慢病毒包装protocal

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慢病毒包装操作方案

v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

慢病毒包装操作方案

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。

慢病毒包装原理介绍定稿版

慢病毒包装原理介绍 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带 poly A 尾。

当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。

U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。

慢病毒包装及感染

Lentivirus package protocol and detect titer Material:Medium: DMEM contain 10% FBS; DMEM contain 20% FBS Transfect reagent: Lipofectamine 2000, store at 4℃Cell line: 293FtPlasmid: lentivirus vector PLVX-IRES-ZsGreen, lentivirus package plasmid pCMV-vsvg and pCMV-△8.9, store at -20℃Polybrene: 4mg/mL in stock at -20℃，as soon as you use it, please put it in 4℃。

293Ft cell culture and passage:1) Before you culture or passage the cell, you should warm the DMEM medium at 37;2) Passage 293Ft cell lines when the confluent reach 80%~100%. Descant the medium, use the 0.25% trypsin to digest the cell 1min, then dump out the trypsin, and continue digest approximately 1min used residual trypsin.3) Use 5mL pipette to blow the cells for several times, if there is cell mass, you can use 50 um cell strainers to remove the cell mass.4) The confluent of 293Ft cell will be 70-80% after 24hour. At the time, you can do transfection.Transfection:1) when the confluent reach 70-80%, you can prepare the transfection.2) Use opti-MEM to dilute plasmid and transfection Reagent, and the optimal ratio of this three plasmid (pCMV-VSVG:pCMV-△8.9: PLVX-IRES-ZsGreen) is 1:1:2. And dilution ratio and method please refer to Transfection Reagent instruction.4) 18 hours after transfect, change medium (DMEM contain 20% FBS).5) 60h after transfect, you can harvest lentivirus.6) Add 2 ml fresh medium (DMEM contain 10% FBS).7) 24h after you add medium (DMEM contain 10% FBS), you can harvest lentivirus again.8) spin the virus supernatant at 3000rpm for 15min, 4℃；9）Transfer the supernatant to new 15mL tube;10) Filter the virus using 0.45um Filter;11) If you use the virus in 1 week, you can stock the virus at 4℃.Note：If you did not infect the cell immediately, you can store the virus u at -80℃。

慢病毒包装操作说明

Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。

所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-X Vectors，Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T细胞。

用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。

所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。

包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。

1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞，添加10ml的生长培养基。

在37℃，5%CO2℃条件下过夜。

在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。

2.充分混均Xfect Polymer。

3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µl Xfect Reaction Buffer 592.5µl Xfect Reaction Buffer 36µl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：Xfect Polymer 不要在室温下搁置长于30min4.充分混均每个管5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。

慢病毒转染PROTOCOL

慢病毒转染PROTOCOL第一天病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。

加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。

在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。

注意：也可用其它型号培养板转导。

这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。

第二天准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。

移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。

注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。

Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。

过长时间暴露于Polybrene （> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。

在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。

培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。

轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。

病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。

注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。

反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。

注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。

此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。

注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。

第三天移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。

孵育细胞过夜。

第四天欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。

第五－六天及以后用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。

Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。

慢病毒包装步骤

慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。

轻柔混匀，室温孵育5min。

3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。

室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。

用含血清的培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。

37℃CO2孵箱中孵育过夜。

7、转染后48-72h收获含病毒的上清。

3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。

慢病毒载体构建 Protocol

慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。

下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。

2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。

3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。

4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。

5.限制性内切酶：用于DNA切割。

6.DNA连接酶：用于DNA连接。

7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

9.细胞培养基：用于细胞培养。

10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。

11.抗生素：用于防止细胞污染。

12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。

二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。

3.水浴锅：用于保温反应液。

4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5.细胞培养箱：用于细胞培养。

6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。

7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。

8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。

三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。

2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。

3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。

慢病毒包装protocal

慢病毒包装用于侵染Hela细胞和A549细胞用24孔板进行培养293FT细胞，每孔500μl培养液，用于包装慢病毒实验。

用6孔板培养Hela细胞和A549细胞，每孔2ml培养液，用于侵染实验。

包装对照质粒：表达GFP和RFP的PTK643空载体；包装样品质粒：PTk643-cc1各片段和PTk643-cc2各片段。

具体操作流程如下：（1）对用去内毒素试剂盒提过的质粒进行浓度测定，用于统一之后慢病毒包装中质粒的量。

（2）准备293FT细胞，按1：5接种于0.5ml DMEM（含10%FBS）的24孔板中，过夜培养到60%-80%细胞密度。

（3）准备DNA mixture。

按1ug PTK643-cc +0.7 ugΔNRF +0.5 ugVSVG计算相应的质粒体积。

将上述混合物加入50ulopti-MEM中，振荡并稍离心。

（4）准备PEI mixture。

融化PEI并稍离心，按60：500的比例将PEI加入到opti-MEM中，立即振荡并稍离心，静置5min。

（5）准备DNA/PEI混合液，将56ul的PEI混合物一滴滴加入到（3）中的DNA混合液中，振荡并稍离心。

室温孵育20-30min。

（6）从细胞培养皿中移去100ul培养液，之后加入上述DNA/PEI 混合液，同时左右摇摆盘子。

（7）37ºC培养过夜。

12小时后，换培养液（加入500ul DMEM （含10%FBS））。

（8）回收病毒上清。

转染分别在48和72小时后，回收病毒上清。

（可用0.45μm syringe filter millipore过滤回收病毒上清，本次不用）（9）将病毒上清分为300ul和200ul两份，立即进行侵染实验或于-80ºC保存。

（一份300ul侵染Hela细胞，用于后面的流式分析；另一份200ul用于跟踪观察细胞的形态。

）（10）侵染12小时后，换一次培养液。

培养48小时后，观察细胞，弱培养液变黄，则换培养液。

慢病毒包装手册2009

电话：传真： Email： RUGHU#LQRYRJHQFRP
6
病毒包装细胞 293T 的培养
活细胞计数
用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/ml (一般稀释倍数为 100 倍)，在 0.1ml 的细胞悬液中加入 0.1 ml 的 0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
细胞复苏
1．从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。 2．迅速放入盛有 37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。 3．用 70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加 3 ml 含 10% FBS
的 DMEM 培养基，置温箱培养。 4．次日更换一次培养液后再继续培养。
试剂
试剂名称
试剂来源
cat.No.
台盼兰胎牛血清 FBS DMSO
上海捷倍思基因技术有限公司上海微科生化试剂有限公司上海生物试剂厂
A11-102
DMEM 胰酶
GIBCO 上海化学试剂公司
12800-017
Lipofectamine 2000
Invitrogen
11668-500
仪器
仪器名称
荧光显微镜 CO2 培养箱生物安全柜 Plus-20 离心超滤装置
英茂盛业慢病毒载体图谱：
1) pLV 载体图谱：
以上载体为用于 RNA 干扰的 pLV穿梭载体，带有 GFP 标记。用于其他研究的 pLV
载体的框架与此基本相同。[具体结构请参考克隆构建部分]
地址：北京市海淀区温泉路45号
邮编：网址：http://ZZZLQRYRJHQFRP
电话：传真： Email： RUGHU#LQRYRJHQFRP

慢病毒包装实验流程介绍

慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装流程：
1、载体质粒与系统质粒共转染293T细胞。

2、收集48~72h的细胞上清液。

3、超速离心纯化浓缩。

4、纯化分装。

5、滴度检测。

慢病毒包装具体实验步骤如下：
一、质粒转染
1、转染前，依次准备好转染试剂、Opti-MEM培养基、目的质粒、骨架质粒、EP管。

2、然后，配置质粒和OMEM的混合液。

3、配置转染试剂和OMEM的混合液。

4、轻轻混匀，静置5min。

5、将配好的质粒与转染试剂混合后形成转染体系。

6、轻轻混匀，静置20min。

7、从培养箱中取出10cm培养皿，弃去培养液，更换为OMEM 培养液。

8、转染，轻轻混匀。

9、在培养皿盖上做好标记，放回培养箱继续培养。

10、转染后6-8h，更换为新鲜的DMEM培养基。

11、转染后次日，显微镜下观察转染效率。

12、转染后48h，收集上清液于干净的50ml离心管中。

13、加入新鲜的DMEM培养基，继续培养。

14、转染后72h，再次收集上清液。

二、浓缩纯化
1、将收集好的上清液离心，弃去细胞碎片。

2、用0.22μm滤膜过滤，分装到超速离心管中。

3、超速离心。

4、离心结束后，将所收获的病毒颗粒重新悬浮，于4℃冰箱中溶解，过夜。

5、次日，再次将溶解后的病毒过滤、分装、入库。

Lenti-Virus protocol 慢病毒包装

Lenti-Virus Protocol张端午A.For packing virus in 6-well plate:(if in 12-well plate, reduce all to 1/2)1.Mix the following plasmids in a 1.5 ml eppendorf tube,1.5 µg Lenti-vector + 1.5 µg packing plasmids = 3 µg total0.5:0.3:0.2 (pMDL =0.75 µg, VSV-G=0.45 µg, REV=0.3 µg)add 200 µl OPTI-MEM, mix well.2.Mix 7.5 µl LF2K in 200 µl OPTI-MEM, incubate for 5 min.3.Mix the LF2K mixture with plasmids mixture, incubate for 15-20 min.4.During the incubation time, trypsinize 293T:Add 1 ml 0.05% Trypsin & EDTA to a full 100 mm plate (~1.2-1.4 x 107 cells), Add 5 ml fresh medium to terminate reaction,Count cells and adjust to a concentration of 2x 106 cells / ml.5.Aliquot 1 ml cells to a well of 6-well plate (2x 106 cells / well), then add another1 ml medium.6.Add transfection mixture to the well, mix well, and move back to 37C incubatorquickly.7.8-12 h later, change medium (2 or 2.5 ml), and incubate for another 24-36 h.8.Harvest virus. (virus can be stored at 4C for one week, otherwise, aliquot virusand store at -80C for further use)B.Infection:9.Seed cells that need to be infected in a 12-well or 6-well plate. The bestconfluence is 40-70%, depending on the different applications.10.For 12-well plate: (if in 6-well plate, duplicate all)Infect mouse cells: 400-800 µl virus + 800-400 µl fresh medium =1.2 ml totalInfect human cells: 100-500 µl virus + 1100 µl-700 µl11.Add 8-10 µg/ml polybrene, spin for 30 min at 2500 rpm at 37C.12.12-24 h later, change medium.。

pLKO.1.PURO 慢病毒报装Protocols

Protocols > pLKO.1 ProtocolAddgene is a global, non-profit plasmid repository dedicated to making it easier forscientists to share.pLKO.1 –TRC Cloning VectorAddgene Plasmid 10878. Protocol Version 1.0. December 2006.Copyright Addgene 2006, All Rights Reserved. This protocol is provided for yourconvenience. See “warranty information” in appendix.Table of Contents• A. pLKO.1-TRC Cloning Vector• A.1 The RNAi Consortium• A.2 Map of pLKO.1• A.3 Related plasmids• B. Designing shRNA Oligos for pLKO.1• B.1 Determine the optimal 21-mer targets in your gene• B.2 Order oligos compatible with pLKO.1• C. Cloning shRNA oligos into pLKO.1• C.1 Recommended materials• C.2 Annealing oligos• C.3 Digesting pLKO.1 TRC-Cloning Vector• C.4 Ligating and transforming into bacteria• D. Screening for Inserts• D.1 Recommended materials• D.2 Screening for inserts• E. Producing Lentiviral Particles• E.1 Recommended materials• E.2 Protocol for producing lentiviral particles• F. Infecting Target Cells• F.1 Recommended materials• F.2 Determining the optimal puromycin concentration• F.3 Protocol for lentiviral infection and selection•G. Safety•H. References•H.1 Published articles•H.2 Web resources•I. Appendix•I.1 Sequence of pLKO.1 TRC-Cloning Vector•I.2 Recipes•I.3 Warranty informationBack to TopA. pLKO.1-TRC Cloning VectorA.1 The RNAi ConsortiumThe pLKO.1 cloning vector is the backbone upon which The RNAi Consortium has built a library of shRNAs directed against 15,000 human and 15,000 mouse genes. Addgene is working with the TRC to make this shRNA cloning vector available to the scientificcommunity. Please cite Moffat et al., Cell 2006 Mar; 124(6):1283-98('PubMed”:/pubmed/16564017?dopt=abstract) in allpublications arising from the use of this vector.A.2 Map of pLKO.1pLKO.1 is a replication-incompetent lentiviral vector chosen by the TRC for expression of shRNAs. pLKO.1 can be introduced into cells via direct transfection, or can be converted into lentiviral particles for subsequent infection of a target cell line. Once introduced, the puromycin resistance marker encoded in pLKO.1 allows for convenient stable selection.Figure 1 : Map of pLKO.1 containing an shRNA insert. The original pLKO.1-TRC cloning vector has a 1.9kb stuffer that is released by digestion with AgeI and EcoRI. shRNA oligos are cloned into the AgeI and EcoRI sites in place of the stuffer. The AgeI site is destroyed in most casesA.3 Related ProductsThe following plasmids available from Addgene are recommended for use in conjunction with the pLKO.1 TRC-cloning vector.pMD2.G Envelope plasmid for producing viral particles.Note: pLKO.1 can also be used with packaging plasmid pCMV-dR8.2 dvpr and envelopeplasmid pCMV-VSVG from Robert Weinberg’s lab. For more information, visitAddgene’s Mammalian RNAi Tools page.Several other laboratories have deposited pLKO derived vectors that may also be useful for your experiment. To see these vectors, visit Addgene’s website and “search for“pLKO”“.Back to TopB. Designing shRNA Oligos for pLKO.1B.1 Determining the Optimal 21-mer Targets in your GeneSelection of suitable 21-mer targets in your gene is the first step toward efficient genesilencing. Methods for target selection are continuously being improved. Below aresuggestions for target selection.1. Use an siRNA selection tool to determine a set of top-scoring targets for your gene. Forexample, the Whitehead Institute for Biomedical Research hosts an siRNA SelectionProgram that can be accessed after a free registration(/bioc/siRNAext/). If you have MacOS X, another excellent program is iRNAi, which is provided free by the company Mekentosj (/irnai/).A summary of guidelines for designing siRNAs with effective gene silencing is includedhere:•Starting at 25nt downstream of the start codon (ATG), search for 21nt sequences that match the pattern AA(N 19 ). If no suitable match is found, search for NAR(N 17 )YNN, where N isany nucleotide, R is a purine (A,G), and Y is a pyrimidine (C,U).•G-C content should be 36-52%.•Sense 3’ end should have low stability – at least one A or T between position 15-19.•Avoid targeting introns.•Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats, especially repeated Ts because polyT is a termination signal for RNA polymerase III.2. To minimize degradation of off-target mRNAs, use NCBI’s BLAST program. Selectsequences that have at least 3 nucleotide mismatches to all unrelated genes.Addgene recommends that you select multiple target sequences for each gene.Some sequences will be more effective than others. In addition, demonstrating that twodifferent shRNAs that target the same gene can produce the same phenotype willalleviate concerns about off-target effects.B.2 Ordering Oligos Compatible with pLKO.1To generate oligos for cloning into pLKO.1, insert your sense and antisense sequences from step B.1 into the oligos below. Do not change the ends; these bases are important for cloning the oligos into the pLKO.1 TRC-cloning vector.Forward oligo:5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG3’Reverse oligo:5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’For example, if the target sequence is (AA)TGCCTACGTTAAGCTATAC, the oligos would be:Forward oligo:5’CCGG AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT TTTTTG 3’Reverse oligo:5’AATTCAAAAA AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT 3’Back to TopC. Cloning Oligos into pLKO.1The pLKO.1-TRC cloning vector contains a 1.9kb stuffer that is released upon digestion with EcoRI and AgeI.The oligos from section B contain the shRNA sequence flanked by sequences that are compatible with the sticky ends of EcoRI and AgeI. Forward and reverse oligos are annealed and ligated into the pLKO.1 vector, producing a final plasmid that expresses the shRNA of interest.C.1 Recommended Materials5 μL Forward oligo5 μL Reverse oligo5 μL 10x NEB buffer 235 μL ddH2O2. Incubate for 4 minutes at 95°C in a PCR machine or in a beaker of boiling water.3. If using a PCR machine, incubate the sample at 70°C for 10 minutes then slowly cool to room temperature over the period of several hours. If using a beaker of water, remove the beaker from the flame, and allow the water to cool to room temperature. This will take a few hours, but it is important for the cooling to occur slowly for the oligos to anneal.C.3 Digesting pLKO.1 TRC Cloning Vector1. Digest pLKO.1 TRC-cloning vector with AgeI. Mix:6 μg pLKO.1 TRC-cloning vector (maxiprep or miniprep DNA)5 μL 10x NEB buffer 11 μL AgeIto 50 μL ddH2O> Incubate at 37°C for 2 hours.2. Purify with Qiaquick gel extraction kit. Elute in 30 μL of ddH2O.3. Digest eluate with EcoRI. Mix:30 μL pLKO.1 TRC-cloning vector digested with AgeI5 μL 10x NEB buffer for EcoRI1 μL EcoRI14 μL ddH2O> Incubate at 37°C for 2 hours.4. Run digested DNA on 0.8% low melting point agarose gel until you can distinctly see 2 bands, one 7kb and one 1.9kb. Cut out the 7kb band and place in a sterile microcentrifuge tube.When visualizing DNA fragments to be used for ligation, use only long-wavelength UV light. Short wavelength UV light will increase the chance of damaging the DNA.5. Purify the DNA using a Qiaquick gel extraction kit. Elute in 30 μL of ddH2O.6. Measure the DNA concentration.C.4 Ligating and Transforming into Bacteria1. Use your ligation method of choice. For a standard T4 ligation, mix:2 μL annealed oligo from step C.2.20 ng digested pLKO.1 TRC-cloning vector from step C.3. (If you were unable to measure the DNA concentration, use 1 μL)2 μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer1 μL NEB T4 DNA ligaseto 20 μL ddH2O> Incubate at 16°C for 4-20 hours.2. Transform 2 μL of ligation mix into 25 μL competent DH5 alpha cells, following manufacturer’s protocol. Plate on LB agar plates containing 100 μg/mL ampicillin or carbenicillin (an ampicillin analog).Back to TopD. Screening for InsertsYou may screen for plasmids that were successfully ligated by restriction enzyme digestion. However, once you have identified the positive clones, it is important to verify the insert by conducting a sequencing reaction.D.1 Recommended MaterialsDay 1:1. Innoculate 5 colonies from each ligation into LB + 100 μg/mL ampicillin or carbenicillin.Day 2:2. Spin down the cultures and use a miniprep kit to obtain DNA.3. Conduct a restriction digest with EcoRI and NcoI:• 1 μg miniprep DNA• 2 μL 10x NEB buffer for EcoRI•0.8 μL EcoRI•0.8 μL NcoI•to 20 μL ddH2O> Incubate at 37°C for 1-2 hours.4. Run the digestion products on a 1% agarose gel. You should see two fragments, a 2kb fragment and a 5kb fragment.5. Sequence positive clones with pLKO.1 sequencing primer(5’CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A 3’).You may need to adjust the sequencing conditions if the DNA polymerase has difficulty reading through the secondary structure of the hairpin sequence.Back to TopE. Producing Lentiviral ParticlesBefore this step, you must contact your institution’s Bio-Safety office to receive permission and institution-specific instructions. You must follow safety procedures and work in an environment (e.g. BL2+) suitable for handling HIV-derivative viruses.For transient knockdown of protein expression, you may transfect plasmid DNA directly into the target cells. The shRNA will be expressed, but the DNA is unlikely to be integrated into the host genome.For stable loss-of-function experiments, Addgene recommends that you generate lentiviral particles and infect the target cells. Addition of puromycin will allow you to select for cells that stably express your shRNA of interest.E.1 Recommended Materialsc. In polypropylene microfuge tubes (do NOT use polystyrene tubes), make a cocktail for each transfection:• 1 μg pLKO.1 shRNA plasmid•750 ng psPAX2 packaging plasmid•250 ng pMD2.G envelope plasmid•to 20 μl serum-free OPTI-MEMYou may want to vary the ratio of shRNA plasmid, packaging plasmid, and envelope plasmid to obtain the ratio that gives you the optimal viral production.d. Create a master mix of FuGENE® 6 transfection reagent in serum-free OPTI-MEM. Calculate the amount of Fugene® and OPTI-MEM necessary given that each reaction will require 6 μL FuGENE® + 74 μL OPTI-MEM. For example:•1x master mix: 6 μL FuGENE® + 74 μL OPTI-MEM•5x master mix: 30 μL FuGENE® + 370 μL OPTI-MEM•10x master mix: 60 μL FuGENE® + 740 μL OPTI-MEMIn a polypropylene tube, add OPTI-MEM first. Pipette FuGENE® directly intothe OPTI-MEM– do not allow FuGENE® to come in contact with the walls of thetube before it has been diluted. Mix by swirling or gently flicking the tube. Incubate for 5 minutes at room temperature.e. Add 80 μL of FuGENE® master mix to each tube from step c for a total volume of 100 μL. Pipette master mix directly into the liquid and not onto the walls of the tube. Mix by swirling or gently flicking the tube.f. Incubate for 20-30 minutes at room temperature.g. Retrieve HEK-293T cells from incubator. The cells should be 50-80% confluent and in DMEM that does not contain antibiotics.h. Without touching the sides of the dish, gently add DNA:FuGENE® mix dropwise to cells. Swirl to disperse mixture evenly. Do not pipette or swirl too vigorously, as you do not want to dislodge the cells from the plate.i. Incubate cells at 37°C, 5% CO2 for 12-15 hours.Day 3:j. In the morning, change the media to remove the transfection reagent. Replace with 5 mL fresh DMEM + 10% FBS + penicillin/streptomycin. Pipette the media onto the side of the plate so as not to disturb the transfected cells.k. Incubate cells at 37°C, 5% CO2 for 24 hours.Day 4:l. Harvest media from cells and transfer to a polypropylene storage tube. The media contains your lentiviral particles. Store at 4°C.m. Add 5 mL of fresh media containing antibiotics to the cells and incubate at 37°C, 5% CO2 for 24 hours.Day 5:n. Harvest media from cells and pool with media from Day 4. Spin media at 1,250 rpm for 5 minutes to pellet any HEK-293T cells that were inadvertently collected during harvesting.In lieu of centrifugation, you may filter the media through a 0.45 μm filter to remove the cells. Do not use a 0.2 μm filter, as this is likely to shear the envelope of your virus.o. Virus may be stored at 4°C for a few days, but should be frozen at -20°C or -80°C for long-term storage.Freeze/thaw cycles decrease the efficiency of the virus, so Addgene recommends that you use the virus immediately or aliquot the media into smaller tubes to prevent multiple freeze/thaw cycles.Back to TopF. Infecting Target CellsLentiviral particles can efficiently infect a broad range of cell types, including both dividing and non-dividing cells. Addition of puromycin will allow you to select for cells that are stably expressing your shRNA of interest.F.1. Recommended MaterialsDay 2:b. The target cells should be approximately 80-90% confluent.c. Dilute puromycin in the preferred culture media for your target cells. The final concentration of puromycin should be from 1-10 μg/mL in 1 μg/mL increments.d. Label plates from 1-10 and add appropriate puromycin-containing media to cells.Days 3+:e. Examine cells each day and change to fresh puromycin-containing media every other day.f. The minimum concentration of puromycin that results in complete cell death after 3-5 days is the concentration that should be used for selection in your experiments. (You may wish to repeat this titration with finer increments of puromycin to determine a more precise optimal puromycin concentration.)F.3. Protocol for Lentiviral Infection and SelectionDay 1:a. Plate target cells and incubate at 37°C, 5% CO2 overnight.Day 2:b. Target cells should be approximately 70% confluent. Change to fresh culture media containing 8 μg/mL polybrene.Polybrene increases the efficiency of viral infection. However, polybrene is toxic to some cell lines. In these cell lines, substitute protamine sulfate for polybrene.c. Add lentiviral particle solution from step E. For a 6 cm target plate, add between0.05-1 mL v irus (add ≥0.5 mL for a high MOI, and ≤0.1 mL for a low MOI). Scale the amount of virus added depending on the size of your target plate.MOI (multiplicity of infection) refers to the number of infecting viral particles per cell. Addgene recommends that you test a range of MOIs to determine the optimal MOI for infection and gene silencing in your target cell line.d. Incubate cells at 37°C, 5% CO2 overnight.Day 3:e. Change to fresh media 24 hours after infection.If viral toxicity is observed in your cell line, you may decrease the infection time to between 4 – 20 hours. Remove the virus-containing media and replace with fresh media. Do not add puromycin until at least 24 hours after infection to allow for sufficient expression of the puromycin resistance gene.f. To select for infected cells, add puromycin to the media at the concentration determined in step E.2.Addgene recommends that you maintain one uninfected plate of cells in parallel. This plate will serve as a positive control for the puromycin selection.Days 4+:g. Change to fresh puromycin-containing media as needed every few days.h. Assay infected cells. The following recommendations are guidelines for the number of days you should wait until harvesting your cells. However, you should optimize the time based on your cell line and assay:Assay Days post-infectionmRNA knockdown≥ 3 days(quantitative PCR)Protein knockdown (western blot) ≥ 4 daysPhenotypic assay ≥ 4 daysBack to TopG. SafetyBL2 safety practices should be followed when preparing and handling lentiviral particles. Personal protective clothing should be worn at all times. Use plastic pipettes in place of glass pipettes or needles. Liquid waste should be decontaminated with at least 10% bleach. Laboratory materials that come in contact with viral particles should be treated as biohazardous waste and autoclaved. Please follow all safety guidelines from your institution and from the CDC and NIH for work in a BL2 facility.If you have any questions about what safety practice to follow, please contact your institution’s safety office.To obtain the MSDS for this product, visit /sitemap and followthe MSDS link.Back to TopH. ReferencesH.1. Published ArticlesKhvorova A et. al. 2003. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115:209-216. (PubMed)Moffat J et. al. 2006. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell 124:1283-1298. (PubMed)Naldini L et. al. 1996. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272:263-267. (PubMed)Schwarz DS et. al. 2003. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115:199-208. (PubMed)Stewart SA et. al. 2003. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA 9(4):493-501. (PubMed)Zufferey R et. al. 1997. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol 15(9):871-5. (PubMed)Zufferey R et. al. 1998. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol 72(12):9873-80. (PubMed)H.2. Web resourcesAddgene’s mammalian RNAi website:/mammalianrnaiThe RNAi Consortium (TRC): /genome_bio/trc/rnai.htmlBackground on RNAimechanism: /focus/rnai/animations/animation/animation.htmWhitehead siRNA Selection Program: /bioc/siRNAext/Mekentosj iRNAi Program: /irnai/Back to TopI. AppendixI.1. Sequence of pLKO.1 TRC-Cloning VectorClick here to see the sequence of pLKO.1 TRC-cloning vector. The vector is 8901 base pairs total, and the stuffer insert is shown in all capital letters.I.2. RecipesLuria Broth Agar (LB agar) + antibioticPer 40 grams of powder from American Bioanalytical catalog # AB01200-02000, LB contains:10g tryptone5g yeast extract10g sodium chloride15g agar> Prepare LB agar solution by dissolving 40g of LB powder in 1L of distilled water. Autoclave and cool to 55°C. Add 1mL of 100mg/mL ampicillin or carbenicillin to obtain a final concentration of 100 μg/mL antibiotic. Pour plates and store at 4°C.Hexadimethrine Bromide (Polybrene)Prepare a 1mg/mL solution of polybrene (Sigma-Aldrich catalog #H9268) in 0.9% NaCl. Autoclave to sterilize. Stock solution is stable at 4°C for up to one year. The powder form of polybrene is stable at 4°C for several years.Protamine SulfateStore protamine sulfate (MP Biomedicals catalog #194729) at 4°C. Freely soluble in hot water and slightly soluble in cold water.PuromycinPrepare a 50mg/mL stock solution of puromycin (Sigma-Aldrich catalog #P8833) in distilled water. Sterilize by passing through a 0.22 μm filter. Store aliquots at -20°C.I.3. Warranty InformationAddgene is committed to providing scientists with high-quality goods and services. Addgene makes every effort to ensure the accuracy of its literature, but realizes that typographical or other errors may occur. Addgene makes no warranty of any kind regarding the contents of any literature. Literature are provided to you as a guide and on an “AS IS” “AS AVAILABLE” basis without warranty of any kind either expressed or implied, including but not limited to the implied warranties of fitness for a particular purpose, non-infringement, typicality, safety and accuracy.The distribution of any literature by Addgene is not meant to carry with it, and does not grant any license or rights of access or use to the materials described in the literature.The distribution of materials by Addgene is not meant to carry with it, and does not grant any license, express or implied, under any patent. All transfers of materials from Addgene to any party are governed by Addgene’s Terms of Use, Addgene’s Terms of Purchase, and applicable Material Transfer Agreements between the party that deposited the material at Addgene and the party receiving the material.。

又是辅助又是穿梭，慢病毒包装到底是个什么鬼？

又是辅助又是穿梭，慢病毒包装到底是个什么鬼？提起慢病毒包装，好多人只知道按着实验室protocol上写的质粒共转染293T细胞，或者只是知道穿梭质粒辅助质粒而不知道他们的具体作用。

今天我们就用最简单粗暴方式讲解一下病毒包装的原理，以防好奇的师弟师妹问你具体原理你只能让他们自己百度，错失一次完美的讲解(装逼)机会。

讲解之前我们要看下慢病毒到底是啥？官方解释：慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

简单点说就是HIV的升级版，HIV只能感染CD4+T细胞，对我们实验来说肯定不行，所以需要改装让病毒感染亲嗜性增强。

HIV还有一个有点就是可以将自己的基因组整合到宿主的基因组中，利用这个特性可以方便我们进行稳转细胞株的建立。

OK步入正题，讲解先从慢病毒的基因组入手，慢病毒为RNA病毒。

它的基因组我们可以分为3个编码病毒基本结构的结构基因gag、env、pol和6个调节基因tat、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu。

后来大家发现6个调节基因好像有点多，有的只对野生型的HIV 有用，所以就把调节基因除了tat和rev以外都删除了。

gag基因编码基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白，pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶，env基因编码病毒外面的衣壳蛋白gp120和gp41，调节基因tat和rev主要调节病毒的转录和翻译。

这六个基因对我们病毒包装来说必不可少。

另外大家可能注意到在基因组两端有两个LTR，这个LTR有两个作用，一方面他可以介导慢病毒将自己的基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点，另一方面可以粗暴的理解为启动子和终止子。

讲到这，大家可能对慢病毒的包装策略心里有点数了，如果我把LTR之间的替换为我们的目的基因，替换掉的部分又对病毒来说不可或缺，那我把替换掉的部分再通过别的方法提供给它，这样病毒不就可以完整的组装了吗。

慢病毒包装试剂盒说明书

YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。

（2）高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。

（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。

产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。

Tips :培养基里面不要添加抗生素。

2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。

3. 准备转染。

在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。

室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。

Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。

然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。

置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。

4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。

5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。

Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。

6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。

7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。

慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。

慢病毒(过表达)包装步骤

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36-48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。

⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系(48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系，可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

慢病毒包装protocol

包病毒***保护自己：保护黏膜：戴眼镜口罩手套。

（使用后的枪头以及各种与病毒接触过的废物泡一次84再仍，1片500ml,要提前泡）1种板子：细胞长到70-90%时，可进行计数。

然后种板子（每孔40-50%，一般下午种）2转染：2.1第二天上午进行转染：转染前2h换无血清培养基/换部分无血清培养基（4ml无血清1ml有血清培养基）。

2.2Lipo3000：I 分别用lipo3000和p3000加无血清培养基，II 病毒包装质粒装入离心管，将目的质粒加入离心管（有几个目的质粒准备几个离心管），混匀，静置5min后于I中液体混匀，静置15-20min。

III 加入孔中，摇匀。

（提质粒的倒数第二步，在超净台内静置5min晾干酒精，加入灭菌水后再离心。

提前高压一瓶水，分装与离心管中，用之前加热至70℃）2.36-8h/10-12h换液/加有血清培养基。

3收病毒：3.1转染后48±2h后收病毒（吸取上清，4°保存），加培养基。

3.272h后再次收病毒（这会一般细胞都长满了，从培养箱拿到细胞台要平稳，不然很容易飘起来，飘起来了就取上清后离心，再取上清）。

3.3两次的加到一起，使用滤膜过滤至无菌管（如果前一步细胞飘起来了就先离心后取上清，过滤，5ml/更小的注射器，45微米的滤膜）。

3.4分装后-80保存。

4转病毒：4.1T25（40-50%细胞），剩/吸完加1ml培养基，加2-3ml病毒（病毒与按比例polybrene混匀）。

4.212-16h后换液，48h后加入1微克/毫升的嘌呤霉素进行筛选，一般筛选2-3d即可（可传代后继续筛选，保证稳转），筛选时最好设置对照（对未转病毒的目的细胞进行嘌呤霉素筛选）。

PS：Lipo和PEI在293T细胞中效果一致。

PEI便宜。

6孔板：目的质粒加包装质粒3微克/孔lipo3000：3-5微升/孔。

提质粒后，换手套再进细胞房，酒精擦枪头及吸附柱等可能有大肠杆菌附着的物品。

[高等教育]慢病毒包装操作说明

所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-X Vectors，Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T细胞。

用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。

所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。

包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。

1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞，添加10ml的生长培养基。

在37℃，5%CO2℃条件下过夜。

在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。

2.充分混均Xfect Polymer。

基础医学研究protocol：慢病毒包装

一、puromycin杀伤曲线的制作1、12孔板中铺适量细胞（记住此时的细胞密度），每种细胞6孔2、文献查阅适宜该种细胞的puro浓度，再该值上下设定浓度梯度，通常以0.5或1为一个单位3、配制不同浓度的puro，加入细胞中，留1孔作为blank对照4、每2天更换一次培养基，并添加相应浓度的puro5、开始杀伤的第四天，观察细胞，以cell全部死亡的最低浓度作为病毒感染的puro杀伤浓度二、病毒包装：1、第一天：一盘长满的293T细胞1：3传代于10cm的平板，添加10mlDMEM培养基（10%FBS）传代后次日下午进行病毒包装，即为合适的细胞浓度2、第二天：准备转染复合物：总1ml体系复合物A：pLKO-Tet-On shRNA 20 µg (must be high purity, ≥0.5µg/ul)pLP1 6 µgpLP2 2 µgpLP/VSVG 2 µgCaCl2（2M）62.5μL加ddH2O补至500ul溶液B：2×HBSS 500ul3、用流式管加入B液并始终以合适的速度涡旋，同时缓慢加入复合物A，避免形成肉眼可见的颗粒。

沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。

在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。

4、在标准生长条件下培养12h-18h，除去培养液，加入7ml完全培养液培养细胞。

4、继转染后48h，收取上清，4度保存5、重新加入4ml 培养基，培养24h，收取上清6、1500rpm离心10min，取上清分装后存于-80（共10ml上清）三、病毒感染1、铺适量细胞（同制作杀伤曲线的细胞密度）于12孔板2、24h后细胞贴壁，更换全病毒的培养基，0.5ml病毒/孔（DMEM）或者0.3ml病毒+0.2ml medium/孔（1640）3、培养3天，待病毒表达后，加入最适浓度的puro进行杀伤，同时以一孔正常细胞作为对照。