PCR技术
PCR技术
PCR技术PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于扩增DNA片段的重要分子生物学技术。
通过PCR技术，可以在体外迅速扩增出特定的DNA序列，使得该技术在基因分型、基因克隆、基因重组、遗传病检测等领域得到广泛应用。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，通过高温（通常为94-98°C）将DNA双链变性为两个单链。
然后，通过降低温度（通常为50-65°C）使引物与目标序列互补结合。
最后，通过DNA聚合酶的活性，在适当的温度条件下（通常为72°C），引物通过DNA聚合酶的催化作用将目标序列进行扩增。
PCR技术中，引物的设计起着至关重要的作用。
引物是指在DNA序列两侧能够与目标序列互补结合的寡核苷酸序列。
在PCR扩增的第一步中，引物通过与目标序列的互补性结合来引导DNA的扩增。
因此，引物的设计需要考虑以下几个因素。
首先，引物的长度应该在18-30个碱基对之间，通常为20-25个碱基对。
引物过短可能无法确保特异性扩增，引物过长可能导致目标序列的特异性降低。
其次，引物的Tm（熔解温度）应该在55-65°C之间。
熔解温度是引物与目标序列结合的温度，过低的熔解温度可能导致非特异性产物的扩增，过高的熔解温度可能导致引物无法结合目标序列。
此外，引物的GC含量也是设计引物时需要考虑的因素之一、GC含量的适宜范围通常为40-60%，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。
最后，引物之间不能有自身互补性或引物之间的互补性。
自身互补性可能导致引物形成二聚体，而引物之间的互补性可能导致不特异性产物的扩增。
在引物设计方面，可以借助于计算机软件进行引物的全面评估。
目前常用的引物设计软件有Primer3、OligoAnalyzer等。
通过在这些软件中输入目标序列，可以获得一系列满足上述设计准则的引物。
综上所述，PCR技术是一种重要的分子生物学技术，而引物的设计是PCR技术中至关重要的一环。
pcr技术
pcr技术PCR技术简述PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它通过扩增DNA序列，使得微量的DNA可被放大到足够进行分析和检测。
PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基瑞克·穆利斯，他们在1983年首次描述了PCR技术的原理和应用。
PCR技术的原理基于DNA的双链结构以及DNA聚合酶的酶活性。
首先，需要将DNA样本经过解链处理，使得DNA的两条链分离。
然后，通过引物（primers）的引导，DNA聚合酶在适当的温度下，将碱基按序合成新的DNA链。
在这个过程中，由于DNA聚合酶的高保真性，其错误复制的错误率非常低。
PCR技术的应用非常广泛。
一方面，PCR技术可以用于DNA的克隆，即通过扩增特定目标序列，大量复制所需的DNA片段。
这项技术在基因工程、遗传学、疾病诊断以及法医学中有着重要的应用。
另一方面，PCR技术还可用于DNA的测序，即通过大量扩增DNA片段的方法，快速获取准确的DNA序列信息。
这项技术在基因组学、进化生物学等领域具有重要意义。
PCR技术具有许多优点。
首先，PCR技术具有高效快速的特点。
在PCR反应中，只需几个小时就能从微量的DNA样本扩增出大量的DNA。
其次，PCR技术的扩增过程是在体外进行的，不依赖于生物体，也不受DNA序列的限制。
第三，PCR技术对DNA样本的要求较低，只需微量的DNA就可以进行扩增。
最后，PCR技术的扩增结果可以被检测和分析，从而实现对特定DNA序列的定量和定性研究。
然而，PCR技术也存在一些限制。
首先，由于PCR技术的扩增过程是指数型增长，因此存在扩增产物的竞争问题，这可能导致非特异性扩增。
其次，PCR技术对引物的设计和选择要求较高，如果引物选择不当，可能会导致扩增失败或非特异性扩增。
此外，PCR技术还存在杂交、污染和抑制等问题，这可能对结果的准确性产生影响。
为了解决PCR技术的一些限制，研究人员对PCR技术进行了改进和创新。
PCR技术
循环次数 按变性，退火，延伸的程 序进行PCR循环，可以根据需要确定 循环次数。 循环次数决定PCR扩增程 度。PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 30～40次之间。如有需要，可将上次 的PCR产物稀释后，重新进行PCR循 环。
上述过程结束后，从PCR仪中取出PCR管，用微 量移液器从中取10μL ，加入Loading Buffer(12μL)，充分混匀，制成混和均匀的混合物。 六﹒ PCR扩增产物的检测分析 凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺 凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者， 后者主要用来检测小片段DNA。
（1）制胶 琼脂糖凝胶厚度要适中。过薄则加样孔样品 会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有 些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝 胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入 100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min， 使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室 温等温度下降至60℃时，加入终浓度 0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排 除气体）。
PCR仪：
冷冻离心机：
核酸电泳仪：
制冰机：
实验步骤：
一.引物设计 引物设计原则： 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)。 使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增 出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带） ，不出 带或出带很弱，等等。
ddH2O 21μL
总计 50μL
三.将装有上述混合物的PCR管放入冷 冻离心机，1000r/m离心10s,用于混匀 反应物。 四.将管置于PCR仪中，设置反应参数： 预变性 95℃ 5min 变性 95℃ 30s
pcr技术课件
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
pcr技术介绍
PCR技术介绍1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR），是一项在短时间内采用两引物大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
每个循环之后，模板量为原来的2倍。
它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞甚至一个分子水平。
2、PCR扩增模式图PCR反应的特点：高度特异性、高度敏感性、高丰度产量3、PCR技术原理循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿一、PCR的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
4、重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
（一）普通PCR系统1.PCR反应体系：DNA聚合酶DNA靶序列两端引物脱氧核苷酸dNTPs缓冲液2.DNA的合成方向：5’→3’3.Taq DNA聚合酶4.PCR循环：变性退火延伸（二）PCR循环第一步——变性（93~98℃）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
PCR技术
Mg2+浓度
Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度以1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
PCR反应体系的基本成分
• • • • • • •
10×PCR Buffer MgCl2或MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物 (随机引物或特异引物) 模板DNA Taq DNA polymerase ddH2O
PCR引物设计的基本原则
合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。 1 引物长度通常18～30bp； 2 解链温度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T) 3 GC含量以40%～60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带；
PCR反应的基本过程
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后， 温③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如 TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更 多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。
PCR技术
环化 酶切体系中加入无菌水至终体积为 200ul，加 入200ul 氯仿 ：异戊醇(24:1）用涡旋仪混匀， 12000r/min离心5min; 取上清加入2倍体积 95%乙醇， 缓慢混匀后12000r/min离心5min,弃去液体，在管底 和管壁可见透明颗粒状沉淀，室温干燥DNA，溶解在 20ulTE溶液中。严格限制连接体系中DNA的终浓度小 于2ug/ml，连接环化体系为 500uL，连接酶300U/ug 用量为2ug连接过夜后，反应体系经酒精沉淀，溶解 在20ulTE溶液中，作为PCR反应模板。
目
录
PCR技术的概念及基本原理
PCR技术的反应体系
PCR技术的类型及应用
概念
PCR 技术 （聚合酶链式反应 ) 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的 分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA复制， PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
基本原理
PCR技术的基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成，利用DNA在体外摄氏 95 度高温时变性会变 成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对 的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右） ，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
《肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征》 本文采用RT-PCR鉴定采集于手足口病疱液的10株 病毒，其结果与血清实验一致，鉴定出其中3株为 EV-71型，另外7株为Cox.A16。EV71常规的诊断方法 为病毒分离培养,中和抗体检测和免疫组织化学法。 EV71主要引起手足口病和中枢神经系统感染,而神经 毒力的基因特征的确定依赖分子遗传学的分析,这些 方法费时、费力,无法满足疾病流行期间同时处理大 量标本的需要。RT-PCR可以在疑似该疫情爆发时做 出及时正确诊断。
PCR技术
使双链DNA解链为单链
94oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异 性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低
启动子序列 定点突变 探针标记
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要 构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入 细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选; 这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培 养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时 间。
错误掺入率增加
Principle of TA Cloning
T-A克隆的原理是基于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性 的活性, 可将PCR双链产物的每一条链的3′端加入单A核苷 酸尾。 在70～75℃时，Taq DNA聚合酶的这种活性尤为显著, 而常规的PCR反应程序最后的步骤均为72℃延伸7～10 min, 故可满足PCR产物3′端为突出的单A核苷酸尾。 另一方面,在仅有适量的dTTP存在的情况下, Taq DNA聚 合酶也可将切成平端的质粒的3′端加入单T核苷酸尾, 故 用Taq DNA聚合酶也造成了切成平端的pBS质粒3′端产生 了突出的单T核苷酸。 PCR产物的3′末端单A核苷酸尾与切成平端的pBS质粒的 3′末端突出的单T核苷酸实现了T-A互补, 称为T-A克隆, 它 实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率.
PCR技术
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95度时解旋，35度时引物与单链按碱基互补配对结合，再调温度至65度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在95度，35度，65度之间很好的控制。
1.PCR原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶--Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
高中生物选修三pcr技术
高中生物选修三pcr技术
PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它可以扩增DNA片段。
以下是高中生物选修三PCR技术相关的内容：
1. PCR反应原理：PCR反应利用DNA聚合酶对DNA序列进行复制和扩增。
主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
2. PCR反应体系：PCR反应需要的试剂包括DNA模板，引物（前向引物和反向引物），Taq DNA聚合酶，dNTPs和缓冲液等。
3. PCR反应步骤：
（1）变性：将DNA模板加热至95℃，使其解旋成两条单链。
（2）退火：降温至引物的退火温度，使引物与模板互补结合。
（3）延伸：加入Taq DNA聚合酶和dNTPs，开始扩增DNA片段。
4. PCR应用：PCR技术可以用于基因克隆、基因表达分析、基因诊断等领域，例如DNA指纹鉴定、疾病基因检测等。
5. PCR优化：PCR反应条件对扩增效率有很大影响，需要根据实验目的和样品特点进行优化，如引物设计、反应体积、温度梯度等。
希望这些信息对你有所帮助。
如有任何疑问，请随时询问。
简述PCR技术
简述PCR技术引言聚合酶链式反应（PCR）是一种被广泛应用于生物医学研究领域的重要技术。
它是一种能够在体外迅速扩增DNA序列的方法，使得从少量样本中获得足够多的目标DNA。
PCR技术的发展在分子生物学、基因工程和医学诊断等领域有着重要的应用。
本文将简要介绍PCR技术的原理、步骤和应用。
原理PCR技术主要基于DNA的复制原理，即DNA的两条链可以通过加入适当的引物和DNA聚合酶酶，通过一系列的反应步骤模拟DNA复制的过程。
PCR反应分为三个核心步骤：变性、退火和延伸。
1.变性：将待扩增DNA样本暴露在高温条件下，使得双链DNA变为单链DNA。
这个步骤通常在95°C的高温下进行，以使DNA的双链解开。
2.退火：在较低温度下，引物与单链DNA特异性结合。
引物是由PCR反应策略所决定的短寡核苷酸序列，它们与待扩增序列的两端互补。
引物与单链DNA的结合是PCR扩增的关键步骤。
3.延伸：在适当的温度下，DNA聚合酶酶借助引物作模板合成新的DNA链。
这个步骤会在每个引物的3’端延伸到5’端方向进行。
通过不断重复变性、退火和延伸的循环过程，PCR能够迅速扩增目标DNA序列。
步骤PCR反应通常包括以下步骤：1.样本准备：从样本中提取待扩增的DNA。
2.引物设计：根据待扩增的DNA序列设计引物。
引物的设计对PCR反应的特异性和效率有重要影响。
3.PCR反应体系的配制：将待扩增的DNA样本与引物、DNA聚合酶酶以及反应缓冲液等混合在一起。
4.PCR反应条件设定：确定PCR反应的变性、退火和延伸温度和时间。
5.PCR反应：设置PCR反应的循环次数，按照设定的温度和时间进行PCR扩增。
6.扩增产物检测：利用凝胶电泳或其他检测方法检测PCR反应产生的扩增产物。
应用PCR技术在许多领域有着广泛的应用，包括：1.分子生物学研究：PCR技术被广泛用于DNA序列的分析、基因克隆和定量检测等领域。
它可以对微量DNA样本进行扩增，从而得到足够的DNA用于后续实验。
PCR技术详解
– 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠杆菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为 100µl时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物 量减少。
第十二页，编辑于星期三：一点 四十九分。
2. 引物 引物是PCR特异性反应的关键, PCR产物的特异性取决 于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.10.5 mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和 非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几 率
1)反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA 片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进 行扩增。
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组。
未知序列 已知序列
– 基因克隆，DNA测序，分析突变
• 诊断
– 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
• 人类基因组工程
– 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱
• 法医
– 犯罪现场标本分析
• 肿瘤 – 各种肿瘤检测
• 其他……
第三十三页，编辑于星期三：一点 四十九分。
谢谢观赏
第三十四页，编辑于星期三：一点 四十九分。
单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合
蛋白类
对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模板量 是1μg，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模 板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg
第十五页，编辑于星期三：一点 四十九分。
4. dNTP dNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20℃下冰冻保存,
PCR技术
7. 水：
去离子水，补足整个反应体积。
四、PCR反应体系：
常用30μl
各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液
浓度进行核算。 10×buffer： 1×30×1 / 10 = 3μl
MgCl2:
dNTPs: 引物 P：
1.5×30×1 / 25 = 1.8μl
一、PCR的定义
四、PCR反应体系
二、PCR的原理
五、PCR反应条件优化
三、PCR的成分和作用
六、PCR技术的主要用 途
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶链 式反应，又称体外DNA扩增技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的 技术。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好 以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、 法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室， 大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地 对目的基因进行分析、鉴定。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和 G+C含量确定，长度 在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算
得到，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异 性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。
二、PCR的原理：
用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA片段，类
似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的 DNA分子为模板，以一对分别与模板 5′ 末端和 3′ 末端互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着 模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过程，
PCR 技术
PCR原本是一种定性的方法，只能回答样
品中有无目的基因存在，现在已经可以用
来定量测定，即回答样品中原始模板的确
切数目。
Polymerase Chain Reaction
PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb
的基因到目前已能扩增长达几十个kb的 DNA片段。
Polymerase Chain Reaction
研究中。PCR的建立大大地推动了生命科学的发
展。由于PCR的实用性和极强的生命力，PCR方
法还将会被不断完善，进一步在生命科学研究中
发挥更大的作用。
Polymerase Chain Reaction
第二节 PCR技术的基本原理和操作
一、PCR的基本原理
PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为 模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段 为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留 复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA 合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段 得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板， 因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长，工作 原理惊人的简单。
Polymerase Chain Reaction
PCR传奇
一个生命技术的故事
上海科技教育出版社
Polymerase Chain Reaction
本书依据大量第一手文献和访谈材料，生动揭示 了当代重大生物技术发明PCR的动人内幕，深入 考察了PCR从理论概念孕育到实用工具开发的曲 折历程，充分展现了西特斯公司科学家在20世纪 80年代挑战学院科学体制，造就高风险、高回报 的风险资本环境的开拓创新精神。本书尤其传神 地再现了1993年诺贝尔化学奖得主穆利斯“发 明”PCR的富有传奇色彩的“历险记”，探讨了 生物技术产业发展的科学、技术、文化、社会、 经济、政治、法律诸多因素，是一本不可多得的 科普佳作。
PCR原理及过程
PCR原理及过程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基因分析技术，利用该技术可以在体外快速地扩增特定的DNA片段。
PCR被广泛应用于分子生物学、遗传学等领域，具有高灵敏度、高特异性和高复制度等优点。
下面将详细介绍PCR的原理及过程。
一、PCR的原理：PCR利用了DNA的两个特性：DNA链的互补性和DNA聚合酶的酶活性。
PCR通过不断地重复DNA的变性、退火和延伸三个步骤，成功地实现了DNA片段的指数增加。
1. 变性（Denaturation）：将待扩增的DNA样品加热到95°C以上，使DNA双链完全分离成两条单链DNA。
2. 退火（Annealing）：将温度降低到50-65°C，使引物（Primers）与单链DNA互补结合。
引物是两段15-25个核苷酸碱基组成的短DNA片段，它们能在待扩增的DNA序列上选出起始位点。
3. 延伸（Extension）：将温度升高到72°C，引物上结合的DNA序列上将新的DNA碱基逐个连接，由热稳定聚合酶完成。
二、PCR的过程：PCR的扩增是通过循环式的三步骤：变性、退火和延伸来完成的。
一般来说，PCR的过程可以分为以下几个步骤。
1.样品准备：从待扩增的DNA样品中提取目标DNA片段，并通过电泳或其他方法进行检测。
2.反应体系配制：将待扩增的DNA样品与缓冲液、引物、聚合酶、DNA碱基和类似核酸的物质（DMSO）等组成PCR反应的混合物。
反应体系的配制需要考虑多个参数，如反应液的浓度、强度和pH值等，以达到最佳的扩增效果。
3.循环式反应：将混合物装入PCR反应管中，然后置于PCR仪中进行循环式反应。
a.第一步：在第一个循环中，将反应管加热至95°C左右，使DNA双链分离成两条单链DNA。
b.第二步：调低温度至50-65°C，使引物与单链DNA互补结合。
c.第三步：升温至72°C，引物上结合的DNA序列上将新的DNA碱基逐个连接。
PCR百度百科
PCR百度百科PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。
目录1.生物学的聚合酶链式反应2. 电子信息学的光电导继电器3. 计算机学的程序控制暂存器4. 电子学的节目时钟参考1.生物学的聚合酶链式反应2. 电子信息学的光电导继电器3. 计算机学的程序控制暂存器4. 电子学的节目时钟参考展开1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
分子生物学中的PCR技术
分子生物学中的PCR技术PCR技术是分子生物学中一种非常有用的技术，它可以在短时间内扩增出特定的DNA片段，是分子生物学研究、诊断和治疗中的重要工具。
下面将从PCR技术的原理、应用和进展三个方面来详细探讨这一技术的相关问题。
一、PCR技术的原理PCR技术的核心是一种名为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的方法，它可以通过利用DNA聚合酶在反应过程中不断合成DNA链的特性来扩增出DNA片段。
PCR反应体系中包括DNA模板、DNA聚合酶、两个DNA引物和四种核苷酸等重要成分。
DNA模板是PCR反应的起点，引物（即Primer）可以通过与DNA模板上的序列互补结合并拓展出相应的片段，核苷酸则提供给DNA聚合酶合成新的链所需的碱基。
PCR反应一般分为三个步骤：1. 变性：在高温条件下，将待扩增的DNA模板分离成单链DNA。
这样可以使引物与模板的单链DNA形成配对，为下一步的PCR反应提供充分的材料。
2. 引物结合：在低温条件下，将引物与单链DNA为模板上的序列配对，使引物定位到待扩增的DNA区域。
3. 扩增：在适宜温度下，引物的3'端被DNA聚合酶利用成模板合成的DNA链持续扩增。
重复这三步将会使DNA指数级增加，从而得到该模板DNA片段的扩增产物。
二、PCR技术的应用PCR技术是一种广泛应用于分子生物学中的技术，它的应用范围包括：1. 基因修饰研究：使用PCR技术可以快速识别基因中的突变、插入、缺失或重组事件等，可以被用于基因编辑、基因改造等研究。
2. 病理诊断：PCR技术可以用于细菌、病毒和真菌等病原体的检测，它已经成为许多疾病的快速诊断和筛查技术。
3. 分子鉴定：PCR技术可以用于判断物种间的基因差异，也被广泛应用于DNA鉴定、种族鉴定等领域。
4. 基因表达：PCR技术可以用于从RNA样本中扩增目标基因，从而探究基因调控系统的生物学功能。
5. DNA序列测定：PCR技术可以用于扩增DNA片段后进一步测定其序列，这对于分子生物学的研究和杂交研究有着重要的贡献。
PCR技术
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PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
PCR技术是一种体外模拟自然 技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增 技术是一种体外模拟自然 复制过程的核酸扩增 技术，亦称为无细胞分子克隆技术。 技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条 DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下， 链为模板， 链为模板 在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下， 通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特 聚合酶的酶促作用， 通过耐高温 聚合酶的酶促作用 定的DNA片断。 片断。 定的 片断 简单的讲， 简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而 技术即通过引物延伸核酸的某个区域而 进行的重复双向DNA合成。 合成。 进行的重复双向 合成
PCR技术简介 技术简介
出现假阴性原因： 一.PCR出现假阴性原因： 出现假阴性原因
1．模板因素： ．模板因素： 2．酶失活： 酶失活： 3．引物： ．引物： 4．Mg2+浓度： 浓度： ． 5．反应体积的改变： ．反应体积的改变： 6．物理原因： ．物理原因： 7．靶序列变异： ．靶序列变异：
PCR出现假阴性原因分析及解决方案 模板因素： 模板因素：
退火温度（ ）计算： 退火温度（Tm）计算：
Tm=4(G+C)+2(A+T) G,C,A,T均为单一引物与模板对之间的个数。 均为单一引物与模板对之间的个数。 均为单一引物与模板对之间的个数
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PCR常见问题： 常见问题： 常见问题 出现假阴性； 一.出现假阴性； 出现假阴性 出现假阳性； 二.出现假阳性； 出现假阳性 三.出现非特异性扩增带； 出现非特异性扩增带； 出现非特异性扩增带 四.出现片状拖带或涂抹带。 出现片状拖带或涂抹带。 出现片状拖带或涂抹带
PCR技术
PCR反应系统的组成
• 三、PCR反应系统的组成 • 引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓度 引物经济、特异，但浓度过低，不足以完 成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产 率。
PCR反应系统的组成
• 四、TaqDNA聚合酶的量 • 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl， 常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同 和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的 用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的 增加。由于生产厂家所用兵配方、制造条件以 及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚 合酶性能也有所不同。Cetus公司酶定义是：1 个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃， 30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分 所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺 入量。
电泳分析
• 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情 况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭 （EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备 好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制） 放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分 子量标准品作标记 • 由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在 紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强 80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可 直接观察
原理
• 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、 退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两 条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循 环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板， 每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以 2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循 环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实 际上一般可达106～107倍。
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DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 聚合酶链式反应
实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)
物理原因
变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
工作步骤
标准的PCR过程分为三步： 1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（复性）（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示： 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
发展简史
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
工作原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 聚合酶链式反应
间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。