幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达_纯化及免疫活性

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但与胃炎、胃溃疡及非溃疡性消化不良有关，而且与MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系，已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关致病菌［1－2］。

Hp感染的治疗多采用质子泵抑制剂外加两种抗生素的“三联”疗法，但存在诱导耐药菌株流行、药物副作用、费用较高和患者依从性差等问题［3－5］。

因此，接种Hp疫苗是预防和控制Hp感染更为有效的措施。

尿素酶是Hp在胃上皮定植和致病的先决条件之一。

尿素酶B亚单位（Ure B）具有免疫原性，在胃螺杆菌种中高度保守，是细菌定植所必须因子，因此其为Hp亚单位疫苗的最佳候选抗原［6］。

本研究在前期扩增了Hp儿童分离株UreB基础上［7］，在pGEX-4T-1载体表达、纯化重组Ure B蛋白，并鉴定其免疫原性和反应原性，为幽门螺杆菌口服疫苗的研制奠定基础。

1材料与方法1．1菌株及血清含Hp Ure B基因的重组表达质粒菌pGEX-4T-1-Ure／BL21由本实验室构建［7］；幽门螺杆菌患者（胃窦黏膜Hp培养阳性患者）血清由本实验室收集。

1．2试剂与仪器GST纯化试剂盒购自Clontech 公司、IPTG、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris碱、甘氨幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性周珍文关锐梨夏慧敏邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂摘要目的：在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B（UreB），纯化重组蛋白并分析其免疫活性。

方法：将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒，挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中，0．5mmoL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白的表达，使用纯化的重组蛋白免疫小鼠，ELISA检测血清抗体效价，并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性。

结果：SDS-PAGE示在约87kD相应分子量可见融合蛋白表达，产物主要在表达上清以可溶形式存在，纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答，ELISA检测特异性IgG效价为1∶51200，Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别。

结论：UreB在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物具有较好的免疫原性及反应原性。

关键词螺杆菌，幽门；尿素酶B；免疫活性Prokaryotic expression，purification and immunological activity of UreB of Helicobacter pylori isolated fromclinical specimens ZHOU Zhen-wen，GUAN Rui-li，XIA Hui-min，DENG Qiu-lian，XIE Yong-qiang，HUANGYong，LIAO Can，GONG Si-tang．Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Guangzhou510120，China 【Abstract】Objective To express Helicobacter pylori urease B（UreB）in E．coli BL21，and purify recombinant fusion protein and analyze its immunological activities．Methods Recombinant strain pGEX-4T-1-UreB／BL21was resuscitated，and0．5mmoL isopropyl thiogalactoside（IPTG）was used to induce recombinant Urebprotein expression．Balb／c mice were immunized with purified recombinant Ureb protein and the polyclonalantibodies were obtained．Antibody titer was measured by ELISA assay．The immunoreactivity of recombinant proteinwas identified by Western-blotting assay．Results The expressed product was about87kDa in size，and thefusion protein mainly exists in the medium supernatant．Specific humoral immune response could be induced bypurified protein，the specific IgG antibody titer was1∶51200．Western-blotting assay showed that the expressedrecombinant protein could be identified by serum from Helicobacter pylori infection patients．ConclusionRecombinant UreB protein was expressed in E．coli efficiently，and the expressed products showed good immunogenicityand immunoreactivity．【Key words】Helicobacter pylori；UreB；Immunological activitydoi：10．3969／j．issn．1006-5725.2010.20.005基金项目：国家自然科学基金（编号：30801054）；广东省自然科学基金（编号：8451012001001570）；广州市医药卫生科技基金（编号：2008-YB-067）；广州市妇女儿童医疗中心博士启动基金（编号：30307-3200818）作者单位：510120广州市妇女儿童医疗中心·基础研究·酸、PVDF膜、蛋白质分子量等购自鼎国公司。

胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid公司。

英国uvitec 公司GAS7508-T20凝胶成像分析系统；上海力申公司HF safe-1200型生物安全柜；德国Sorvall公司micro17R台式高速冷冻离心机。

1．3方法1．3．1pGEX-4T-1-Ure在大肠杆菌BL21／DE3的诱导表达将含有pGEX-4T-1-Ure的BL21／DE3工程菌从－70℃取出，接种于含氨苄青霉素（100μg／mL）的LB琼脂板，培养过夜后挑单菌落于LB 液体培养基中（含氨苄青霉素100μg／mL），37℃培养至OD6000．5左右，加IPTG至终浓度0．5mmol／L 30℃诱导表达5h，8000r／min4℃离心15min，收集菌体，SDS-PAGE电泳鉴定。

1．3．2菌体的裂解将250mL培养物的细菌沉淀悬于10mL的PBS。

－20℃冷冻30min，37℃放置20 min，反复冻融3次。

加入溶菌酶至终浓度1mg／mL，冰上30min。

按每克细菌加入20μL DNaseⅠ（1 mg／mL），搅匀后室温放置至裂解液不再粘稠。

将裂解液冰上超声破碎（160W，超声1s，停2s，超声2 min）。

8000r／min4℃离心15min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定。

1．3．3重组蛋白的亲和层析纯化使用PBS（pH 7．3）平衡Glutathione Sepharose4B亲和层析柱。

吸取样品（裂解上清液）注入柱内，流速0．2～1mL／min，10mL PBS洗涤后，用10mL洗脱缓冲液（50 mmol／L Tris-HCl、10mmol／L还原型谷胱甘肽pH 8．0）洗脱，分管收集洗脱液（1mL／管），SDS-PAGE 电泳鉴定。

并用Bradford法［8］以牛血清白蛋白为标准进行蛋白定量。

1．3．4多抗的制备及鉴定以100μg纯化的表达产物与等体积弗氏完全佐剂分别混匀，背部、足垫部位皮下注射免疫Balb／c小鼠；相同方法，间隔2周进行第2次加强免疫（以相同剂量加不完全弗氏完全佐剂）；间隔2周进行最后一次加强免疫（不加佐剂）。

末次免疫后1周采集血液，于血清中加入诱导表达的pGEX-4T-1／BL21产物超声裂解液，4℃吸附过夜。

ELISA检测血清效价。

1．3．5Western-blot分析将纯化的表达产物经SDS-PAGE后电转移至PVDF膜，使用幽门螺杆菌感染患者血清为一抗（1∶1000稀释），羊抗人IgG 为二抗行Western-blot鉴定。

2结果2．1pGEX-4T-1-Ure在大肠杆菌中的表达使用IPTG浓度从0．1mmol／L增至1．0mmol／L，对重组株进行诱导表达观察，当IPTG浓度增至0．5mmol／L，再增加IPTG浓度，重组蛋白表达比例未见明显变化，因此我们选用了0．5mmol／L IPTG浓度进行大量诱导表达。

表达产物SDS-PAGE显示，pGEX-4T-1-Ure转化菌经IPTG诱导的样品在相应分子量位置（87000左右）可见融合蛋白（图1箭头示），pGEX-4T-1-Ure转化菌未诱导样品没有相应条带出现，表明重组蛋白可诱导表达。

同时，pGEX-4T-1空质粒转化菌IPTG诱导的样品在26000处有GST26表达（图1，lane2）。

2．2重组蛋白的亲和层析纯化经谷胱甘肽柱纯化后，SDS-PAGE显示，在相应分子量位置可见与GST融合表达的重组蛋白。

融合蛋白经过凝血酶酶切后，获得了去除GST的纯化尿素酶蛋白1mL，蛋白浓度为1．8mg／mL。

2．3重组蛋白的活性鉴定重组尿素酶免疫小鼠，获得高滴度的特异性抗血清，使用纯化的重组尿素酶包被ELISA板，检测IgG抗体滴度为1∶51200，表明重组蛋白具免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度抗体。

用HP感染患者血清进行Western-blot分析，发现重组蛋白能被感染患者血清识别，重组蛋白具反应原性（图2）。

3讨论Hp全菌疫苗主要成分为菌体超声破碎物和甲醛灭活的全菌体。

Raghavan等［9］使用甲醛灭活后的HpSS1全菌体与黏膜免疫佐剂霍乱毒素（CT）免疫小鼠，发现其能有效抑制Hp感染并控制再次感染。

但是Hp全菌体粗制抗原成分复杂，存在副作用较大、免疫效果差、易通过交叉免疫反应导致自身免疫性疾病及肠道菌群失调、不易标准化等缺注：1，pGEX-4T-1-Ure／BL21uninduced；2，pGEX-4T-1／BL21induced；3，pGEX-4T-1-Ure／BL21induced；M，Protein marker图1重组蛋白表达产物SDS-PAGE电泳结果123M1057150352516点，不适用于人体接种。