外源目的基因的要求 （二）原核表达载体具有的特点 （三）真核生物基因在原核细胞中的表达 （四）包涵体
7
一、原核生物表达体系
（一）对外源目的基因的要求 不应具有5 1、不应具有5´端非编码区以及内含子结构 不能直接用真核基因组DNA. 2、不能直接用真核基因组DNA. 扩增目的基因. 3、常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因. 常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因 cDNA为模板
15
一、原核生物表达体系
2.融合型表达蛋白 2.融合型表达蛋白
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋 白连接在一起的。 白连接在一起的。 优点： 优点： 具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。 具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。 便于融合蛋白的分离和纯化。 便于融合蛋白的分离和纯化。
3.哺乳动物细胞的瞬时表达 3.哺乳动物细胞的瞬时表达 和稳定表达系统 COS细胞瞬时表达系统 （1）COS细胞瞬时表达系统 CHO细胞稳定表达系统 （2）CHO细胞稳定表达系统
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COS细胞 细胞
用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株 病毒侵染的猴细胞株 用复制起点有缺陷的 CV-1得到的。所以称 得到的。 得到的 所以称COS（CV-1，Origin, SV40） （ ， ）
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一、原核生物表达体系
（四）包涵体 (inclusion body)
大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、 大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、 不溶性和无活性的蛋白质颗粒。 不溶性和无活性的蛋白质颗粒。
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一、原核生物表达体系
（四）包涵体 (inclusion body) 1.包涵体的形成 1.包涵体的形成 2.包涵体的分离与纯化 2.包涵体的分离与纯化 3.包涵体的复性 3.包涵体的复性
8
一、原核生物表达体系
（二）原核表达载体具有的特点
原核启动子 • 选择标志 • 启动子 ：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等 • 翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及 翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列) (SD序列 翻译起始点和终止序列 • 多克隆位点(MCS) 多克隆位点(MCS)
lacI tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
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GST系统 系统----pGEX系列 系统 系列
2、产物提纯: 、产物提纯
GST融合蛋白用 融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。 亲和层析柱分离纯化 融合蛋白用 亲和层析柱分离纯化。