小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

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小麦春化基因及其等位变异的研究

小麦春化基因及其等位变异的研究小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其产量和质量直接关系着全球粮食安全。

在小麦的生长发育过程中，春化是一个关键的生理过程，它决定了小麦在不同季节的生长和开花时间。

春化基因是春化过程中的关键调控因子，它们影响着小麦的生长发育和产量。

本文将介绍小麦春化基因及其等位变异的研究进展，探讨春化基因对小麦生长发育的影响，以及其在小麦育种中的应用前景。

一、小麦春化基因的发现与研究历程小麦春化基因的研究始于20世纪初，当时的科学家们发现在不同的小麦品种中，存在着春化时间的差异。

经过长期的研究，科学家们逐渐发现了控制小麦春化的关键基因，包括Vrn1、Vrn2、Vrn3等。

Vrn1基因编码了一个关键的转录因子，它能够调控小麦的花期和生长发育。

Vrn2基因编码了一个FT-like蛋白质，它在春化过程中发挥着重要作用。

Vrn3基因则编码了一个顶芽分化抑制蛋白质，它能够抑制小麦的生长发育。

这些基因共同参与了小麦的春化过程，决定了小麦的生长发育和产量特性。

二、小麦春化基因的等位变异及其与生长发育的关系随着现代分子生物学技术的进步，科学家们逐渐发现了小麦春化基因的等位变异与生长发育特性之间的关系。

在不同的小麦品种中，春化基因存在着丰富的等位变异，这些变异对小麦的生长发育和产量特性有着重要影响。

通过研究不同小麦品种中春化基因的等位变异，科学家们发现了一些关键的等位变异，它们影响着小麦的花期、抽穗时间、植株高度等重要农艺性状。

通过深入研究这些等位变异，科学家们逐渐揭示了小麦春化基因与生长发育特性之间的关系，这为小麦的育种改良提供了重要的理论依据。

三、春化基因在小麦育种中的应用前景小麦春化基因具有重要的育种应用前景，它能够为小麦的育种改良提供重要的遗传资源。

通过分子标记辅助育种技术，科学家们可以利用春化基因的等位变异进行精准的基因定位和分子标记筛选。

通过分子标记辅助选择，科学家们可以利用春化基因的等位变异进行小麦的育种改良，并培育出具有优异生长发育和产量特性的新品种。

小麦类甜蛋白TLP基因的克隆与原核表达的开题报告

小麦类甜蛋白TLP基因的克隆与原核表达的开题报告摘要：小麦类作物是我国重要的粮食作物之一，而甜蛋白则是小麦中的一种重要蛋白质，具有多种功能。

TLP（thionin-like protein）是一种基因家族，其编码的蛋白质构成了甜蛋白的一部分。

本研究旨在克隆小麦类作物中TLP基因，并利用原核表达技术进行初步功能研究。

通过基因克隆、限制酶切、DNA测序等方法，成功克隆了小麦类作物中TLP基因。

进一步将其构建到原核表达载体中，在大肠杆菌中进行表达，并分离与纯化得到了重组蛋白。

结果显示，重组蛋白具有一定的抗菌活性。

本研究结果有望为进一步探究小麦中TLP基因的功能和应用提供基础。

关键词：小麦；甜蛋白；TLP基因；克隆；原核表达。

一、研究背景小麦作为我国的主要粮食作物之一，对保障人民生活、推动经济发展、保护生态环境具有重要意义。

同时，小麦也是一种多营养植物，在其中含有多种营养物质，如淀粉、蛋白质、维生素等。

其中，甜蛋白是小麦中的一种重要蛋白质，具有多种生物学功能，如病原体防御、调节植株生长、诱导继代叶片脱落等（张丽丽等，2010）。

TLP是一种基因家族，编码的蛋白质是甜蛋白中的一部分，其结构与硫氰酸蒽酮类似，具有多种生物学活性，如抑制昆虫和微生物、调控植物生长和抗逆性等（Barthakur等，2008）。

TLP基因在小麦中广泛存在，但其功能尚未完全明确。

本研究旨在从小麦类作物中克隆TLP基因，并利用原核表达技术进行初步功能研究，为进一步探究TLP基因的功能和应用提供基础。

二、研究方法1. TLP基因的克隆从小麦中提取总RNA，用有生物体、多功能重复转录酶逆转录为其cDNA，用PCR扩增获得TLP基因的全长序列，并进行限制酶切、DNA测序验证。

2. TLP基因的原核表达将TLP基因片段构建到原核表达载体pET28a中，转化到大肠杆菌BL21中，经过诱导表达，再进行细胞裂解、离心、超声等处理，分离与纯化得到重组蛋白。

小麦耐热性鉴定及热激蛋白基因的克隆与表达分析的开题报告

小麦耐热性鉴定及热激蛋白基因的克隆与表达分析
的开题报告
一、研究背景
小麦是我国重要的粮食作物之一，但由于气候变化以及人类活动等因素，小麦种植地区温度逐渐升高，胁迫小麦的生长和产量。

小麦要适应高温胁迫，需要从生理和分子层面进行反应和调节，其中热激蛋白在这个过程中扮演着重要的角色。

因此，研究小麦的耐热性以及与之相关的热激蛋白基因是十分必要的。

二、研究目的
本研究的主要目的有以下两个方面：
1.通过小麦品种间的对比分析，筛选出耐热性较强的品种；
2.克隆小麦中参与耐热性的热激蛋白基因，分析其表达水平及调控机制。

三、研究内容与方法
1.小麦耐热性鉴定
将不同种植地区的小麦品种进行耐热性鉴定，通过叶片相对电导率和叶绿素荧光参数等生理指标对比分析，筛选出耐热性较强的品种。

2.基因克隆
从耐热性较强的小麦品种中提取总RNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术克隆出热激蛋白基因。

将克隆出的基因进行测序，进行进一步的生物信息学分析。

3.基因表达分析
通过qRT-PCR技术分析热激蛋白基因在不同小麦品种及不同的高温处理条件下的表达水平。

同时，采用亚细胞定位技术分析热激蛋白的分布情况，探究其调控机制。

四、预期结果
本研究将筛选出耐热性较强的小麦品种，探究热激蛋白在小麦耐热性中的调控机制，为小麦品种的选育以及提高小麦的耐热性提供理论基础和参考。

小麦抗病基因的发现和功能鉴定

小麦抗病基因的发现和功能鉴定小麦（Triticum aestivum）作为世界上最重要的粮食作物之一，被广泛种植和消费。

然而，小麦在种植过程中常常受到各种病害的威胁，如锈病、赤霉病和叶锈病等。

这些病害不仅会降低小麦的产量和质量，还会增加农民的经济负担。

因此，研究小麦的抗病基因并鉴定其功能，对于改良小麦品种，提高产量和抗病性具有重要意义。

小麦的抗病基因的发现，主要通过两种途径进行：遗传和分子生物学方法。

遗传方法是通过广泛的遗传材料的收集和分析，发现具有抗病性的小麦品种和同源物种。

这些小麦品种通常被称为抗病亲本，具有良好的抗病性和高产性。

抗病亲本经过杂交，可以转移到易感小麦品种中，从而提高其抗病性。

通过反复杂交选择和遗传分析，可以进一步筛选出抗病基因。

分子生物学方法是通过小麦基因组和蛋白质组的研究，来发现和鉴定抗病基因。

最近几十年来，小麦基因组学和功能基因组学的快速发展，为研究小麦抗病基因提供了强大的工具和技术支持。

利用分子标记技术和转录组学方法，可以对抗病基因进行定位和克隆。

例如，通过建立遗传图谱和关联分析，可以将抗病基因与特定的染色体区域相关联。

然后，利用克隆和序列技术，可以鉴定抗病基因编码的蛋白质和其相应的基因。

小麦抗病基因的功能鉴定是对抗病基因进行深入研究的过程。

功能鉴定的目的是确定抗病基因在小麦抗病性中的作用和机制。

针对特定的抗病基因，可以通过多种实验方法进行功能分析。

一种常用的方法是构建转基因小麦植株，即将抗病基因导入易感小麦品种中。

通过比较转基因和野生型小麦的抗病性差异，可以初步确定抗病基因的功能。

此外，还可以利用遗传转化和基因敲除技术，来研究抗病基因在小麦生长和发育过程中的作用。

另一种常用的方法是研究抗病基因的表达调控。

通过测定抗病基因在小麦不同组织和不同发育阶段的表达水平，可以揭示其调控模式和调控因子。

例如，利用实时荧光定量PCR技术，可以检测抗病基因在感病和抗病小麦中的相对表达水平。

小麦新品系的赤霉病抗性及分子标记分析王紫檀　李浩阳　赵文莎　宋鹏博　孙道杰_冯　毅　张玲丽

麦类作物学报　２０２３，４３（１０）：１２７３－１２８１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９１０４１．２０２３．１０．０７网络出版时间：２０２３０９２０网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０９１８．１６０１．００８小麦新品系的赤霉病抗性及分子标记分析王紫檀，李浩阳，赵文莎，宋鹏博，孙道杰，冯毅，张玲丽（西北农林科技大学农学院，陕西杨凌７１２１００）摘　要：为有效降低赤霉病对我国黄淮麦区小麦生产的影响，培育抗赤霉病小麦新品种，以自主创制的１３个抗赤霉病稳定的小麦新品系为材料，利用赤霉病菌地表接种和单花滴注法接种鉴定、分子标记检测等技术，鉴定其抗病性、主要农艺性状及赤霉病抗性相关的遗传基础。

结果表明：（１）品系Ｘｎ１２２和Ｘｎ１３２对赤霉病表现为抗，平均病小穗率为１１．５％和１３．４％，严重度为１．９；其余１１个品系表现中抗，平均病小穗率均小于３０％，严重度均小于３．０，其中４个品系（Ｘｎ１２２、Ｘｎ１０２、Ｘｎ１２３和Ｘｎ１２７）兼抗条锈病；（２）参试新品系的越冬抗寒性较好，株高较矮（６７～８２ｃｍ），穗较长（９．６～１１．３ｃｍ），千粒重高（３９．２～５０．２ｇ）；（３）１１个品系携带有苏麦３号的Ｆｈｂ１基因，部分品系兼具苏麦３号的Ｆｈｂ２、Ｆｈｂ５或犙犉犺狊．犮狉犮２ＤＬ位点的优异等位变异。

综上所述，参试部分品系不仅具有良好的赤霉病和条锈病抗性，其主要农艺性状基本满足黄淮南部麦区的主要育种目标要求，可作为小麦抗赤霉病改良的材料。

关键词：小麦；赤霉病；农艺性状；抗赤霉病基因／ＱＴＬ；分子标记中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０文献标识码：Ａ文章编号：１００９１０４１（２０２３）１０１２７３０９犚犲狊犻狊狋犪狀犮犲狋狅犉狌狊犪狉犻狌犿犎犲犪犱犅犾犻犵犺狋犪狀犱犕狅犾犲犮狌犾犪狉犕犪狉犽犲狉犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犖犲狑犠犺犲犪狋犔犻狀犲狊犠犃犖犌犣犻狋犪狀，犔犐犎犪狅狔犪狀犵，犣犎犃犗犠犲狀狊犺犪，犛犗犖犌犘犲狀犵犫狅，犛犝犖犇犪狅犼犻犲，犉犈犖犌犢犻，犣犎犃犖犌犔犻狀犵犾犻（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ（ＦＨＢ）ｏｎｗｈｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＹｅｌｌｏｗａｎｄＨｕａｉＲｉｖｅｒＶａｌｌｅｙｓＷｈｅａｔＺｏｎｅａｎｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗｗｈｅａｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＦＨＢ，ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｕｓｅｄ１３ｌｏｃａｌｌｙｂｒｅｄｗｈｅａｔｌｉｎｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦＨＢａｓｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅｉｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｄｉｓｅａｓｅ，ｍａｉｎａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦＨＢｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｕｓｅｏｆｓｕｒｆａｃｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｎｄｓｉｎｇｌｅｆｌｏｗｅｒｄｒｉｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｏｔｈｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌｅｖｅｌｏｆｌｉｎｅｓＸｎ１２２ａｎｄＸｎ１３２ｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦＨＢ，ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅｄｓｐｉｋｅｌｅｔｒａｔｅｏｆ１２．４％ａｎｄａｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆ１．９．Ｔｈｅｏｔｈｅｒ１１ｌｉｎｅｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｍｏｄｅｒａｔｅｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅａｖｅｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅｄｓｐｉｋｅｌｅｔｒａｔｅｏｆｌｅｓｓｔｈａｎ３０％ａｎｄｔｈｅｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｌｅｓｓｔｈａｎ３．０．ＦｏｕｒｌｉｎｅｓＸｎ１２２，Ｘｎ１０２，Ｘｎ１２３ａｎｄＸｎ１２７ｗｅｒｅａｌｓｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｓｔｒｉｐｅｒｕｓｔ．Ｔｈｅｔｅｓｔｅｄｌｉｎｅｓｈａｄｂｅｔｔｅｒｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｌｏｗｅｒｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ，ｌｏｎｇｅｒｐａｎｉｃｌｅ，ａｎｄｈｉｇｈｅｒ１０００ｇｒａｉｎｗｅｉｇｈｔ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ１１ｏｆｔｈｅｌｉｎｅｓｃａｒｒｙｉｎｇｔｈｅＦｈｂ１ｇｅｎｅｌｏｃｕｓｏｆＳｕｍａｉ３，ａｎｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅｌｉｎｅｓｈａｄｅｘｃｅｌｌｅｎｔａｌｌｅｌｅｓｏｆｔｈｅＦｈｂ２，Ｆｈｂ５ｏｒ犙犉犺狊．犮狉犮２ＤＬｍａｒｋｅｒｌｏｃｕｓｏｆＳｕｍａｉ３．Ｔａｋｅｎｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｗｅｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｓｏｍｅｏｆｔｈｅｔｅｓｔｅｄｌｉｎｅｓｎｏｔｏｎｌｙｈａｄｇｏｏｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦＨＢａｎｄｓｔｒｉｐｅｒｕｓｔ，ｂｕｔａｌｓｏｂａｓｉｃａｌｌｙｍｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｍａｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｉｎｔｈｅｓｏｕｔｈｅｒｎｗｈｅａｔａｒｅａｏｆＨｕａｉＲｉｖｅｒＶａｌｌｅｙｓｉｎｔｈｅｉｒｍａｉｎａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒ收稿日期：２０２２１２１２修回日期：２０２３０１３１基金项目：陕西省重点研发计划项目（２０２２ＮＹ１７７）；杨凌种业创新中心重点研发项目（Ｙｌｚｙｘｍ０４）第一作者Ｅｍａｉｌ：Ｗｚｔ１３８３６８６７８４０＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：张玲丽（Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｎｇｌｉ＠１２６．ｃｏｍ）Copyright©博看网. All Rights Reserved.ｆｕｒｔｈｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｌｉｔｅｗｈｅａｔｌｉｎｅｓ．犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｗｈｅａｔ；Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ；Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓ；ＦＨＢｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ／ＱＴＬ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ小麦赤霉病（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ，ＦＨＢ）是由禾谷镰孢菌（犉狌狊犪狉犻狌犿犵狉犪犿犻狀犲犪狉狌犿Ｓｃｈｗ．）等引起的一种真菌病害。

成功克隆小麦抗赤霉病关键基因

成功克隆小麦抗赤霉病关键基因作者：何瑞锋来源：《粮食科技与经济》2019年第07期小麦赤霉病是由真菌镰刀菌引起的最具毁灭性的世界性小麦病害，堪称小麦“癌症”。

小麦赤霉病的发生不仅导致严重的产量损失，还严重影响籽粒品质和食品安全，至今仍未得到有效解决。

多年来，科学家一直在探索如何战胜小麦赤霉病的武器。

近日，南京农业大学教授马正强团队研究宣布发现了小麦中一個极为重要的抗赤霉病基因Fhb1，为进一步揭示小麦抗赤霉病的分子机制奠定了重要基础。

Fhb1基因的克隆也将大大提高小麦抗赤霉病育种效率，为我国和世界小麦生产和食品安全提供保障。

该研究以我国长江中下游的抗病优异小麦品种“望水白”和“苏麦3号”为研究材料，通过图位克隆的方式，找到了抵抗小麦“癌症”的关键基因Fhb1。

研究发现，该基因编码一个注释为富含组氨酸的钙离子结合蛋白（His）。

植物His同源基因的编码产物氨基端（N-端）序列和整个蛋白结构高度保守;在六倍体普通小麦中，His基因的Fhb1变异赋予了小麦赤霉病抗性。

马正强团队分析了643份普通小麦品种中Fhb1基因对应染色体区段的遗传变异，发现Fhb1基因很可能起源于我国长江中下游地区，是我国特有的优异小麦基因资源。

该区域历来是赤霉病流行和暴发的区域，强大的选择压提供了抗赤霉病自然突变被保留下来的条件。

Fhb1基因不仅可以提高小麦对赤霉病的抗性，在其他植物中利用该基因也有可能提高抗病能力。

Fhb1小麦中目前已知的最重要抗赤霉病QTL，具有最强的抗扩展效应，还可降低籽粒中真菌毒素的积累。

通过分子标记辅助选择的方法将Fhb1导入到来自江苏、山东、河南、四川等省的中感或高感赤霉病小麦品种中，抗赤霉病扩展能力的提高幅度能达到76%。

小麦抗病基因的克隆心得体会

小麦抗病基因的克隆心得体会
根据抗病基因的保守域设计了3对引物，从普通小麦—簇毛麦
6VS异代换系H1-2-8分离6VS端体，PCR扩增获得8类片段；以簇毛麦基因组DNA为模板扩增出12类片段。

经巢式PCR和RFLP分析，来自6VS的8类克隆在抗、感病植株之间无差异；从簇毛麦基因组中得到了3个在抗、感植株之间存在差异的序列(RH42、RH55和RH66)；
从簇毛麦基因组中获得的RGA6具有NBS保守域，长度为504bp，与
拟南芥抗病基因RPM1和RPP13、小麦抗病基因LRR19以及番茄抗病
基因I2C-l有较高的同源性。

以RGA6为探针，筛选用抗白粉病小麦—簇毛麦易位系Pm97034构建的cDNA文库，得到了4个阳性克隆。

R3-2-2与动植物的亚硫酸氧化酶(sulfite oxidase，SO)有60～90％的同源性，长度为647bp，编码140个氨基酸，具有开放阅读框并含有保守域Moco-dimer。

R6-2-2与真核生物的VDAC(voltage-dep 通过基因工程技术将抗性基因转入植物受体中,是创新种质资源、培育抗病抗逆新品种的有效途径。

植物表达载体直接关系到外源基因的转化效率、遗传稳定性和表达情况,同时也与转基因植物的安全性
等问题密切相关,因此,表达载体的构建在植物基因工程研究中占据
重要地位,是获得有应用价值转基因植株的基础。

本研究克隆了大量
不同来源和作用机理的抗病抗逆相关基因,如抗穗发芽基因、不同的
赤霉病菌特异抗体与抗菌肽或脱毒蛋白构建的融合蛋白抗病脱毒基
因等,分别构建到小麦和拟南芥的遗传转化载体,为进一步研究这些
基因的功能和创造新的抗性种质资源奠定了基础。

小麦TaTVP1_基因的克隆与表达分析

小麦TaTVP 1基因的克隆与表达分析马燕斌1,李换丽1,文晋1,王霞2,周仙婷1,王新胜1(1.山西农业大学/山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;2.运城学院,山西运城044000)摘要㊀[目的]发掘并研究小麦TaTVP 1基因响应耐盐㊁耐旱等非生物胁迫的功能与机制,为小麦抗逆育种提供新的基因资源㊂[方法]利用PCR 技术克隆小麦TVP 1基因,扩增获得cDNA 全长序列,并对其进行生物信息学分析,进一步利用qRT -PCR 技术分析其表达模式㊂[结果]小麦TVP 1基因全长2289bp ,编码762个氨基酸;其氨基酸序列具有12个跨膜结构,该结构中疏水氨基酸具有高度保守性,且肽链N 末端与C 末端均位于膜外,预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D 结构蛋白,推测与其具有的H +离子泵通道功能密切相关;系统发育树分析表明,TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高,该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR 分析表明,小麦中TVP 1基因在根㊁茎中的表达量要明显高于叶㊁穗中,具有组织特异性,且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异,这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关㊂[结论]克隆并分析了小麦TaTVP 1基因,为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础㊂关键词㊀小麦;TVP 1基因;生物信息分析;表达模式分析中图分类号㊀S 512.1㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀0517-6611(2023)17-0087-05doi :10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.019㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID):Cloning and Expression Analysis of TaTVP 1Gene in WheatMA Yan-bin ,LI Huan-li ,WEN Jin et al㊀(Shanxi Agriculture University /Institute of Cotton Research,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Yuncheng,Shanxi 044000)Abstract ㊀[Objective]To explore and investigate the functions and mechanism of TaTVP 1genes in wheat in response to abiotic stresses such as salt,drought tolerance,and provide a new genetic resources for wheat stress resistance breeding.[Method]In this study,we cloned the wheat TVP 1gene by PCR,amplified the full-length cDNA sequence,and performed the bioinformatic analysis,and further analyzed the ex-pression pattern by qRT-PCR.[Result]TVP 1gene in wheat is 2289bp and encodes 762amino acids which containing 12transmembrane structures,in these structures,hydrophobic amino acids are highly conserved,and both the peptide chain N and C terminal are located outside the membrane,it is predicted that the transmembrane structure could form a high-level 3D structure protein with obvious pore,which may be closely related to its H +pump channel function;phylogenetic tree analysis indicates high homology of TaTVP 1to monocot TVP 1proteins,and two distinct groups I and II could be classified between monocotyledons and dicotyledons during the evolution of the type of TVP 1genes;quanti-tative PCR analysis showed that the expression of TVP 1gene in roots and stems was significantly higher than that in leaves and ears,with tis-sue specificity,and the expression trend of this gene in the same tissue was also different between different materials,this may be related to the difference in drought resistance and other stress resistance among different materials.[Conclusion]In this study,the TaTVP 1gene was cloned and analyzed,which laid a foundation for further clarifying the mechanism of this gene involved in protection against abiotic stresses.Key words ㊀Triticum aestivum ;TVP 1gene;Bioinformatic analysis;Expression pattern analysis基金项目㊀山西省应用基础研究面上项目(202103021224145);山西省农业科学院农业科技创新研究课题(YGJPY2007);运城市科技局项目(YCKJ -2021023)㊂作者简介㊀马燕斌(1978 ),男,山西清徐人,副研究员,博士,从事作物分子遗传育种研究㊂收稿日期㊀2023-03-21㊀㊀土壤盐碱化等非生物胁迫是导致小麦等农作物减产的主要因素之一,土壤中过高的钠离子浓度会破坏胞内的离子平衡,造成作物体内的代谢途径紊乱,从而抑制其生长㊂为降低盐碱逆境对农作物产量的影响,除改良土壤外,培育耐盐碱农作物品种也可有效抵御土壤盐碱化等不利影响,进而在一定程度上稳定农作物产量㊂多年来,传统遗传育种与分子改良相结合极大地促进了研究人员选育具有耐盐碱㊁耐旱等特性种质资源的效率[1-2]㊂近年来,作物中多种耐旱㊁耐盐碱的基因被克隆鉴定并证实有助于改良作物的耐逆特性㊂H +转运无机焦磷酸酶(H +-PPase,TVP)是一种广泛存在于生物体内的H +转运酶,可作为调解细胞酸度的质子泵,驱动各种离子在液泡内的区隔化,同时也参与了调解植物生长素的运输,在植物环境耐受性㊁生长发育过程中都可能起到了作用[3]㊂有报道称,大豆GmVP 1基因能提高转基因大豆发状根在一定条件下对盐胁迫的反应[4];TPSP 融合基因在小麦中的表达可表现出较强的耐旱性[5];烟草中敲除NtMYB 68转录因子能改善烟叶中紫黄质的堆积,促进脱落酸的合成,从而改善烟株的抗旱性[6];拟南芥中过表达白菜Bp -NFYA 5㊁番茄sly -miR 397基因可以提高其干旱耐受性[7-8];外源基因玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的过表达,可使玉米耐旱性增强[9];GhPNP 1可通过cGMP 信号途径正向调解棉花对干旱的耐受性[10];大豆中的BADH 基因也表现出较强的抗旱性[11];此外,植物耐旱密切相关的还有DREB 类等基因[12-13];细胞质膜蛋白SOS1和液泡膜蛋白NHX 协同作用,使胞质内维持低浓度盐离子,从而提高了植物的抗盐性[14-16]㊂综上所述,各类不同基因的研究极大地丰富了耐旱㊁盐碱基因研究的理论基础,同时也说明作物耐旱㊁盐碱机理可能具有更复杂的多途径调控网络㊂因此,还需对植物的耐盐㊁耐旱性进一步探索,从更多的抗逆性作物着手,挖掘更多相关基因,从细胞㊁组织和整体水平上阐释植物耐干旱㊁盐胁迫的信号调控机制,进而为作物的遗传改良奠定基础㊂现有的研究已有很多关注小麦抗逆材料的创制及其分子机制的解析,笔者以小麦耐旱品种晋麦47和舜麦1718为材料,对其TVP 1基因进行克隆鉴定,并利用生物信息学对该蛋白进行理化性质㊁跨膜结构㊁保守安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(17):87-91㊀㊀㊀结构域和发育进化等方面进行分析,旨在为进一步研究该基因的功能与机理打下基础,同时也为利用该类基因进行植物耐逆优良种质选育提供科学参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料㊀供试材料晋麦47(JM47)㊁舜麦1718 (SM1718)均为山西省农业科学院棉花研究所国审品种,种植于山西省农业科学院棉花研究所试验田㊂1.2㊀材料处理㊀将晋麦47(JM47)㊁舜麦1718(SM1718)2种品种小麦籽粒浸泡在经过高压灭菌的蒸馏水中,过夜萌发,次日挑选生长状态一致饱满的种子,播种于土壤条件相同的花盆中,在22ħ恒温培养箱中进行培养,长日照7d,取苗样液氮速冻,于-80ħ保存,供DNA提取之用㊂小麦在温室盆栽中生长至幼穗阶段时,取根㊁茎㊁叶㊁穗4个组织样品于无RNA酶离心管中,液氮速冻以备RNA提取㊂1.3㊀总DNA提取、RNA提取和cDNA制备㊀DNA按照GENEOUTTM Plant DNA Isolation Kit(LABGENE,上海)试剂盒的说明书进行提取,-20ħ保存㊂小麦材料及其不同组织样品在液氮低温下冷冻磨成样品,分别称取约0.1g样品粉末,加入Trizol试剂(Invitrogen,USA)进行RNA提取,整个试验过程严格按照操作要求进行,避免RNase污染㊂利用分光光度计测定各样品RNA浓度㊁纯度后,以RNA为模板,参考RNA反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription Mix, Oligo(dT)(Promega,上海)说明书,合成cDNA第1链,于-20ħ冰箱保存㊂1.4㊀TaTVP1基因的克隆㊀从NCBI数据库下载TaTVP1 (AY296911.1)基因CDS序列,利用Primer Premier6.0软件根据该基因保守序列设计克隆特异性引物,引物由北京奥科生物科技公司合成,序列分别为TaTVP1-F:5ᶄ-CATG-GCGATCCTCGGG-3ᶄ,TaTVP1-R:5ᶄ-CTAGATGTACTTGAAC -3ᶄ㊂以晋麦47和舜麦1718幼苗的cDNA分别为模板,利用Ex Taq酶(Takara,上海)扩增TaTVP1基因的全长序列㊂反应条件为:94ħ预变性4min,94ħ变性40s,60ħ退火40s, 72ħ延伸2min,终延伸10min,30个循环㊂PCR产物经浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测,按照DNA纯化回收试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)说明书回收片段,进行克隆㊂1.5㊀蛋白结构分析㊀利用SOSUI软件预测分析TaTVP1蛋白的跨膜结构域;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel. /interactive)对TaTVP1蛋白的三维结构进行在线预测㊂1.6㊀进化关系分析㊀从NCBI网站blastp分析并下载与TaTVP1氨基酸序列同源性较高的其他物种的氨基酸序列,利用Clustal工具进行多序列比对,MEGA5.0软件分析进化关系,利用Neighbor-Joining算法构建进化树,Bootstrap分析1000次㊂1.7㊀TaTVP1基因的组织表达分析㊀利用Beacon Designer 软件,参照TaTVP1基因序列,选择基因保守区设计特异性的荧光定量引物,内参基因为小麦Actin基因引物(表1)㊂按照SYBR Premix Ex Taq TMⅢ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)说明书,采用Applied Biosystems Step OnePlusTM仪扩增, PCR体系25μL,扩增程序为:95ħ预变性4min,95ħ变性5s,60ħ退火20s,72ħ延伸10s,循环40次㊂设置3次重复㊂数据处理采用2-ΔΔCt法计算相对表达量㊂表1㊀定量PCR分析使用引物序列Table1㊀The sequence of primers used for real-time PCR引物Primers序列Sequences(5ᶄ 3ᶄ)预期大小Expected sizeʊbp TaActin-F GGTGATGAGGCGCAGTCCAAG386 TaActin-R CGACCAGCGAGATCCAAACGATaTVP-F TCAGACTGCCACAAGGC160 TaTVP-R CTAGATGTACTTGAAC2㊀结果与分析2.1㊀TaTVP1基因全长的克隆㊀以晋麦47(JM47)㊁舜麦1718(SM1718)的cDNA为模板,扩增克隆均得到全长2000余bp的TaTVP1基因片段(图1),纯化回收产物,连接克隆载体pMD19-T转化至Trans-T1感受态细胞,随机挑取长势较好的菌落,经菌液PCR检测,筛选出阳性克隆,送至北京奥科生物科技公司测序㊂结果显示,TaTVP1基因序列全长2289bp,推测编码762个氨基酸㊂注:M.5000DNA Marker;1.晋麦47材料扩增的TaTVP1片段;2.舜麦1718扩增的TaTVP1片段㊂Note:M.5000DNA Marker;1:TaTVP1amplified fragment from JM47;2.TaTVP1amplified fragment from SM1718.图1㊀TaTVP1基因的PCR扩增Fig.1㊀PCR amplification of TaTVP1gene2.2㊀小麦TaTVP1的系统进化树分析㊀通过NCBI网站中blastp在线工具对TaTVP1氨基酸序列进行同源性搜索,选取相似性较高的多个作物TVP1氨基酸序列与TaTVP1进行比较分析,利用MEGA软件构建系统进化树,结果显示(图2),各作物TVP1蛋白在进化中分化成两大类,一类是大豆㊁拟南芥㊁棉花㊁烟草聚为一簇的双子叶植物TVP1Ⅰ类;另一类是小麦㊁玉米㊁水稻㊁青稞㊁大麦草TVP1聚为一簇的Ⅱ类,其中小麦TVP1蛋白与水稻㊁玉米等禾本科单子叶植物TVP1蛋白的遗传距离最近㊂这说明TVP1蛋白在单双子叶植物中的遗传分化明显㊂88㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年注:作物分别为拟南芥(AB015138)㊁油菜(JN940184㊁JN940185)㊁大豆(AK286008)㊁棉花(HM370494)㊁烟草(DQ630713)㊁甜菜(L32792)㊁番茄(AB300442)㊁葡萄(AJ5572565)㊁短芒大麦草(AY255181)㊁青稞(AB032839)㊁玉米(NM001111910㊁BT066389)㊁水稻(D45384)㊁小麦(AAP55210)㊂Note:The crops are Arabidopsis (AB015138),Rape (JN940184,JN940185),Cotton (HM370494),Soybean(AK286008),Tobacco (DQ630713),Sugar beet (L32792),Tomato (AB300442),Grape(AJ5572565),Short awn barley grass(AY255181),Highland bar-ley(AB032839),Corn(NM001111910,BT066389),Rice(D45384),Wheat(AAP55210).图2㊀小麦TaTVP1与其他植物TVP1的系统进化树分析Fig.2㊀Phylogenetic tree of predicted a mino acid sequences fromwheat TaTVP1and other plant TVP12.3㊀TaTVP1蛋白的跨膜结构预测分析㊀利用SOSUI 软件对TaTVP1蛋白进行跨膜结构预测分析,表明TaTVP1蛋白的氨基酸序列包含12个疏水跨膜结构域(图3)㊂亚结构域分析显示,小麦TVP1蛋白分为2个独立的结构,一个是N 端,包含4个疏水的跨膜区域,另一端是C 端,包含8个疏水跨膜区域,其多肽链的N 端和C 端均在膜外㊂2.4㊀TaTVP1跨膜氨基酸序列比对分析㊀小麦TVP1编码762个氨基酸,由该氨基酸序列(图4)包含的12个跨膜结构域(I -XII)序列的分析和比较可知,小麦TVP1与拟南芥㊁水稻各跨膜区中保守氨基酸一致的分别为10㊁13㊁15㊁19㊁21㊁20㊁13㊁19㊁21㊁19㊁25及17个,各跨膜区疏水氨基酸的个数依次为16㊁15㊁12㊁13㊁11㊁13㊁14㊁15㊁17㊁13㊁11及14个㊂2.5㊀TaTVP1蛋白三级结构域预测㊀根据前述预测的不同疏水氨基酸跨膜结构,进一步预测TaTVP1蛋白在细胞内形成的功能结构,分别利用不同长度的氨基酸序列进行模型匹配比较分析可知,全长TaTVP1氨基酸可折叠形成膜结构孔道蛋白高级结构(图5A),该孔道具有较清晰的管状结构;其中N 段300氨基酸(图5B)与C 端301~762aa(图5C)能够形成独立的孔道结构组成模型㊂2.6㊀TaTVP 1在小麦不同组织的表达分析㊀选用耐旱品种晋麦47和水地品种舜麦1718为材料,分析TaTVP 1基因在根㊁茎㊁叶㊁穗4个不同组织的表达水平,并比较该基因在2个品种中不同组织的表达水平㊂定量PCR 结果显示(图6),TaTVP 1在不同组织中的表达水平存在明显差异,在根与茎中的表达量较高,叶㊁穗组织中表达量较低㊂在2个品种间,晋麦47的茎中表达量最高,高出根中表达量的1.63倍,穗中表达量最低;而舜麦1718茎中TaTVP 1表达量与根中的表达量差异很小,叶㊁穗中的表达量较低㊂图3㊀TaTVP1跨膜结构分析Fig.3㊀Characteristics of transmembrane structure of TaTVP13㊀结论与讨论植物对逆境非生物胁迫的响应过程十分复杂,涉及生理㊁生化特性的多种过程㊂在植物中,H +转运无机焦磷酸酶与NHX 逆向转运蛋白可以稳定胞质内的酸碱度,使胞质内的Na +维持在较低浓度,进而增强植物的耐盐㊁耐旱性[15-16]㊂该研究中克隆所获得的小麦TVP 1基因的核苷酸序列与参考基因序列存在一些单核苷酸差异,这可能是不同品种小麦之间单核苷酸多态性造成的㊂而且,六倍体小麦中含有A㊁B㊁D3个染色体组,TVP 1在不同染色体组中还存有同源基因[17]㊂TaTVP1蛋白中12个跨膜区域中的疏水氨基酸序列具有较高的一致性,表明该蛋白在进化过程中,结构域遗传保守性较高,也预示着其在细胞中的功能不可替代㊂有研究报道,9851卷17期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀马燕斌等㊀小麦TaTVP 1基因的克隆与表达分析注:I~XII 为分析跨膜序列结果所标示的氨基酸序列,疏水性氨基酸有A 丙氨酸㊁Y 酪氨酸㊁F 苯丙氨酸㊁W 色氨酸㊁V 缬氨酸㊁I 异亮氨酸㊁L 亮氨酸和P 脯氨酸㊂Note:I -XII is the amino acid sequence marked by the analysis of transmembrane sequence results.Hydrophobic amino acids include A alanine,Y tyro-sine,F phenylalanine,W tryptophan,V valine,I isoleucine,L leucine and P proline.图4㊀TaTVP1的跨膜氨基酸保守序列Fig.4㊀Amino acid sequence of TaTVP1transmembrane注:A㊁B㊁C㊁D 分别表示氨基酸序列为全长㊁N 端1~300aa㊁C 端301~762aa 及241~762aa㊂Note:A,B,C and D represent the full length,N-terminal 1-300aa,C-terminal 301-762aa and 241-762aa respectively.图5㊀TaTVP1蛋白的3级结构分析Fig.5㊀Tertiary structure analysis of TaTVP1protein图6㊀TaTVP 1在小麦不同组织中的表达量Fig.6㊀Expression of TaTVP 1in different tissues of wheat9㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年拟南芥NHX肽链C末端的缺失可引起Na+/H+交换活性发生明显变化[18],表明C末端与Na+/H+交换活性密切相关,分析显示TVP1的C末端位于膜外的氨基酸序列较长,且亲水氨基酸含量较高,推测该序列可能参与胞质内的离子交换,影响Na+/H+的交换活性,同时,TVP1蛋白三级结构具有明显的孔道结构,也预示与其具有的质子泵作用密切相关,但具体的行使功能过程需要进一步探究㊂㊀㊀研究表明,植物耐盐性与耐旱性具有一定的相关性,耐旱材料往往也表现出较好的耐盐性㊂过表达液泡H+焦磷酸酶的转基因植物对高浓度NaCl的耐受性更强,对干旱的耐受性也更强,由此可知该基因有助于提高植株的耐旱和耐盐性[19-20]㊂而在各种非生物胁迫下,许多转H+焦磷酸酶基因植物的茎和根生物产量增加[21-24]㊂该研究组织特异性表达结果中,该基因在根㊁茎中的相对表达量明显高于叶㊁穗中,这可能与TVP1在不同组织中抗逆性的作用特征有关;耐旱品种晋麦47与舜麦1718相比,茎部表达量又明显高于根部,这种表达模式可能与晋麦47表现出优良的耐旱性特征相关,后续可以通过转化该基因等方法对其功能进行进一步阐释㊂该研究获得并分析了小麦TVP1基因的核苷酸与氨基酸序列,对其表达模式也进行了研究㊂后期将在小麦中过量表达TVP1基因,探究其耐旱㊁耐盐功能,并进一步阐释其机制,从而为培育耐逆优良种质的植物提供理论基础㊂参考文献[1]FLEURY D,JEFFERIES 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122-130.[7]黄人卉,王桂香,刘凡.大白菜耐旱相关基因BpNFYA5的克隆及功能初步分析[J].园艺学报,2012,39(8):1501-1510.[8]向娟,林鹏,李兴盛,等.过表达番茄Sly-miR397基因增强拟南芥的耐旱性[J].中国农业大学学报,2016,21(10):51-58.[9]宋凝曦,李霞,王净,等.大环内酯类和高表达玉米C4-PEPC基因对水稻耐旱性的影响[J].作物学报,2021,47(10):1927-1940.[10]刘小双,刘廷利,袁洪波,等.棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析[J].中国农业科学,2015,48(12):2306-2316.[11]秦迪,赵翠兰,郑成忠,等.转BADH基因大豆耐旱性分析[J].中国油料作物学报,2015,37(6):752-758.[12]LATA C,PRASAD M.Role of DREBs in regulation of abiotic stress re-sponses in plants[J].Journal of experimental botany,2011,62(14):4731 -4748.[13]AKHTAR M,JAISWAL A,TAJ G,et al.DREB1/CBF transcription fac-tors:Their structure,function and role in abiotic stress tolerance in plants [J].Journal of genetics,2012,91(3):385-395.[14]ZHU J K.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annual review of plant biology,2002,53:247-273.[15]JIANG X Y,LEIDI E O,PARDO J M.How do vacuolar NHX exchangers function in plant salt tolerance?[J].Plant signaling&behavior,2010,5(7):792-795.[16]XU K,HONG P,LUO L J,et al.Overexpression of 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非寄主抗性基因介导的小麦抗真菌病害种质材料的获得和禾谷丝核菌原生质体制备与再生的研究

非寄主抗性基因介导的小麦抗真菌病害种质材料的获得和禾谷丝核菌原生质体制备与再生的研究小麦（Triticum aestivum）是世界上分布最广的三大粮食作物之一,也是我国重要的粮食作物。

在小麦的生长过程中,真菌性病害是影响小麦产量和品质的重要因素。

小麦纹枯病（wheat sharp eyespot）和小麦根腐病（root rot of wheat）是两种重要的小麦根部土传真菌病害,能在麦田土壤中多年累积,自小麦苗期至成株期均可以侵染发病,造成的小麦根部和茎基部的腐烂,在中国冬小麦主产区呈现逐年加重趋势,严重影响小麦的产量。

针对这类土传真菌病害,目前尚无高效的防治药剂,培育并应用抗病小麦新品种无疑是控制这两种病害最经济和最有效的途径。

由于对小麦抗纹枯病和根腐病的遗传机制的了解较少,及其抗病资源的匮乏,在小麦抗病基因工程的育种研究中,考虑引入新的抗性基因,创制广谱、稳定的抗病新种质,具有重要的实践意义。

本研究采用“无毒基因-抗病基因双因子”（Avr/R transgene combinations）共转化的抗病基因工程策略,利用病原诱导型启动子,串联从水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）中克隆并经改良的无毒基因avrRxo1基因片段,与来自玉米的非寄主抗病基因Rxo1共转化Bobwhite小麦品种,研究探讨非寄主抗性基因Rxo1与avrRxo1基因片段的互作对小麦根腐病等真菌性病害产生抗病性的分子机制。

主要结果如下:构建了病原诱导型表达载体并进行了基因枪法介导的小麦转化。

利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统,鉴定了病原诱导型启动子35S-mini的功能,接种禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）和麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）12 h开始,35S-mini可以启动GFP的表达。

证明病原诱导型启动子35S-mini能够被这两种土传病原真菌诱导表达。

植物广谱抗病基因NPR1的研究进展

的参考。
关键词：ＮＰＲ用
中图分类号：￥４３２．４１
文献标识码：Ａ
植物在生其自身的自然生态系统和发育过程中，总是在所ＮＰＲ６。其中ＮＰＲ３编码一个ＮＰＲ１直系同源物，在抵抗细菌
核定位功能位点；Ｎ一端具有一个ＢＴＢ／ＰＯＺ结构域，此结构域物种中以提高其抗病性成为基因工程关注的焦点。罗雪梅等将
可能参与蛋白互作。转录因子ＴＧＡ是系统获得性抗性（ＳＡＲ）
ＡｔＮＰＲ１基因转入不同水稻株系中，转基因株系对水稻白叶枯
ＷＲＫＹ转录因子（如ＷＲＫＹ６２、ＷＲＫＹ７０等）的表达依赖于３应用情况
蛋白分子量约为６６ｋＤ，编码５９３个氨基酸，其中包括１７个半ＮＰＲ１同源基因被克隆，遗传转化技术的不断提高和完善，通
胱氨酸。ＮＰＲ１蛋白ｃ一端具有一个锚蛋白重复结构域和一个过遗传转化的方法把广谱抗病性基因ＮＰＲ１转化到（另）一个
的激活剂，ＮＰＲ１与ＴＧＡ互作能够共同协调对防卫反应基因的病表现出高抗水平，抗病能力增强９０％以上口】。冯玉杰［４１等表达和抗性的调控。只有在受病原物诱导的条件下，ＮＰＲ１蛋将ＮＰＲ１转入新疆甜瓜中，得到的转基因甜瓜对枯萎病菌的抗白才能调控下游防卫基因表达；在没有被诱导物或病原体激活性明显，抗病性试验结果显示，转基因甜瓜对真菌和细菌性病时，相关病程基因的表达并没有提高。２ＮＰＲ１基因的来源与种类

小麦WRKY基因家族序列分析及白粉病菌诱导的表达谱研究的开题报告

小麦WRKY基因家族序列分析及白粉病菌诱导的表达谱研究的开题报告题目：小麦WRKY基因家族序列分析及白粉病菌诱导的表达谱研究1. 研究背景WRKY家族是一类重要的转录因子家族，参与了许多植物的生长发育、逆境反应和代谢过程等方面，具有很高的研究价值。

小麦是我国主要的粮食作物之一，白粉病是小麦重要的病害之一，对小麦的生产具有严重威胁。

因此，研究小麦WRKY基因家族对于探究小麦逆境反应机制和白粉病防治具有重要意义。

2. 研究目的本研究旨在对小麦WRKY基因家族进行序列分析，探究其结构特征和进化关系，并通过转录组数据分析，研究白粉病菌诱导的小麦WRKY 基因家族的表达谱，为小麦逆境反应和白粉病防治提供理论基础。

3. 研究内容（1）采用生物信息学方法对小麦中的WRKY基因进行鉴定和分类。

（2）利用多种计算方法对小麦WRKY基因家族的进化关系和结构特征进行分析。

（3）利用转录组数据分析白粉病菌诱导的小麦WRKY基因家族的表达谱，筛选与白粉病抗性相关的基因。

4. 研究方案（1）数据获取和预处理。

从公共数据库和本实验室的转录组测序数据中获取小麦基因组和转录组数据，并进行预处理。

（2）鉴定和分类小麦中的WRKY基因。

使用HMM模型、BLAST以及手动分析的方法鉴定小麦中的WRKY基因，并使用CD-HIT等工具对其进行分类和聚类。

（3）序列分析和进化关系研究。

使用多种计算方法对小麦WRKY基因家族的结构特征和进化关系进行分析，包括基因家族结构、保守结构域、基因组位置、同源基因对等等。

（4）转录组数据分析和基因表达谱构建。

将小麦叶片组织分别接种白粉病菌和不接种两组材料，提取RNA并测序。

利用组学方法对转录组数据进行分析和挖掘，并构建小麦WRKY基因家族的表达谱。

5. 研究意义本研究将对小麦WRKY基因家族的序列分析和进化关系提供新的见解，为小麦逆境抗性基因筛选和小麦育种提供基础数据。

另外，我们通过对白粉病菌诱导的小麦WRKY基因家族表达谱的研究，揭示了小麦对白粉病菌的抗性机制，为研究小麦抗病性和探究植物抗病机制提供新的线索和思路。

普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析的开题报告

普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析的开题报告开题报告题目：普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析研究背景：普通小麦（Triticum aestivum L.）是我国主要的粮食作物之一。

随着气候变化和人口增长，普通小麦的生产和品质需求也越来越大。

春小麦和冬小麦是普通小麦的两个重要类别，其中春小麦在寒冷的春季生长，需要较高温度和光照刺激来促进花芽发育和开花。

春小麦的春化基因在这个过程中起到至关重要的作用。

近年来，随着基因工程和分子生物学技术的发展，对普通小麦春化基因的研究逐渐深入。

然而，由于普通小麦基因组的巨大复杂性以及其核基因组的高比率，从中分离目标基因是一项极具挑战性的任务。

因此，在克隆和表达普通小麦春化基因方面，仍有很多问题需要解决。

研究目的：本研究旨在克隆普通小麦春化基因，并分析其表达特性，以便更好地了解普通小麦花芽发育和春化调控的分子机制。

研究内容：1.克隆普通小麦春化基因的全长cDNA序列；2.构建普通小麦春化基因表达载体，并在植物中进行表达；3.利用实时定量PCR分析载体表达的普通小麦春化基因在不同发育阶段和不同组织中的表达量差异；4.分析普通小麦春化基因的生物学功能和调控机制。

研究方法：1. 从数据库中获取已发表的普通小麦春化基因片段序列信息；2. 调用多聚酶酶链反应（PCR）技术扩增并克隆普通小麦春化基因的全长cDNA 序列；3.构建含春化基因的表达载体，转化到大肠杆菌或农杆菌中，进行原核或真核表达；4.利用实时定量PCR技术对表达的春化基因进行定量测定，分析其在不同发育阶段和不同组织中的表达变化；5.通过启动子分析和转录因子互作分析，阐明普通小麦春化基因的调控机制。

研究意义：本研究将在分子水平上深入探索普通小麦春化基因的结构和功能，为揭示普通小麦春化调控机制和提高普通小麦的生产率和品质提供基础性研究支撑，具有重要的科学和应用价值。

参考文献：1. 陶双臣. 普通小麦春化基因的研究概况及展望 [J]. 作物学报, 2015, 41(2): 211-223.2. 孟庆成. 基因克隆技术及其应用 [M]. 北京: 化学工业出版社, 2010.3. 生物化学与分子生物学实验 [M]. 北京: 高等教育出版社, 2018.。

白粉菌诱导下小麦tanho1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

麦类作物学报㊀２０１９,３９(１２):１４１６－１４２６J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :１０．７６０６/j．i s s n ．１００９Ｇ１０４１．２０１９．１２．０４网络出版时间:２０１９Ｇ１２Ｇ１１网络出版地址:h t t p ://kn s ．c n k i ．n e t /k c m s /d e t a i l /６１．１３５９．s ．２０１９１２０９．１５１５．００６．h t m l 白粉菌诱导下小麦T a N H O １基因的克隆、表达分析及亚细胞定位收稿日期:２０１９Ｇ０４Ｇ２２㊀㊀㊀修回日期:２０１９Ｇ０７Ｇ１６基金项目:国家重点研发计划项目(２０１７Y F D ０１００７０１)第一作者王晖(E Ｇm a i l :１５０２９９９００１６＠１６３．c o m )通讯作者:吉万全(E Ｇm a i l :j i w a n q u a n ２００８＠１２６．c o m );张宏(E Ｇm a i l :z h a n gh １１２９＠n w a f u ．e d u ．c n )王晖,徐晓敏,罗腾丽,吉万全,张宏(西北农林科技大学农学院/农业部作物基因资源与种质创制陕西科学观测实验站,陕西杨凌７１２１００)摘㊀要:非寄主抗性基因N HO １(n o n Ｇh o s t r e s i s t a n c e １)编码的甘油激酶(g l yc e r o l k i n a s e ,G K ),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程.为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用R T ＧP C R 方法克隆获得了转录自抗病种质N ９１３４的三个部分同源染色体的小麦N HO １基因(分别命名为T a N HO １Ｇ２A ㊁T a N HO １Ｇ２B 和T a N HO １Ｇ２D ),分析三个T a N HO １同源基因的序列㊁启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位.序列分析结果表明,小麦T a N HO １Ｇ２A /２B /２D 基因C D S 区序列全长分别为１６０５㊁１５９９和１６０５b p ,分别编码５３４㊁５３２和５３４个氨基酸残基;３个同源基因均含有与A t N HO １(A T １G ８０４６０．１)基因以及O s N HO １(O s ０４G ０６４７８００)基因高度相似的F G G Y _N 端和F G G Y _C 端结构域.经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着T a N ＧHO １可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程.q R T ＧP C R 结果表明,在N ９１３４抗病近等基因系响应白粉菌(B l u m e r i a g r a m i n i s f ．s p ．t r i t i c i ,B g t )侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中T a N HO １Ｇ２A ㊁T a N HO １Ｇ２B 基因在侵染早期均上调表达,而T a N HO １Ｇ２D 则表现出多次波动的表达模式;在N ９１３４感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后４８h 均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染.经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质㊁细胞膜以及核膜.关键词:小麦白粉病;N HO １;调控元件;表达分析;亚细胞定位中图分类号:S ５１２．１;S ３３０㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:１００９Ｇ１０４１(２０１９)１２Ｇ１４１６Ｇ１１C l o n i n g ,E x p r e s s i o nA n a l ys i s a n dS u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o no f T a N H O １G e n e I n d u c e db y P o w d e r y Mi l d e w i n W h e a t (T r i t i c u ma e s t i v u m )W A N G H u i ,X UX i a o m i n ,L U OT e n g l i ,J IW a n q u a n ,Z H A N G H o n g(C o l l e g e o fA g r o n o m y ,N o r t h w e s tA &FU n i v e r s i t y /S h a a n x iR e s e a r c hS t a t i o no fC r o p G e n eR e s o u r c e s&G e r m p l a s m E n h a n c e m e n t ,M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e ,P ．R．C h i n a ,Y a n g l i n g,S h a a n x i ７１２１００,C h i n a )A b s t r a c t :N o n Ｇh o s t r e s i s t a n c e g e n e s NHO １e n c o d e s g l y c e r o lk i n a s e (G K ),w h i c hi so n eo f t h er a t e Ｇl i m i t i n g e n z y m e s i n g l y c e r o lm e t a b o l i s m．I no r d e r t o e x p l o r e i t s e x p r e s s i o n p a t t e r n i nr e s po n s e t o t h e i n f e c t i o no f p o w d e r y m i l d e w ,t h e NHO １g e n e t r a n s c r i b e d f r o mt h r e e p a r t i a l h o m o l o go u s c h r o m o s o m e s w a s c l o n e d f r o m w h e a t g e r m p l a s m N ９１３４b y R T ＧP C R ,a n dd e s i gn a t e da s T a NHO １Ｇ２A ,２B a n d ２D ．T h e p r o m o t e rc o m p o n e n t s ,e x pr e s s i o n p a t t e r n sa n ds u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f T a NHO １g e n e w e r e f u r t h e r d e t e r m i n e d ．T h er e s u l to fs e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef u l l l e n g t ho fC D Sr e gi o no f w h e a t T a NHO １Ｇ２A /２B /２D g e n e i s １６０５,１５９９a n d １６０５b p ,e n c o d i n g ５３４,５３２a n d ５３４a m i n o a c i d s ,r e s p e c t i v e l y ．P r o t e i nd o m a i na n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e t h r e eh o m o l o go u s g e n e s c o n t a i nF G G Y _N Ｇt e r Ｇm i n a l d o m a i na n dF G G Y _C Ｇt e r m i n a l d o m a i nw h i c ha r eh i g h l y s i m i l a r t o A t NHO １(A T １G ８０４６０．１)g e n e a n d O s NHO １(O s ０４G ０６４７８００)g e n e ．T h e s t r u c t u r e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p r o m o t e r r e gi o no fT a NHO１c o n t a i n s a l a r g e n u m b e r o f p l a n t h o r m o n e s a n d c i sＧa c t i n g e l e m e n t s i n s t r e s s r e s p o n s e,w h i c h m e a n t t h a t T a NHO１c o u l d b e i n d u c e d b y a v a r i e t y o f p l a n t h o r m o n e s a n d p a r t i c i p a t e s i n t h e p r o c e s s o f w h e a t d i s e a s e r e s i s t a n c e．T h er e s u l t so f q R TＧP C Rs h o w e dt h a t T a NHO１i sr e s p o n s i v et o p o w d e r y m i l d e w(B l u m e r i a g r a m i n i s f．s p．t r i t i c i,B g t)i n f e c t i o n i nt h ed i s e a s eＧr e s i s t a n tn e a r i s o g e n i c l i n eo f N９１３４R/S,a l t h o u g ht h ee x p r e s s i o no ft h et h r e eh o m o l o g o u s g e n e si sd i f f e r e n ta td i f f e r e n tt i m e p o i n t s．T a NHO１Ｇ２A/２B g e n e s h o w e du pＧr e g u l a t e de x p r e s s i o n p a t t e r na t t h ee a r l y s t a g eo f i n o c u l aＧt i o n,w h i l e T a NHO１Ｇ２D g e n e s h o w e d f l u c t u a n t e x p r e s s i o n p a t t e r n．U n d e r t h e g e n e t i c b a c k g r o u n do f N９１３４s u s c e p t i b l en e a rＧi s o g e n i c l i n e,t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f h o m o l o g o u s g e n ew a sd o w nＧr e g u l a t e da t ４８h p o s t i n o c u l a t i o n,i n d i c a t i n g t h a t t h e g e n e r e s p o n d s t o p o w d e r y m i l d e wi n f e c t i o n．T h e r e s u l t so f s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o ns h o w e dt h a t t h e g e n em a i n l y a c t e d i nc y t o p l a s m,c e l lm e m b r a n ea n dn u c l e a r m e m b r a n e．T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y l a y a f o u n d a t i o nf o r f u r t h e r a n a l y s i so f t h es p e c i f i c f u n c t i o no f T a NHO１g e n e i nw h e a t．K e y w o r d s:W h e a t;p o w d e r y m i l d e w;NHO１;R e g u l a t o r y e l e m e n t s;E x p r e s s i o na n a l y s i s;S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n㊀㊀小麦白粉病是小麦生长中后期的主要病害之一,由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(B l u m e r i a g r a m i n i s f．s p．t r i t i c i,B g t)侵染所引起,导致小麦(T r i t i c u ma e s t i v u m)叶绿素降解,光合速率降低,产量受损[１].实践证明,利用抗病品种无疑是防控白粉病危害最经济㊁便利的方法.目前,在小麦中已经有６４个抗白粉病基因被正式命名[２].但是,多数品种携带的抗性基因(r e s i s t a n c e g e n e, R)为专一抗性基因,其抗病谱窄,面对变异频繁的病菌,其抗性容易丧失.因此,育种实践中,对抗病基因,尤其是广谱抗性基因的需求和研究显得更加迫切[３Ｇ４].在长期的协同进化中,植物对大多数的微生物入侵产生了免疫力[５Ｇ６].其中非寄主抗性是植物对大多数病原微生物最普遍的抗病形式之一,且具有广谱持久的特性.植物的先天免疫系统包括两种反应模式,一个是被模式识别受体(p a tＧt e r n r e c o g n i t i o n r e c e p t o r s,P R R s)识别的病原物表面分子(p a t h o g e nＧa s s o c i a t e d m o l e c u l a r p a tＧt e r n s,P AM P s)所触发的免疫反应(P AM PＧt r i gＧg e r e d i mm u n i t y,P T I)[７];另一个是由N BＧL R R 蛋白识别效应因子所启动的免疫反应(E f f e c t o rＧt r i g g e r e d i mm u n i t y,E T I)[８].无论是P T I还是E T I在植物抗病方面所起到的作用都需要复杂的信号网络,涉及到各种植物激素的调节.其中,水杨酸(s a l i c u l i ca c i d,S A)调节的信号通路在多个非寄主抗性反应中扮演着重要的角色,如拟南芥防御柑橘溃疡病菌[９]㊁水稻(转玉米非寄主抗性基因R x o１)抵抗细菌性条斑病反应[１０]等.值得注意的是,类似于抗病基因P R１和P A D４[１１],寄主响应细菌和真菌病原体等非寄生菌胁迫过程中, NHO１基因亦是植物非寄主抗性病程中必需和共有的[１２].如在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中,NHO１基因有助于抵抗真菌灰葡萄胞菌(B o t r y t i s c i n e r e)和细菌丁香假单胞菌(P s e u d oＧm o n a s s y r i n g a e t a b a c i P．s．t a b a c i)的侵染[１３Ｇ１４].与此同时,NHO１基因也参与部分抗性基因所介导的寄主抗性,如R P M１㊁R P S２等[１２,１５].除模式植物外,水稻(O r y z a s a t i v a)O s NHO１基因[１６]和苋色蔾(C h e n o p o d i u ma m a r a n t i c o l o r)C a NHO１基因[１５]同样也被证实在相应的非寄主和寄主抗性中发挥着重要作用.正是由此,P e a r t等[１７]认为非寄主抗性与寄主抗性机制之间存在一定的相关性.由此可见,NHO１基因在广谱抗性方面具有广泛的功能和广阔的利用前景.然而,目前对植物非寄主抗性分子机制的研究依然十分有限.拟南芥NHO１基因编码的甘油激酶(g l y c e rＧo l k i n a s e,G K),是甘油代谢的限速酶[１８];同时也是能量代谢的关键酶,对脂肪的储存和碳水化合物的代谢起着至关重要的作用[１９].甘油激酶催化甘油产生的３Ｇ磷酸甘油(g l y c e r o lＧ３Ｇp h o s p h a t e, G３P),是拟南芥基础抗性和系统获得性抗性(s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e,S A R)中植物防御信号的一种新型调控因子[１４,２０].Y a n g等[２１]报道小麦中NHO１基因通过参与调控G３P的合成来影响对小麦条锈菌(P u c c i n i as t r i i f o r m i s W e s tＧe n d f．s p．t r i t i c i E r i k s s,P s t)的抗性,同时证实该基因参与了S A通路对无毒P s t小种C Y R２３７１４１第１２期王晖等:白粉菌诱导下小麦T a N HO１基因的克隆㊁表达分析及亚细胞定位的应答,但对于响应小麦白粉菌侵染过程中该基因的表达差异,以及对该基因的启动子研究以及亚细胞定位等未见报导.因此在小麦转录组数据基础上[２２],本研究克隆了小麦中位于A㊁B㊁D三个基因组中的NHO１基因的部分同源序列,通过对其在小麦白粉菌胁迫下,三个部分同源染色体基因各自时空表达模式㊁启动子区域序列上调控元件及亚细胞定位进行初步分析,以期对该基因在小麦抗白粉病过程中的功能进行进一步解析.１㊀材料与方法１．１㊀材料与菌株小麦条锈病和白粉病兼抗种质N９１３４是以染色体工具材料阿勃５B非整倍体为母本,与野生二粒小麦(T r i t i c u md i c o c c o i d e s)A s８４６杂交后代经抗性定向选择而来的农艺性状良好且抗白粉病的小麦新种质.陕优２２５为本实验小麦白粉菌繁殖寄主和接种感病对照.以N９１３４为供体,陕优２２５为轮回亲本,经７轮回交培育的携带P m A s８４６抗/感病近等基因系N９１３４R和N９１３４S由西北农林科技大学农学院培育并保存.中国春(C h i n as p r i n g,C S)及中国春缺体Ｇ四体N２B T２A㊁N２D T２B㊁双端体D T２A S㊁陕优２２５和本氏烟草(N i c o t i a n ab e n t h a m i a n a)的种子均由西北农林科技大学农学院提供.㊀㊀小麦白粉菌(B l u m e r i a g r a m i n i s f．s p．t r i t i c i B g t)E０９菌株由中国农业科学院植物保护研究所麦类病害创新课题组惠赠.１．２㊀材料的处理将N９１３４及其抗病近等基因系N９１３４R㊁感病近等基因系N９１３４S种于盆钵中,置于２５ħ人工培养箱中培养.待幼苗长到两叶一心时,通过抖接法接种E０９菌株.分别于接种前０h,接种后１２㊁２４㊁３６㊁４８㊁７２h取叶样,置于－８０ħ保存备用.１．３㊀基因组D N A、总R N A的提取及c D N A第一链的合成采用C T A B法[２３]提取小麦叶片基因组D N A.采用T r i z o l试剂法[２４]对不同时间点叶片样品进行总R N A的提取.再根据P r i m e S c r i p t T M Ⅱ１s tS t r a n dc D N A S y n t h e s i s K i t(T a K a R a,大连)试剂盒程序进行c D N A第一链的合成.１．４㊀目的基因C D S区序列克隆及定位利用Z h a n g等[２２]N９１３４转录组数据基础结合基因组测序结果,依据获得序列中最大开放阅读框设计引物(表１).以引物T a N HO１ＧF/R㊁T a N HO１Ｇ２B F/R㊁T a N HO１Ｇ２D F/R在c D N A中进行P C R扩增并采用缺体Ｇ四体定位,以特异性引物在D N A中扩增,来明确该基因所在染色体位置.P C R反应体系及程序参照吴迪等[２５]方法.１．５㊀生物信息学分析通过N C B I(h t t p s://w w w．n c b i．n l m．n i h．g o v)和U R G I(h t t p s://w h e a tＧu r g i．v e r s a i l l e s．i nＧr a．f r/T o o l s)中B L A S T程序对T a NHO１基因进行核酸序列及其氨基酸序列进行比对;用E xＧP A S y(h t t p s://w w w．e x p a s y．o r g/r e s o u r c e s)中的在线网站资源进行生物信息学分析,如I n t e rＧP r o S c a n(h t t p://w w w．e b i．a c．u k/i n t e r p r o/ s e a r c h/s e q u e n c eＧs e a r c h)软件进行保守结构域预测;用T a r g e tP１．１S e r v e r(h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/T a r g e t P)㊁S i g n a lP３．０S e r v e r (h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/S i g n a l PＧ３．０)以及TMHMM S e r v e r v２．０(h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/T MHMM/)软件对蛋白的信号肽㊁跨膜螺旋进行预测;用P r o t S c a l e(h tＧt p s://w e b．e x p a s y．o r g/p r o t s c a l e)对蛋白的亲疏水性进行预测;用N e t P h o s２．０(h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/N e t P h o sＧ２．０)进行磷酸化位点预测;用C e l lＧP L o c２．０(h t t p://w w w．c s b i o．s j t u．e d u．c n/b i o i n f/C e l lＧP L o cＧ２)进行该蛋白亚细胞定位预测.用D N AMA N８软件进行多重序列比对,用M E G A７．０软件,采取N e i g h b o rＧJ o i nＧi n g法构建系统进化树;用M E M ES u i t e５．０(h tＧt p://m e m eＧs u i t e．o r g)和G S D S２．０(h t t p://g sＧd s．c b i．p k u．e d u．c n)在线分析软件对序列m o t i f 和基因结构进行分析.１．６㊀基因启动子区域克隆及分析依据E n s e m b l P l a n t s(h t t p://p l a n t s．e n s e mＧb l．o r g/i n d e x．h t m l)上公布的序列,选取A T G上游２０００b p启动子区域,设计专一引物２A㊁２B㊁２DＧp r o m t e rF/R(表１)在基因组D N A中进行P C R扩增,采用方法同本文１．４内容.利用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s．p s b．u g e n t．b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l)在线对其进行分析.１．７㊀E０９侵染下T a N H O１基因的表达分析基于克隆得到的T a NHO１同源基因序列,在其差异区域分别设计专一性引物(表１),以T a A c t i n为内参基因(表１).利用T a K a R a公司８１４１麦㊀类㊀作㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷(大连)的R R ０３７A 试剂盒要求采用两步法,对实验材料所取６个时间点叶片的总R N A 进行反转录合成c D N A .通过A B I ７３００型荧光定量P C R仪,采用T a K a R a 公司(大连)R R ８２０A 试剂盒进行实时荧光定量P C R 反应,利用２－әәC t法进行目标基因接种白粉菌后的表达分析.表１㊀T a N H O １基因扩增㊁qR T ＧP C R ㊁启动子扩增以及同源重组中的引物信息T a b l e １㊀P r i m e r s u s e d f o r T a N H O １a m p l i f i c a t i o n ,q R T ＧP C R ,p r o m o t e r a m p l i f i c a t i o na n dh o m o l o go u s r e c o m b i n a t i o n 基因G e n e引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)P r i m e r s e qu e n c e (５ᶄＧ３ᶄ)产物大小P r o d u c t l e n g t h /b p 用途P u r p o s e T m/ħT a N HO １Ｇ２A T a N H O １ＧFG T T A C T C C A C A A G C A C T T C T C T C T G c D N A１８１６克隆C l o n i n g ６１T a N H O １ＧR A A C T G G G A G T A T G G C G G G G A A gD N A３９４１T a N HO １Ｇ２B T a N H O １Ｇ２B FA T G G C G G G G A A G G G G G Ac D N A１５９９克隆C l o n i n g ６１T a N H O １Ｇ２B RC T A C A G A G A G A G G T C G G C C A G A gD N A３９３０T a N HO １Ｇ２D T a N H O １Ｇ２D FA T G G C G G G G A A G G G G A Ac D N A１６０５克隆C l o n i n g５８．５T a N H O １Ｇ２D R C T A C A G A G A A A G A T C G G C A A G A T C A gD N A３７６２T a N HO １Ｇ２A qR T Ｇ２A ＧF T G C T T T A G A A G G C T C A A T T G C A qR T Ｇ２A ＧR G T G C C C C T T G T T T G T G A A C C ２２５q R T ＧP C R ６０T a N HO １Ｇ２B qR T Ｇ２B ＧF C T C T G G A A G G C T C A A T T G C G qR T Ｇ２B ＧR G T G C C C C T T G T T T G T G A A C C ２２３q R T ＧP C R ６０T a N HO １Ｇ２D qR T Ｇ２D ＧF G C T C T A G A A G G G T C G A T T G C G qR T Ｇ２D ＧR G A T C C C C C T T G C A T C A T C C C １８８q R T ＧP C R ６０T a A c t i nT a A c t i n ＧF C T T G T A T G C C A G C G G T C G A A CT a A c t i n ＧRC T T G T A A T C A A G G G C C A C G １３４qR T ＧP C R ６０T a N HO １Ｇ２A ２A Ｇp r o m t e rF A G A G T T C G C T G G T T C G C A ２A Ｇp r o m t e rR C T G C T T G A A C T C G A G C T G G T ２７９８启动子区域克隆P r o m o t e r r e g i o n c l o n i n g５８T a N HO １Ｇ２B ２B Ｇpr o m t e rF C C A T A T G G T A C G C A C G A C G A ２B Ｇp r o m t e rR C G G C G G T C G T A G A T G A T G A A ２４８９５８T a N HO １Ｇ２D ２D Ｇpr o m t e rF G T C T C C C G T T C A G C A A G G T T２D Ｇpr o m t e rR C G G A G C G T A G T A G C A A C C A A２０００５８G F P ＧT a N HO １Ｇ２BG F P ＧF T A G C C A T G G T A G A T C T G A T G G C G G G ＧG A A G G G G G AG F P ＧRG C C T T A C G T A A C T A G T C A G A G A G A G ＧG T C G G C C A G A１６２８载体V e c t o r ６５１．８㊀亚细胞定位以杨凌奥科鼎盛生物科技公司测序的含有T a NHO １Ｇ２B 基因的质粒为模板,设计同源重组引物G F P ＧF 和G F P ＧR (表１)扩增T a NHO １基因的C D S 序列(已除终止子T A G ),方法同１．４.将扩增得到的序列与S p e Ⅰ酶切的P Y J ::G F P 载体同源重组构建成P Y J ＧT a NHO １Ｇ２B ＧG F P 载体,经大肠杆菌转化㊁菌落P C R 检测后提取质粒,转化农杆菌E H A １０５,以P Y J ::G F P 载体的空白载体为对照.参照丁作美[２６]等的方法进行农杆菌侵染及观察.２㊀结果与分析２．１㊀小麦T a N H O １基因的同源克隆结果以接种E ０９的N ９１３４叶片c D N A 为模板,以T a N HO １ＧF /R (表１)为引物,对T a NHO １Ｇ２A 基因扩增得到长度１８００b p 左右的目标条带(图１),对该条带进行胶回收㊁连接㊁转化㊁挑菌㊁测序后,利用N C B I 进行核酸序列比对,结果表明,与小麦编码甘油激酶基因相似度高达９６％.利用特异性引物(表１)扩增得到的３个同源基因(图１)分别位于第２同源群A ㊁B ㊁D 染色体上,故９１４１第１２期王晖等:白粉菌诱导下小麦T a N HO １基因的克隆㊁表达分析及亚细胞定位命名为T a NHO １Ｇ２A (G e n b a n k 登陆号MN ０８２５７６)㊁T a NHO １Ｇ２B (G e n b a n k 登陆号MN ０８２５７７)和T a NHO １Ｇ２D (G e n b a n k 登陆号MN ０８２５７８).C D S 序列全长分别为１６０５㊁㊀㊀M :D N A 分子量标准D L ２０００;１~３分别代表T a N HO １Ｇ２A ㊁T a N HO １Ｇ２B 和T a N HO １Ｇ２D 的P C R 产物.M :D N A M a r k e r D L ２０００;１,２a n d３r e p r e s e n tt h e P C R pr o d u c t so f T a N HO １Ｇ２A ,T a N HO １Ｇ２B a n d T a N HO １Ｇ２D ,r e Ｇs p e c t i v e l y．图１㊀T a N H O １基因的P C R 扩增F i g ．１㊀P C Ra m pl i f i c a t i o no f T a N H O １g e n e １５９９和１６０５b p.经序列比较,３个基因中存在９１个S N P 差异.与基因组D N A 比对后发现,基因均含有３个内含子和４个外显子(图３ＧB ).T a NHO １Ｇ２B 在第一外显子中比T a NHO １Ｇ２A/２D 少６b p,３条来自不同基因组序列的差异主要存在于内含子上.２．２㊀染色体定位结果电泳结果(图２)分析表明:引物T a N HO １ＧF /R 在D T ２A S 双端体中未扩增出目标条带,而在N ２B T ２A ㊁N ２D T ２B 缺体Ｇ四体以及C S 中扩增得到３９４１b p 来源于A 染色体组的条带;引物T a N HO １Ｇ２BF /R 在N ２B T ２A 缺体Ｇ四体中未扩增出目标条带,而在D T ２A S 双端体㊁N ２D T ２B 缺体Ｇ四体以及C S 中扩增得到３９３０b p 来源于B染色体组的条带;引物T a N HO １Ｇ２D F /R 在N ２D T ２B 缺体Ｇ四体中未扩增出目标条带,而在D T ２A S 双端体㊁N ２B T ２A 缺体Ｇ四体以及C S 中扩增得到３７６２b p 来源于D 染色体组的条带.因此,进一步明确３个同源基因转录自小麦第二同源群３条部分同源染色体.㊀㊀M :D L ５０００;A ㊁B ㊁C 为T a N HO １Ｇ２A ㊁T a N HO １Ｇ２B 和T a N HO １Ｇ２D 的缺体Ｇ四体定位;１㊁６㊁１１模板为N ９１３４;２㊁７㊁１２模板为C S;３㊁８㊁１３模板为D T ２A S ;４㊁９㊁１４模板为N ２B T ２A ;５㊁１０㊁１５模板为N ２D T ２B .M :D L ５０００;A ,B a n dC a r e t h e l o c a l i z a t i o n o f T a N HO １Ｇ２A ,T a N HO １Ｇ２B a n d T a N HO １Ｇ２D ,r e s p e c t i v e l y ．L a n e s １,６a n d １１:A m pl Ｇi c o n s f r o m N ９１３４;L a n e s ２,７a n d １２:A m p l i c o n s f r o m C S ;l a n e s ３,８a n d１３:A m p l i c o n s f r o m D T ２A S ;L a n e s ４,９a n d１４:A m p l i c o n s f r o m N ２B T ２A ;l a n e s ５,１０a n d １５:A m pl i c o n s f r o m N ２D T ２B ．图２㊀T a N H O １同源基因的缺体Ｇ四体定位扩增电泳F i g ．２㊀L o c a l i z a t i o no f T a N H O １h o m o l o go u s g e n e sw i t hn u l l i Ｇt e t r a s o m i c l i n e s ２．３㊀生物信息学分析２．３．１㊀蛋白的理化性质利用T a r g e tP １．１㊁S i gn a l P ３．０和T MHMM 软件进行的分析表明,T a NHO １基因在小麦中的三个同源基因均编码一种非分泌蛋白,无法进行蛋白转运,为非跨膜蛋白.P r o t S c a l e 在线进行分析推测出T a NHO １基因编码的蛋白为亲水蛋白.一般来说,可能发生磷酸化的位点存在于多肽链中越多,其所能发挥的功能就可能更多[２７].通过N e t P h o s ２．０在线软件对该蛋白进行磷酸化位点预测,结果表明其含有大量的蛋白磷酸化位点(表２),由此推测出其编码的蛋白质活性可能与其磷酸化调控有关.用I n t e r P r o S c a n 对蛋白结构域分析发现,３个同源基因均含有F G G Y 家０２４１麦㊀类㊀作㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷㊀㊀A :N HO １基因的氨基酸序列比对,横线部分为A T P 结合位点,线框部分为２个F G G Y 家族保守位点;B :小麦和其他植物编码甘油激酶蛋白之间的系统进化树;用M E M E ４．０程序中描述的方法进行m o t i f 分析,盒子的不同颜色代表蛋白对应位置的１０个m o t i f ;基因结构分析,横线为内含子,盒子为对应的外显子和上下游非编码区.A :A m i n o a c i d s e q u e n c e a l i g n m e n t d e d u c e d f r o m N HO １g e n e s ;t h e u n d e r l i n e d s e q u e n c e i s t h eA T Pb i n d i n g si t e ,a n d t h e b o x e d p a r t s a r e t h e t w o c o n s e r v e d s i t e s o f t h e F G G Yf a m i l y ;B :C o n s e n s u s n e i g h b o r Ｇj o i n i n g t r e e b a s e d o n t h e s e q u e n c e s o f g l yc e r o l k i n a s e f r o m w h e a t a n do t h e r p l a n t ;M o t i f a n a l y s i sw a sde t e r m i n e d b y u s i n g M E M E４．０p r o g r a ma s d e s c r i b e d i nm e t h o d s ．D if f e r e n t c o l o r s o f t h e b o x e s r e p r e Ｇs e n t １０m o t i f s i n t h e c o r r e s p o n d i ng p o s i t i o n o f e a ch p r o t ei n s ．F o r g e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s ,t h e h o r i z o n t a l l i n e s r e pr e s e n t i n t r o n s ,t h e b o x e s c o r r e s po n d t o e x o n s a n d ５ U T Ra n d ３ U T R．图３㊀N H O １蛋白同源性分析F i g ．３㊀H o m o l o g y a n a l ys i s o fN H O １p r o t e i n s１２４１第１２期王晖等:白粉菌诱导下小麦T a N HO １基因的克隆㊁表达分析及亚细胞定位族成员的特征结构域,包括参与底物结合的F GＧG Y_N端结构域和负责A T P结合的F G G Y_C端结构域.与拟南芥㊁水稻中编码NHO１基因的蛋白序列进行比对,结果表明其包含F G G Y家族中２个保守位点和A T P结合位点(图３A),推测T a NHO１编码小麦甘油激酶.表２㊀同源基因中磷酸化位点个数T a b l e２㊀N u m b e r o f p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s i n t h e t h r e e a l l e l e s基因A l l e l e丝氨酸S e r i n e苏氨酸T h r e o n i n e酪氨酸T y r o s i n e T a N HO１Ｇ２A１４７４T a N HO１Ｇ２B１２６４T a N HO１Ｇ２D１４６４２．３．２㊀蛋白同源性利用N C B I中同源序列比对获取拟南芥㊁水稻㊁野生二粒小麦㊁粗山羊草(A e g i l o p st a u sＧc h i i)㊁乌拉尔图小麦(T r i t i c u mu r a r t u)㊁二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m d i s t a c h y o n)㊁谷子(S e t a r i a i t a l i c a)㊁玉米(Z e a m a y s)㊁大麦(H o r d e u m v u lＧg a r e)以及高粱(S o r g h u m v u l g a r e)等物种中与之同源性较高的基因序列.选取A t NHO１与O s NHO１基因同小麦NHO１基因进行多序列的比对(图３A).发现T a NHO１Ｇ２A/２B/２D与A tＧNHO１和O s NHO１之间高度保守.为进一步研究T a NHO１基因的进化关系,将其与其他物种的氨基酸序列通过M E G A７．０软件构建进化树(图３B),发现T a NHO１Ｇ２A与野生二粒小麦A染色体组(T R I D C２A G０７２４００)亲缘关系最近;T a NＧHO１Ｇ２B与野生二粒小麦B染色体组(T R I D C２B G０７８４７０)亲缘关系最近;T a NHO１Ｇ２D与粗山羊草(E MT０１３５５)亲缘关系最近.进化分析表明,普通小麦和野生二粒小麦㊁乌拉尔图小麦㊁大麦(HO R V U２H r１G１１４２６０)㊁粗山羊草(E MT０１３５５)等C３的单子叶作物属于同分支;与高粱(E E S１２９６５)㊁谷子(K Q K９９２０２)㊁玉米(Z m００００１d００２０８５_T００１)等C４的单子叶作物属于遗传较远的另一分支;与拟南芥A t NHO１等双子叶植物遗传距离最远.通过M E M E５．０对其蛋白序列进行保守m o t i f预测,共发现１０个保守m o t i f,其中有９个m o t i f在所有蛋白质中存在,其排列顺序也相同.通过对基因结构的分析表明,小麦T a NHO１在基因结构上与其他作物之间具有较大的相似性.综合以上结果表明T a NHO１Ｇ２A㊁２B和２D与A t NHO１和O s NHO１以及其他作物编码甘油激酶的基因序列之间高度保守.２．４㊀启动子区域分析启动子分析结果表明:序列中除T A T AＧb o x 和C A A TＧb o x以外还含有大量响应植物激素以及干旱等胁迫的顺式作用元件,且在同源基因间存在差异.从响应植物激素元件来看,T a NHO１基因启动子受到多种植物激素调控,参与防卫㊁胁迫等植物应激反应,推测该基因可能受多种激素信号调节并参与小麦抗病抗逆反应,是一个与抗逆境相关的基因.从三个同源基因的启动子的差异上看,其均能受到S A㊁茉莉酸(j a s m o n i ca c i d, J A)等植物激素诱导影响,但相同元件的数量不同(表３)且所处的位置不同(图４).T a NHO１Ｇ２B基因启动子分析结果在接受植物激素诱导的顺式作用元件的数量上明显多于T a NHO１Ｇ２A/２D.２．５㊀侵染后的表达差异分析该基因的３个部分同源染色体同源基因在不同时间点的表达分析(图５)结果表明,对N９１３４的抗病近等基因系(N９１３４R)接种E０９后,T a NＧHO１Ｇ２A㊁２B基因在接种早期均迅速呈现出上调表达,在接种１２h到２４h之内分别达到２．８和２．３倍上调表达;T a NHO１Ｇ２A基因在２４h后趋于正常水平,但T a NHO１Ｇ２B基因在７２h的表达量再次上调;而T a NHO１Ｇ２D在３６h后先表现下调,但在７２h表现出高于对照３．５倍的上调表达.对N９１３１的感病近等基因系(N９１３４S)接种E０９后,该基因在３个部分同源染色体的同源基因均在接种４８h表现出下调表达.虽然同源基因T a NHO１在表达模式和表达量上存在差异,但均在小麦响应白粉菌侵染时参与了防御反应,且在其在抗㊁感病近等基因系之间的表达量上存在明显差异.２．６㊀蛋白亚细胞定位利用C e l lＧP L o c２．０的亚细胞定位预测结果显示,该蛋白作用于细胞质上的可能性最大,其次是细胞膜㊁细胞核上.为了更加准确的定位该蛋白的作用位置,进行了亚细胞定位实验.结果显示,P Y J::G F P空白载体分布在烟草表皮细胞的细胞核㊁细胞膜和细胞质等部位(图６A),而P Y JＧT a NHO１Ｇ２BＧG F P融合蛋白在细胞质㊁细胞膜以及核膜中表达(图６B),这说明该基因定位结果与预测结果一致.２２４１麦㊀类㊀作㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷表３㊀T a N H O １Ｇ２A ㊁２B ㊁２D 启动子区域主要顺式作用元件T a b l e ３㊀M a i n c i s Ｇa c t i n g e l e m e n t s o f T a N H O １Ｇ２A ,２B a n d ２D p r o m o t e r r e gi o n s 功能原件名称N a m e o f f u n c t i o n a l e l e m e n t识别序列R e c o g n i t i o n s e qu e n c e 功能F u n c t i o n数量A /B /DN u m b e r o f f u n c t i o n a le l e m e n t s i nA /B /DT A T A ＧB O X T A T A A A A 转录起始Ｇ３０核心启动子元件C o r e p r o m o t e r e l e m e n t a r o u n d Ｇ３０o f t h e o r i g i no f t r a n s c r i p t i o n １６/９/１３C A A T Ｇb o x C A A A T 调控下游基因的转录起始和频率㊁增强转录效率C o mm o nc i s Ｇa c t i n g e l e m e n t i n p r o m o t e r a n de n h a n c e r r e g i o n s １６/７/１２T C A Ｇe l e m e n t T C A G A A G A G G水杨酸响应的元件S a l i c y l i c a c i d r e s p o n s i v e e l e m e n t １/２/１T G A C G Ｇm o t i fT G A C G M e J A 响应的元件M e J Ar e s po n s i v e e l e m e n t ２/６/４A B R E A C G T G 脱落酸响应的元件A b s c i s i c a c i d r e s po n s i v e e l e m e n t ２/４/２A R E A A A C C A 对厌氧诱导必不可少的顺式调节元件A n a e r o b i c i n d u c t i o n r e g u l a t o r y e l e m e n t e s s e n t i a l ２/１/１M B S C A A C T G 干旱诱导的MY B 结合位点MY Bb i n d i n g s i t e i n v o l v e d i nd r o u g h t Ｇi n d u c i b i l i t y ２/２/４WU N Ｇm o t i f A A A T T T C C T 创伤响应的元件W o u n d Ｇr e s p o n s i v e e l e m e n t １/１/１T G A Ｇe l e m e n tA A C G A C 生长素响应元件A u x i n Ｇr e s po n s i v e e l e m e n t ０/２/１a s Ｇ１T G A C G 植物激素应答元件P l a n t h o r m o n e r e s po n s i v e n e s s １/３/２G ＧB o xC A C G T T植物对一些环境因子及病原物应答P l a n t s r e s p o n s e t o e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s a n d p a t h o ge n s ３/６/４图４㊀T a N H O １启动子区部分顺势作用元件的相对位置F i g ．４㊀R e l a t i v e p o s i t i o n s o f s o m e h o m e o p a t h i c e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r r e gi o no f T a N H O１㊀㊀A :对N ９１３４R 接种E ０９后T a N HO １Ｇ２A /２B /２D 基因的相对表达量;B :对N ９１３４S 接种E ０９后T a N HO １Ｇ２A /２B /２D 基因的相对表达量.A :R e l a t i v e t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o f T a N HO １Ｇ２A /２B /２D i n d u c e db y B gt i n f e c t i o n i nN ９１３４Ra f t e r i n o c u l a t i o nw i t hE ０９;B :R e l a Ｇt i v e t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o f T a N HO １Ｇ２A /２B /２D i n d u c e db y B gt i n f e c t i o n i nN ９１３４Sa f t e r i n o c u l a t i o nw i t hE ０９．图５㊀T a N H O １基因在E ０９侵染后不同时间点的相对表达量F i g ．５㊀R e l a t i v e e x pr e s s i o n l e v e l s o f T a N H O １g e n e a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s a f t e r i n f e c t i o n３２４１第１２期王晖等:白粉菌诱导下小麦T a N HO １基因的克隆㊁表达分析及亚细胞定位㊀㊀A:对照P Y J::G F P空白载体定位;B:P Y JＧT a N HO１Ｇ２BＧG F P融合蛋白定位.A:T h e l o c a l i z a t i o no f c o n t r o l P Y J::G F Pe m p t y v e c t o r;B:T h e l o c a l i z a t i o no f P Y JＧT a N H O１Ｇ２BＧG F P f u s i o n p r o t e i n．图６㊀小麦T a N H O１Ｇ２B基因的亚细胞定位分析F i g．６㊀S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fw h e a t T a N H O１Ｇ２B g e n e３㊀讨论前人研究表明,NHO１基因编码的甘油激酶参与甘油代谢合成G３P,而在拟南芥中G３P是其基础抗性和系统获得性抗性(s y s t e m i ca c q u i r e d r e s i s t a n c e,S A R)防御系统中的一种新型调控因子[１３,２０].水稻O s NHO１通过上游S A信号通路介导对其本身寄主病原物P X O９９的抗性[１６].此外,将水稻O s NHO１互补到拟南芥n h o１突变体上,证明其可以恢复对非寄主病原物的抗性.我们对T a NHO１Ｇ２A㊁２B和２D基因的启动子区域分析发现,其启动子区均含有大量T C AＧe l eＧm e n t㊁a sＧI等元件,意味着S A可能调控T a NＧHO１Ｇ２A㊁２B和２D基因的表达.这一结果进一步为S A信号通路和NHO１基因均响应小麦抗条锈病[２１]的过程提供了理论解释.本研究利用转录组分析结果,P C R扩增得到的小麦T a NHO１基因的三个同源基因,其编码蛋白均属于F G G Y家族,含有F G G Y_C端结构域和F G G Y_N端结构域,这与拟南芥㊁水稻㊁红藻(P y r o p i a h a i t a n e n s i s)㊁苋色蔾(C h e n o p o d i u m a m a r a n t i c d o r)乃至大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i)编码甘油激酶的基因具有相同的保守结构域;利用N J法构建的系统进化树㊁以及通过分析保守m o t i f和比较不同作物间同源基因的基因结构得到的结果表明该基因在进化过程中高度保守.在转录水平,P s e u d o n m o n a s s y r i n g a e p v．P h a s e o l iＧc o l a侵染拟南芥时,A t NHO１基因在１２h到２４h 之间转录水平迅速上调来响应非寄主病原菌的侵染[２８];在水稻被白叶枯病原菌P X O９９侵染时, O s NHO１基因在９h到２４h之间表现出强烈的上调表达来抵抗寄主病原菌侵染[１６].与此同时,在小麦抵抗P s t无毒性小种C Y R２３侵染中, T a G L I/NHO１基因同样的在１２h到２４h上调表达后趋于正常值[２１],这与本实验得到的T a NＧHO１Ｇ２A基因在响应B g t无毒小种侵染时的表达模式相同,且基因启动子区域与O s NHO１基因启动子较为相似,均含有大量的植物激素响应元件,如M e J A顺式作用元件㊁T G AＧe l e m e n t㊁A B R E㊁M B S等.综合以上结果,T a NHO１基因在结构上与响应病原菌侵染过程中同A t NHO１和O s NHO１拥有高度的相似性.序列相似意味着功能相近,因此推测其在小麦非寄主抗性方面可能发挥着类似的作用.据报道,甘油激酶在细胞质内催化A T P中的磷酸基团转移到甘油中,从而产生G３P;而在４２４１麦㊀类㊀作㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷微生物中甘油激酶可以与结合在细胞膜上的甘油促进子相互作用并可以促进甘油激酶的功能[２９Ｇ３０].本研究结果进一步证实了N HO激酶的多重功能.亚细胞定位结果表明,在小麦中甘油激酶主要作用在细胞质内催化甘油向G３P转化,改变植物甘油的含量,从而直接或者间接影响病原菌在植物中获取的营养成分,进而实现非寄主抗性[３１].此外,细胞膜和核膜定位信号结果表明,甘油激酶在植物中亦可能通过与作用于细胞膜上类似甘油促进子的基因发生相互作用,从而促进胞内甘油转化成G３P,然而其互作蛋白需要进一步研究.多倍体化和基因冗余给小麦基因功能研究带来了巨大阻力.本研究克隆的NHO１基因,虽然来自于３条部分同源染色体,但同源基因间对生物胁迫的反应却不相同,表明其都参与到响应白粉菌侵染的过程中.在启动子研究报道中,启动子同样存在累积效应,同时,元件数量与转录距离的差异均会对启动子响应的强度和诱导产生的结果表现出不同的影响[３２Ｇ３３].本实验对T a NHO１基因启动子的分析表明,虽然启动子的组成元件种类一致,但其在数量以及与转录起始位点的距离不同,可能导致了小麦T a NHO１基因在不同染色体上的表达差异.本研究所得到的结果为进一步解析非寄主抗性基因NHO１在小麦抗白粉病过程中的作用提供数据支撑,以及应对小麦多倍体化,同源基因的不同表达模式分析提供了参考,同时也为小麦抗病育种提供了基因资源,此后可进一步将T a NHO１基因转入拟南芥n h o１突变体中进行其功能验证.参考文献:[１]徐仲阳,张宏,莫启波,等．小麦响应白粉病菌转录因子T a TＧG A１的表达分析[J]．植物病理学报,２０１８(６):７６６．X UZY,Z H A N G H,MO Q B,e ta l．E x p r e s s i o na n a l y s i so f w h e a t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r T a T G A１g e n e r e s p o n d i n g t o i n f e cＧt i o no f p o w d e r y m i l d e w[J]．A c t aP h y t o p a t h o l o g i c aS i n i c a,２０１８(６):７６６．[２]Z H A N G D Y,Z HU K Y,D O N G LL,e ta l．W h e a t p o w d e r y m i l d e w r e s i s t a n c e g e n e P m６４d e r i v e d f r o m w i l d e mm e r (T r i t i c u mt u r d i d u m v a r．d i c o c c o i d e s)i s t i g h t l y l i n k e d i nr eＧp u l s i o n w i t hs t r i p er u s tr e s i s t a n c e g e n e Y r５[J]．T h eC r o p J o u r n a l,２０１９,h t t p://d o i．o r g/１０．１０１６/j．c j．[３]陈红霖,储成才,李平,等．植物非寄主抗性研究进展[J]．遗传,２００８,３０(８):９７７．C H E N H L,C HU CC,L I P,e t a l．P l a n t n o nＧh o s t r e s i s t a n c e: c u r r e n t p r o g r e s s a n d f u t u r e p r o s p e c t[J]．H e r e d i t a s,２００８,３０(８):９７７．[４]隋新霞,郭栋,尤升波．植物非寄主抗性的遗传与机理研究进展[J]．山东农业科学,２０１４,４６(８):１４２．S U IXX,G U OD,Y O USB．A d v a n c e s i n r e s e a r c ho f g e n e t i c s a n d m e c h a n i s m o fn o nＧh o s tr e s i s t a n c ei n p l a n t s[J]．S h a nＧd o n g A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,２０１４,４６(８):１４２．[５]G I L B E R T G S,W E B B C O．P h y l o g e n e t i cs i g n a li n p l a n t p a t h o g e nＧh o s t r a n g e[J]．P r o c e e d i n g s o f t h eN a t i o n a l A c a d eＧm y o f S c i e n c e,２００７,１０４(１２):４９７９．[６]H E A T H M C．N o n h o s t r e s i s t a n c e a n d n o n s p e c i f i c p l a n t d e f e nＧs e s[J]．C u r r e n tO p i n i o n i nP l a n tB i o l o g y,２０００,３(４):３１５．[７]J E A N B,J E A N C,H E R I B E R T H．S i g n a l i n g m e c h a n i s m s i n p a t t e r nＧt r i g g e r e d i mm u n i t y(p t i)[J]．M o l e c u l a rP l a n t,２０１５,８(４):５２１．[８]S T O T Z H U,M I T R O U S I A G K,D E W,e t a l．E f f e c t o rＧt r i gＧg e r e dd e f e n c e a g a i n s t a p o p l a s t i c f u n g a l p a t h o g e n s[J]．T r e n d s i nP l a n t S c i e n c e２０１４,１９(８):４９１．[９]A NCF,MO UZL,Y A N GCH．N o nＧh o s t d e f e n s e r e s p o n s e i n an o v e l A r a b i d o p s i sＧx a n t h o m o n a s c i t r i s u b s p．c i t r i p a t h o s y sＧt e m[J]．P L o SO N E,２０１２,７(１):e３１１３０．[１０]王磊,许美容,高晓清,等．非寄主抗病基因R x o１介导的水稻对X a n t h o m o n a s o r y z a e p v．o r y z i c o l a的抗病反应[J]．生物技术通报,２０１０(１２):１００．WA N GL,X U M R,G A O X Q,e ta l．R e s i s t a n c et o X a nＧt h o m o n a s o r y z a e p v．o r y z i c o l a t r i g g e db y n o nＧh o s t r e s i s t a n c e g e n e R x o１i nr i c e[J]．B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n,２０１０(１２):１００．[１１]R O J A SC M,S E N T H I LＧK UMA R M,WA N G K,e t a l．G l yＧc o l a t eo x i d a s e m o d u l a t e sr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e sＧm e d i a t e d s i g n a l t r a n s d u c t i o nd u r i n g n o n h o s tr e s i s t a n c ei n N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a a n d A r a b i d o p s i s[J]．P l a n tC e l l,２０１２,２４(１):３３６．[１２]L U M,T A N G X Y,Z H O UJ M．A r a b i d o p s i s N HO１i s r eＧq u i r e df o r g e n e r a lr e s i s t a n c ea g a i n s t P s e u d o m o n a s b a c t e r i a [J]．P l a n tC e l l,２００１,１３(２):４３７．[１３]C H A N D A B,V E N U G O P A L S C,K U L S H R E S T H A S,e ta l．G l y c e r o lＧ３Ｇp h o s p h a t e l e v e l sa r ea s s o c i a t e dw i t hb a s a l r eＧs i s t a nc et ot h eh e m i b i o t r o p h i cf u n g u s C o l l e t o t r i c h u m h i gＧg i n s i a n u m i n A r a b id o p s i s[J]．P l a n tP h y s i o l o g y,２００８,１４７(４):２０１７．[１４]C HA N D A B,X I A Y,MA N D A L M K,e ta l．G l y c e r o lＧ３Ｇp h o s p h a t e i s ac r i t i c a lm o b i l e i n d u c e ro f s y s t e m i c i mm u n i t y i n p l a n t s[J]．P l a n t S i g n a l i n g a n dB e h a v i o r,２０１１,４３(１１):４２１．[１５]严文．苋色蔾C a N HO１基因的克隆与抗病毒功能研究[D]．成都:四川农业大学,２０１６:３０Ｇ３８．Y A N W．C l o n i n g o f C h e n o o d i u m Am a r a n t i c o l o r C a N HO１g e n e a n d c h a r a c t e r i z a t i o no f i t s r o l e i nv i r u s r e s i s t a n c e[D]．C h e n g d u:S i c h u a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,２０１６:３０Ｇ３８．[１６]高志亮,肖晓蓉,陈艳,等．水稻O s N HO１基因c D N A序列分离及表达分析[J]．热带生物学报,２０１４,５(１):３０．G A OZL,X I A O XR,C H E N Y e t a l．I s o l a t i o na n de x p r e sＧ５２４１第１２期王晖等:白粉菌诱导下小麦T a N HO１基因的克隆㊁表达分析及亚细胞定位。

植物抗性基因NPR1研究进展

植物抗性基因NPR1研究进展韩永光;马利刚;赵乐;冯卫生;郑晓珂【摘要】NPR1是调节植物整体抗病性的重要作用因子,参与植物多种抗性代谢通路,是多个抗病性信号传导通路的交叉点.从NPR1的结构特点、研究进展,以及其与转录因子的相互作用等方面进行阐述,并对NPR1的利用进行展望.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)026【总页数】3页(P18-20)【关键词】抗性基因;NPR1;转录因子【作者】韩永光;马利刚;赵乐;冯卫生;郑晓珂【作者单位】河南中医药大学药学院,河南郑州450046;呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州450046;河南中医药大学药学院,河南郑州450046;呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州450046;河南中医药大学药学院,河南郑州450046;呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州450046;河南中医药大学药学院,河南郑州450046;呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州450046;河南中医药大学药学院,河南郑州450046;呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心,河南郑州450046【正文语种】中文【中图分类】S184病程相关基因非表达子1 ( nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)是多个抗病性信号传导通路的交叉点，是调节植物整体抗病性的重要作用因子，又称为NIM1 或SAI1。

植物如果缺少NPR1的功能，就会导致病程性相关蛋白质PR基因表达的受损和在应对病虫害侵害时，系统性获得抗性 (Systemic Acquired Resistance，SAR)的抵抗作用几乎全部缺失。

通过对DNA序列进行比对分析，结果显示NPR1启动子中含有相对保守的28个核苷酸序列，这些序列组成3个W盒，其中1个反向排列，2个顺向串联。

NPR1启动子必需与WRKY蛋白结合后才能发挥作用，如果W盒中的某个核苷酸被替换，则不能与WRKY 蛋白发生结合[1]。

小麦TCTP基因的克隆及白粉菌诱导下的表达

小麦TCTP基因的克隆及白粉菌诱导下的表达李刚;刘晓颖;李学平;王振英【期刊名称】《植物研究》【年(卷),期】2010()4【摘要】翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)最初在鼠肿瘤细胞中被发现,研究表明TCTP广泛存在于动植物细胞中,并具有多种生物学功能。

本研究用RT-PCR和RACE技术在抗白粉病栽培小麦Brock中克隆了一个TCTP基因,该基因全长766bp,推测编码一个168个氨基酸的多肽。

ScanProsite分析表明,该多肽链具有2个TCTP特征结构区(TCTP1和TCTP2)和7个可能的功能位点。

表达半定量分析发现,该基因受华北地区流行的优势小种15号白粉菌诱导,且随着诱导时间的增加其表达量增加。

本研究将可能在小麦白粉病抗性研究领域开辟新的研究思路。

【总页数】7页(P441-447)【关键词】TCTP基因;白粉菌;表达半定量分析;抗白粉病栽培小麦【作者】李刚;刘晓颖;李学平;王振英【作者单位】天津师范大学化学与生命科学学院,细胞遗传与分子调控天津市重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S512.1【相关文献】1.白粉菌诱导下感病小麦京411中TCTP基因的表达分析 [J], 郑舒扬;王艳红;肖莹;刘晓颖;王振英2.小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达 [J], 张微;孙鸿;邢莉萍;卫晓静;王华忠3.白粉菌(Erysiphe graminis)侵染诱导表达的小麦糖苷水解酶基因TaGlc2的克隆与鉴定 [J], Ramesh N PUDAKE;辛明明;尹玉静;解超杰;倪中福;孙其信4.小麦Mlo基因的克隆及白粉病菌诱导下的表达模式分析 [J], 徐红明;刘红彦;王俊美;田保明;王鹏涛5.白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位 [J], 王晖;徐晓敏;罗腾丽;吉万全;张宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小麦PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究(英文)

小麦PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究(英文)牛吉山;刘瑞;郑磊【期刊名称】《麦类作物学报》【年(卷),期】2007(27)6【摘要】病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5是植物抗病基因介导的抗病反应和系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)中的标志基因。

为了研究病程相关蛋白基因和水杨酸在小麦(TriticumaestivumL.)抗白粉病反应中所起的作用,以抗白粉病和感白粉病小麦品系为材料,在白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici,Bgt)诱导不同时间,或水杨酸处理不同时间后,用半定量RT-PCR技术检测了小麦叶片中PR-1、PR-2和PR-5基因的表达变化。

结果表明,白粉病菌的侵染激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录。

与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录激活得更快、更强。

水杨酸处理显著激活了PR-1和PR-5的转录,但对PR-2的转录影响不大。

白粉病菌和水杨酸均能显著激活和增强PR-1和PR-5的表达,但白粉病菌的作用更强,说明PR-1和PR-5基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用。

PR-1和PR-5可以作为小麦SAR的标志基因。

水杨酸处理后周麦18和中国春的白粉病抗性得到提高,提示水杨酸在小麦抗白粉病信号传导途径中起一定作用。

【总页数】6页(P1132-1137)【关键词】小麦;白粉病;水杨酸;病程相关蛋白基因的表达【作者】牛吉山;刘瑞;郑磊【作者单位】河南农业大学国家小麦工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】S512.1;S435.12【相关文献】1.茉莉酸甲酯诱导的小麦白粉病抗性与9个抗病相关基因表达间的关系 [J], 牛吉山;刘靖;马文斌;李巧云;王正阳;贺德先2.白粉菌诱导下感病小麦京411中TCTP基因的表达分析 [J], 郑舒扬;王艳红;肖莹;刘晓颖;王振英3.利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因TaTST与小麦抗白粉病反应的关系 [J], 贺洋;岳洁瑜;王华忠4.小麦Mlo基因的克隆及白粉病菌诱导下的表达模式分析 [J], 徐红明;刘红彦;王俊美;田保明;王鹏涛5.白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位 [J], 王晖;徐晓敏;罗腾丽;吉万全;张宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

拟南芥NPR1和水稻Chi11基因导入小麦的研究的开题报告

拟南芥NPR1和水稻Chi11基因导入小麦的研究的开题报告一、研究背景及意义小麦作为世界上重要的粮食作物之一，在全球人口增长和粮食安全问题日益突出的情况下，其产量和品质的提高成为关键。

近年来，越来越多的研究表明，获得抗病性和逆境耐受的小麦品种是实现小麦高产的重要保障。

因此，将其他植物中具有抗病性和逆境耐受性的基因导入小麦中，是实现小麦育种的一种新的思路。

目前研究发现，拟南芥NPR1基因和水稻Chi11基因对植物的抗病性和逆境耐受性有明显的促进作用。

NPR1是一个跨细胞膜的转录因子，可以通过抗氧化和抗病毒等途径增强植物的抗病性和逆境耐受性。

Chi11则是一种亚细胞级别的蛋白酶，可以进一步提高植物对逆境的忍受力。

因此，将这两个基因导入小麦中，有望提高小麦的抗病性和逆境耐受性，实现小麦的高产。

二、研究目的本研究旨在将拟南芥NPR1和水稻Chi11基因导入小麦中，通过对转基因小麦的抗病性和逆境耐受性的研究，探索基因工程改良小麦的可能性和可行性。

三、研究内容1.构建NPR1和Chi11基因的表达载体：通过PCR扩增NPR1和Chi11基因，将其克隆进表达载体中，并加入适当的启动子和终止子，构建完整的表达载体。

2.将表达载体导入小麦中：通过农杆菌介导法，将构建好的表达载体导入小麦发芽胚中，获得转基因小麦种子。

3.鉴定转基因小麦：利用PCR和Southern blotting技术，鉴定转基因小麦中是否已经成功导入了NPR1和Chi11基因，并确定转基因小麦的基因型。

4.比较转基因小麦和野生型小麦的抗病性和逆境耐受性：通过对转基因小麦和野生型小麦的幼苗进行接种病原菌和逆境处理，比较两者的抗病性和逆境耐受性。

四、研究预期结果1. 成功构建NPR1和Chi11基因的表达载体，并通过农杆菌介导法导入了小麦中。

2. 鉴定得到一批具有NPR1和Chi11基因的转基因小麦，并确定了其基因型。

3. 对转基因小麦和野生型小麦的抗病性和逆境耐受性进行比较，证明了NPR1和Chi11基因对小麦的抗病性和逆境耐受性有着显著的促进作用。

小麦白粉病抗性基因类似物的克隆和分析的开题报告

小麦白粉病抗性基因类似物的克隆和分析的开题报
告
一、选题背景及研究意义
小麦白粉病是世界性小麦病害之一，严重影响小麦产量和品质。

小麦白粉病抗性是控制小麦白粉病的唯一有效手段，因此寻找小麦白粉病抗性基因类似物对于小麦白粉病抗性的研究具有重要意义。

二、研究内容和目的
研究将利用PCR和克隆技术克隆小麦白粉病抗性基因类似物，并对其进行筛选及分析，探究小麦白粉病抗性机制及其抗病效果。

具体研究内容包括以下几个方面：
1、设计小麦白粉病抗性基因类似物的引物并进行PCR扩增。

2、利用克隆技术将PCR扩增出的目的片段进行克隆，并进行序列分析。

3、对克隆出的基因进行数据库比对及功能预测分析，挖掘出对白粉病具有抗性特性的基因。

三、预期成果及意义
通过该研究，预计可以克隆出多个小麦白粉病抗性基因类似物，并对其进行分析和筛选。

这将有助于深入探究小麦白粉病抗性的机制，并挖掘新的小麦白粉病抗性基因，为小麦培育和生产提供借鉴和帮助。

同时，该研究还有助于推动克隆技术及功能分析在小麦病害防控中的应用和推广。

基于转录组测序的小麦新种质PI672538的赤霉病抗

基于转录组测序的小麦新种质PI672538的赤霉病抗一、研究背景小麦是全球最重要的粮食作物之一，为了提高小麦产量和质量，不断开发新的小麦种质资源是非常必要的。

在小麦育种中，病害是一个重要的限制因素。

赤霉病是小麦的主要病害之一，它可以导致小麦叶片枯黄、茎秆腐烂，并造成小麦产量大幅降低。

因此，选育抗赤霉病的小麦新品种是非常重要的。

近年来，转录组测序技术的发展为育种提供了一种新的思路。

转录组测序可以高通量地检测全基因组的转录本，为研究小麦的抗病机制提供了全面的基础。

本文将介绍小麦新种质PI672538的赤霉病抗性的研究结果。

二、研究材料与方法本研究选取小麦的一个新种质，即PI672538，它在野外环境下表现出较强的赤霉病抗性。

为了深入挖掘其抗性机制，我们采用了转录组测序技术。

具体分为以下几个步骤：1. RNA提取：在赤霉病病原菌接种24小时后，从小麦幼苗中取样进行RNA提取，RNA质量检测后进行下一步操作。

2. 转录组测序：将RNA提取物进行cDNA合成和文库构建后，采用Illumina测序平台进行转录组测序。

3. 数据处理和分析：首先进行质量控制和去除污染物，再比对到小麦基因组上进行定位，最后进行基因表达差异分析和生物信息学分析。

三、研究结果与讨论1. 转录组测序数据分析结果在转录组测序数据分析中，我们获得了大量的高质量的转录组测序数据。

经过比对到小麦基因组上，我们发现在小麦基因组中共有98855个基因被表达，其中2879个基因的表达受到了赤霉病接种的影响。

2. 基因表达差异分析结果在经过差异分析后，我们得到了共有1274个基因表达差异显著。

其中，592个基因在赤霉病接种后表达显著上调，682个基因在接种后表达显著下调。

3. 生物信息学分析结果在赤霉病接种后，小麦新种质PI672538上调表达的基因中，包括多个与免疫反应相关的基因，如WRKY、NBS-LRR、MAPK等。

这些基因在免疫应答过程中发挥着重要的作用，由此可以推测PI672538的赤霉病抗性可能与其免疫反应的增强有关。