PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
简述pcr技术的原理步骤及应用
简述pcr技术的原理步骤及应用PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于在体外扩增DNA片段的方法，它以其高度敏感性和高度选择性而在分子生物学和遗传学研究中得到广泛应用。
PCR技术的原理步骤如下：1. 反应体系准备：首先准备PCR反应所需的试剂和设备，包括DNA模板、引物（寡核苷酸引物）、聚合酶酶、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸盐）和缓冲液等。
2. 反应液配置：将引物、dNTPs、缓冲液和DNA模板等按照一定比例加入至反应管或微孔板中，并在最后加入聚合酶酶。
3. Denaturation环节：将反应液置于PCR热循环仪中，将温度升至94-98C，使DNA模板中的两个链分离，形成单链DNA。
4. Annealing环节：将反应液温度调低至50-65C，使引物与单链DNA发生互补结合，引物与模版DNA的两条链的互补碱基序列结合在一起。
5. Extension环节：将反应液温度升至72C，加入聚合酶酶，酶能将反应溶液中的无机盐转化为酶需的金属离子，使扩增反应正常发生，聚合酶引导DNA链延长，在引物的引导下，将缺失的DNA序列补充完整。
6. 反复循环：重复Denaturation、Annealing和Extension环节，通常需进行20-40个周期，以获得足够数量的扩增DNA产物。
PCR技术的应用：1. 分子诊断：PCR可以扩增微生物、病毒和人类遗传疾病相关序列，用于临床诊断。
例如，利用PCR扩增出微生物或病毒的特定序列进行检测，早期发现感染，提高诊断准确性。
此外，PCR也可以用于遗传病的检测，如唐氏综合征、囊性纤维病等。
2. 法医学：PCR可以扩增极微量的DNA，用于犯罪现场DNA检验和亲子鉴定。
通过PCR可以在犯罪现场发现的微量DNA进行扩增，然后与犯罪嫌疑人的DNA进行比对，从而确定嫌疑人。
3. 基因工程：PCR在基因工程中起重要作用。
它可以扩增出具有特定功能的DNA片段，如编码特定蛋白质的基因片段，然后进行进一步的克隆、重组和表达等操作。
PCR技术的原理及操作
104
103 102 阈值
14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle
CT = - k lgX0 + b
CT值
lg 起始DNA浓度
实时荧光定量PCR的原理
熔解曲线:随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线
(来确定不同的反应产物，考察扩增产物是否是目标产物)
1. 随着温度的升高，DNA双链断裂；接着温度降低，到达退火温度的时， DNA双链复性，荧光分子绑定在DNA双链上，所以荧光信号值到达最高 点 接着DNA双链分子由退火温度继续升温，双链断开，DNA分子溶解 当扩增是单一产物的时，即呈现单一的溶解峰，这时，在同样的温度下， 可以认为是产物相同；如果溶解峰不单一，就意味有非特异性扩增
2. 3.
实时荧光定量PCR的原理
扩增曲线
1. 基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近 一条直线，这样的直线即基线。 2. 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域 值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增 的指数期。 3.CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信 号到达设定的域值时所经历的循 环数。起始模板的对数浓度与Ct 呈线性关系，根据样品的Ct值就 可计算出样品中所含的模板量。
实时荧光定量PCR的原理
Ct与初始模板的关系
1. 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时 所需要的循环数(Ct 值)越少 2. 各模板的CT值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关系，起始拷 贝数越多，CT值越小，反之亦然。
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理PCR简介聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA 序列。
它通过不断的循环反应，迅速大量复制目标DNA，从而能够快速获取足够的起始模板用于后续的实验。
PCR具有高效、敏感、特异性强等优点，在基因工程、医学诊断和犯罪鉴定等领域得到广泛应用。
PCR步骤和方法PCR主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
这三个步骤通过循环反应，反复进行以达到目标DNA扩增的目的。
1.变性（Denaturation）：在高温条件下（通常为94-98°C），双链DNA被迅速分离成两条单链DNA。
这被认为是PCR反应的起始步骤，使得目标DNA的两个互补链分开，为后续的PCR步骤提供单链DNA模板。
2.退火（Annealing）：降温至50-65°C的退火温度，引入特异性引物（primers），使其与目标DNA序列上的两个互补区域发生配对。
引物是短寡核苷酸序列，用于定位目标序列的起始和终止位置。
3.延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）以引物为起点，沿模板链的互补链合成新的DNA链。
延伸速率通常为60-100 bp/分钟。
以上三个步骤完成后，产生的DNA分子会成为下一轮PCR反应的起始模板。
每个PCR循环通常需要几十秒到几分钟的时间。
PCR的方法可以进一步分为常规PCR、荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）等。
PCR实验过程以下是PCR在实验室内的基本步骤：1.提取DNA：从待检测的样品（如血液、组织等）中提取目标DNA。
这一步需要遵循相应的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2.准备反应体系：将PCR反应所需的各种试剂按比例加入反应管中。
通常，反应体系包括目标DNA、引物、核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
3.PCR反应：将反应管置于PCR仪中，按照设定的PCR程序进行反应。
PCR原理及技术操作
PCR原理及技术操作PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种用于在体外扩增DNA分子的分子生物学技术。
它是通过模拟自然界中DNA复制过程，通过加热DNA双链，使其解链，并利用DNA聚合酶酶催化的DNA合成反应，扩增目标DNA片段。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高扩增效率等优点，适用于从少量DNA样本中寻找目标DNA序列。
PCR反应需要如下基本组成：1.DNA模板：待扩增的DNA样本，可以是基因组DNA或经过提取和纯化的特定DNA片段。
2. 引物（Primer）：由DNA聚合酶合成的DNA片段，分为前向引物和反向引物，用于指导DNA合成的起始点，其序列与待扩增DNA序列的两端相互衔接。
3. DNA聚合酶：如Taq聚合酶，能耐高温的DNA聚合酶，用于催化DNA链合成反应。
4.二进制核苷酸三磷酸（dNTPs）：构成扩增产物的碱基单元，包括脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸、脱氧鸟苷酸和脱氧胞苷酸。
5.缓冲液：维持PCR反应体系的适宜pH值，提供离子环境和酸碱平衡，一般还含有Mg2+离子，以促进引物与DNA模板的结合。
1. 变性（Denaturation）：将PCR反应体系加热至95-98℃，使DNA双链解链为两条单链。
此步骤通常持续15-60秒，使DNA双链中的氢键断裂，两条链分离为单链。
2. 退火（Annealing）：将PCR反应体系降温至50-65℃，使引物特异性结合在目标DNA的两端，形成引物-模板DNA复合物。
此步骤通常持续15-60秒，允许引物以特异性碱基互补原则与目标DNA序列的两个端点结合。
3. 延伸（Extension）：将PCR反应体系升温到72℃，使Taq聚合酶在引物的模板DNA上逐个加入dNTPs，合成新的DNA链。
此步骤通常持续1-4分钟，将Taq聚合酶运动到引物-模板DNA复合物的末端，并以引物为起点将dNTPs加入到新DNA链中。
Taq聚合酶具有耐高温的性质，能在高温下工作。
PCR技术及原理
PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理一、PCR反应成分：1、模板DNA；2、引物；3、四种脱氧核糖核苷酸；4、DNA聚合酶；5、反应缓冲液、Mg2+等。
二、PCR反应基本步骤：1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
PCR扩增的基本方法PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100μl一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。
二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。
pcr技术的基本原理和过程
pcr技术的基本原理和过程
PCR技术（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，
用于扩增DNA（或RNA）片段。
其基本原理和过程如下：
1. 反应体系准备：将待扩增的DNA样本加入PCR反应体系中，该体系包含目标DNA片段的引物（一对寡核苷酸序列，通过
碱基互补与目标序列结合），dNTPs（四个二脱氧核苷三磷酸，即A、T、C、G，作为DNA合成的原料），聚合酶（如Taq
聚合酶，用于DNA合成），缓冲液（维持反应体系的酸碱度）和辅助剂（如MgCl2，用于聚合酶的活性）等。
2. Denaturation（变性）：将反应体系加热到95-98°C，使
DNA双链分离，即将DNA分子的两条链解开，得到单链
DNA模板。
3. Annealing（退火）：将反应体系冷却到50-65°C，使引物与DNA模板的互补序列结合。
引物通过与DNA模板互补配对，指定了从引物的起始点开始合成新DNA链的方向。
4. Extension（延伸）：将反应体系加热到72°C，使聚合酶在
引物的作用下合成DNA链。
聚合酶按照引物的互补序列从3'
到5'方向合成新的DNA链，并且以原有DNA模板为模板。
5. 循环反应：上述三个步骤（Denaturation、Annealing和Extension）组成了一个循环，每个循环产生一个新的DNA链。
一般需要经历20-40个循环，数目取决于所需的扩增倍数。
通过PCR技术，可以在短时间内从少量的DNA样本中扩增大量目标DNA片段，其应用广泛，包括基因检测、遗传学研究、疾病诊断等领域。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤PCR技术原理及步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种分子生物学技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增出足够多的DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术之一。
本文将介绍PCR技术的原理及步骤。
一、PCR技术原理。
PCR技术是通过DNA聚合酶（DNA polymerase）在一系列温度循环中，不断地复制DNA片段，从而实现DNA的扩增。
其基本原理如下：1. 双链DNA解旋，首先将DNA样本加热至94-98°C，使双链DNA解旋成两条单链DNA。
2. 引物结合，将温度降低至50-65°C，引物（primers）与单链DNA互相结合，为DNA聚合酶提供复制的起点。
3. DNA聚合，将温度升高至72°C，DNA聚合酶开始复制DNA片段，合成新的DNA链。
通过这样的温度循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
二、PCR技术步骤。
1. 样本处理，首先需要从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2. 引物设计，根据目标DNA序列设计引物，引物的选择对PCR扩增的效果至关重要。
3. PCR反应体系配置，配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等成分。
4. PCR扩增，将反应体系置于PCR仪中，进行一系列温度循环，完成DNA的扩增。
5. PCR产物分析，通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析，验证扩增效果。
三、PCR技术应用。
PCR技术在分子生物学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用。
例如，可以用于基因克隆、基因突变分析、病原微生物检测等。
总之，PCR技术作为一种快速、高效的DNA扩增技术，已经成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具之一。
掌握PCR技术的原理及步骤，对于开展相关实验和研究具有重要的意义。
以上就是关于PCR技术原理及步骤的介绍，希望对您有所帮助。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。
自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。
通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。
2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。
三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。
2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。
六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。
2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。
3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。
4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。
5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。
七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。
可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。
PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
聚合酶链式反应（PCR）原理DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性- 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
PCR技术的种类、原理与应用
PCR技术的种类、原理与应用引言PCR技术（聚合酶链反应）是分子生物学中一种基本且重要的实验技术。
利用PCR 技术，科学家们可以在短时间内扩增DNA片段，从而大大提高了基因分析和遗传学研究的效率。
本文将介绍PCR技术的种类、原理以及一些常见的应用。
PCR技术的种类PCR技术根据反应方式不同可分为常规PCR、荧光PCR、逆转录PCR等几种。
常规PCR常规PCR是最基本的PCR技术。
它包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链解旋成为两条单链。
在退火步骤中，引物与DNA模板结合，确定扩增片段的起始和终止位置。
在延伸步骤中，聚合酶沿DNA模板逐渐合成新的DNA链。
荧光PCR荧光PCR是在常规PCR的基础上增加了一层荧光信号的监测。
通过引入荧光探针或荧光引物，可以实时监测PCR反应的进程。
当荧光探针与PCR产物结合时，会发出荧光信号，可以通过荧光检测仪器实时监测PCR反应的进行情况。
逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是在PCR的基础上结合逆转录反应的一种技术。
逆转录反应可以将RNA转录为相应的DNA，然后再进行PCR扩增。
逆转录PCR广泛用于研究基因的表达和检测病毒感染等。
PCR技术的原理PCR技术基于DNA的复制原理，利用DNA聚合酶酶解DNA链，并通过引物的引导选择性复制目标DNA序列。
PCR技术主要包括以下步骤：1.变性：将DNA加热至高温，使其双链解旋成为两条单链。
2.退火：将温度降低，使引物与DNA模板结合，形成引物-模板复合物。
3.延伸：引入DNA聚合酶，该酶以引物为模板，在复合物的基础上合成新的DNA链。
4.循环：重复以上步骤，每次循环都会产生新的DNA链，从而呈指数级增长。
PCR技术的核心是引物的选择，引物的两个端部分别与目标DNA序列的起始和终止位置互补匹配。
引物的长度通常为15-30个碱基。
PCR技术的应用PCR技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
基因分析PCR技术可以扩增目标DNA片段，为后续的基因分析提供了充足的材料。
PCR原理及其操作
PCR原理及其操作PCR（聚合酶链式反应）是一种被广泛使用的生物技术方法，用于扩增DNA片段或进行DNA定量分析。
PCR的发明者是美国化学家Kary B. Mullis，他于1983年首次提出这个方法，并因此于1993年获得了诺贝尔化学奖。
PCR的原理基于DNA的复制过程，在PCR反应中，DNA的两个单链被分离，然后通过特定的引物（primer）与DNA的末端配对，最终通过DNA 聚合酶酶活性的作用，合成出两个新的DNA双链。
这个过程可以被循环进行多次，每一轮扩增的DNA片段都是前一轮扩增的产物，因此可以在相对短的时间内产生数以百万计的DNA拷贝。
PCR的操作步骤如下：1.DNA样本准备：首先需要从待扩增的组织或细胞中提取DNA样本。
DNA的纯度和浓度对PCR的成功至关重要。
2. 混合PCR反应体系：PCR反应的混合体系通常由以下成分组成：DNA模板，引物（primer），四种单核苷酸（dNTPs），PCR反应缓冲液，Mg2+离子和DNA聚合酶。
3.反应条件设置：PCR反应的温度和时间条件的设定对于产生特定的扩增产物非常重要。
反应条件通常分为三个步骤：变性、退火和扩增。
-变性：将混合体系加热至高温（通常为94-98°C），使得DNA双链变性为两个单链。
-退火（引物结合）：将反应体系降低至合适的温度（通常为50-65°C），使引物与目标DNA片段的特异性序列互补结合。
-扩增（DNA合成）：将反应体系升温至DNA聚合酶的最适工作温度（通常为72°C），此时DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
4.PCR循环：以上三个步骤组成了一次PCR循环，每一个循环可以扩增出目标序列的两倍。
通过不断重复PCR循环，可以快速扩增目标序列。
5.PCR结束和分析：扩增反应可以持续多个PCR循环，具体取决于所需扩增的片段长度和样品初始的DNA浓度。
PCR反应结束后，扩增产物可以通过凝胶电泳、定量PCR等方法进行分析和鉴定。
pcr实验原理和基本步骤
pcr实验原理和基本步骤PCR（聚合酶链反应）是一种体外的DNA复制技术，能够在小时级内扩增目标DNA片段，从而获得大量的DNA。
PCR由酶聚合酶、引物、DNA模板和适宜条件的缓冲液等组成。
其原理是通过循环性的反应过程，不断复制DNA模板，实现目标DNA的扩增。
PCR的基本步骤可分为以下几个步骤：1. 样品制备：将待扩增的DNA样品提取纯化，并定量测定其浓度。
合适的DNA 样品浓度对于PCR的成功至关重要。
2. 引物设计：根据目标DNA序列，设计合适的引物。
引物通常由18-25个碱基组成，具有反向互补性，并固定于待扩增的DNA的两侧。
3. PCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和适当的离子浓度。
还可以添加一些辅助试剂，如DNA胶原、DMF和BSA等，以提高PCR的效率和特异性。
4. 反应条件：PCR反应一般包括三个温度阶段：变性、退火和延伸。
变性阶段（94-96）使DNA双链解开，退火阶段（50-65）使引物与目标DNA序列结合，延伸阶段（72）使聚合酶合成新的DNA链。
5. PCR循环：将PCR反应体系置于热循环仪中，进行多次的PCR循环。
每个循环包括变性、退火和延伸，一个PCR循环的时间通常在2-5分钟之间。
6. 聚合酶链反应产物分析：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以根据DNA片段的大小，进行DNA分离和可视化。
PCR的原理是通过酶聚合酶将DNA在适宜条件下进行循环反应，不断复制DNA 模板。
主要分为变性、退火和延伸三个阶段。
1. 变性阶段：将PCR反应体系加热到94-96，使DNA双链解开成为单链DNA。
2. 退火阶段：降低反应体系的温度至50-65，使引物与目标DNA序列结合。
引物通常由18-25个碱基组成，具有反向互补性，并固定于待扩增的DNA的两侧。
3. 延伸阶段：将反应体系温度升至72，使聚合酶开始合成新的DNA链。
PCR的原理和操作过程
PCR的原理和操作过程PCR是一种在分子生物学中广泛使用的技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增大量DNA。
PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），它是由美国科学家基利斯与生物技术先驱的名字关联而来。
PCR基本原理：PCR的基本原理是通过反复进行三个步骤的循环反应，这三个步骤是：变性、退火和延伸。
通过这个循环过程，每一轮的PCR会在每个目标DNA分子的两端复制一个新的DNA分子，这样反复迭代多次，就可以在短时间内从一个DNA分子扩增出大量DNA。
PCR的操作过程：PCR技术主要涉及到以下步骤：DNA提取、PCR反应体系的制备、PCR循环反应、分析PCR产物。
1.DNA提取：PCR的第一步是从所需的生物样品中提取DNA。
这涉及到细胞破碎和DNA分离的过程，常用方法有酚/氯仿法和商业DNA提取试剂盒。
DNA提取的目的是获取纯度高、浓度适中的DNA样本。
2.PCR反应体系的制备：制备PCR反应需要购买PCR试剂盒，并根据试剂盒的指南来配制反应液。
PCR反应液包括模板DNA、聚合酶、引物、核苷酸、Mg2+ 离子和缓冲液。
聚合酶一般使用DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
引物是用于选择DNA特定区域的两个短DNA片段，引物设计的合理性直接影响PCR扩增的结果。
3.PCR循环反应：PCR循环反应是PCR的核心步骤。
它主要包括三个不同的温度区域：变性区域、退火区域和延伸区域。
PCR每个循环包括以下步骤：- 变性（Denaturation）：将PCR反应体系加热至95-98摄氏度，使双链DNA解链为两个单链DNA。
- 退火（Annealing）：将PCR反应体系降温至40-65摄氏度，使引物与模板DNA的互补序列结合。
- 延伸（Extension）：将PCR反应体系升温至72摄氏度，使DNA聚合酶从引物的3'端延伸合成新的DNA链。
这个步骤称为延伸或扩增。
以上三个步骤组成了PCR的一个循环，一个完整的PCR反应通常包含25-35个循环。
高中生物pcr技术知识点
高中生物pcr技术知识点PCR技术作为分子生物学中的重要工具，在高中生物教学中也占有一席之地。
本文将从PCR技术的原理、步骤、应用以及注意事项等方面进行介绍。
一、PCR技术的原理PCR技术的核心是聚合酶链式反应，简称PCR。
PCR技术利用DNA聚合酶在高温下对DNA模板进行反复扩增，从而从极少量的DNA样本中扩增出足够多的目标序列，以便于后续检测和分析。
PCR反应主要由三步组成：变性、退火和延伸。
变性可以使DNA 双链解开成两条单链，退火可以使引物与模板DNA结合，延伸可以使引物在模板上逐渐合成新链。
二、PCR技术的步骤PCR技术主要包括反应体系的准备、PCR反应、PCR产物检测和分析四个步骤。
1. 反应体系的准备PCR反应需要准备PCR反应体系，反应体系包括PCR模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液、水等多个组分。
其中，PCR模板DNA是PCR反应的起点，引物是PCR反应的关键，dNTPs是PCR反应的原料，聚合酶是PCR反应的催化剂，缓冲液是PCR反应的稳定剂，水是PCR反应的溶剂。
2. PCR反应PCR反应是PCR技术的核心步骤，PCR反应需要按照一定的温度和时间进行。
PCR反应一般包括变性、退火和延伸三个阶段。
变性阶段一般在94-98℃进行，可以使DNA双链解开成两条单链；退火阶段一般在50-60℃进行，可以使引物与模板DNA结合；延伸阶段一般在72℃进行，可以使引物在模板上逐渐合成新链。
3. PCR产物检测和分析PCR产物检测和分析是PCR技术的重要步骤，PCR产物的检测和分析一般包括凝胶电泳、荧光定量、序列分析等多个方面。
凝胶电泳是PCR产物检测和分析的基础，可以将PCR产物按照大小进行分离；荧光定量可以对PCR产物进行定量分析；序列分析可以对PCR产物进行序列测定和分析。
三、PCR技术的应用PCR技术在分子生物学、医学、环境科学、食品检测等多个领域都有广泛的应用。
在分子生物学领域，PCR技术可以用于基因克隆、基因检测、基因表达等多个方面；在医学领域，PCR技术可以用于病原菌检测、基因诊断、药物筛选等多个方面；在环境科学领域，PCR技术可以用于微生物检测、水质检测、土壤检测等多个方面；在食品检测领域，PCR技术可以用于食品安全检测、品种鉴定等多个方面。
PCR技术原理与过程
PCR技术原理与过程PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA（脱氧核糖核酸）的技术，可以快速、高效地产生大量特定DNA序列。
其原理是通过反复性的DNA复制，扩增目标DNA片段。
PCR技术的原理基于DNA复制的自然过程，但在体外进行了精确控制和放大。
简单来说，PCR技术可以分为三个主要步骤：变性（denaturation），引物结合（annealing），和扩增（extension）。
1. 变性（denaturation）：PCR首先通过升高温度将反应管中的DNA两链分离，使得两条DNA链变为单链。
这一步一般在94-98°C的高温下进行，DNA的高温变性使DNA链中的氢键断裂，使两条链分离。
2. 引物结合（annealing）：在下一个步骤中，反应温度被降低至48-65°C的合适温度，使引物（primers）能够与目标DNA序列的特定部分配对结合。
引物是两段具有20-30个碱基的DNA片段，它们的序列与目标DNA序列的两个末端互补。
这样的引物结合可以使引物定向选择性地结合到目标DNA的两侧。
这是决定PCR中目标序列准确性的一个关键步骤。
3. 扩增（extension）：一旦引物与目标DNA配对结合，扩增步骤就会开始。
在这一步骤中，反应温度升高至72°C，这是大多数DNA聚合酶的活性适宜的温度。
此时，酶复合物会沿着DNA模板链进行多轮DNA扩增，通过合成新的DNA链。
在这个过程中，DNA聚合酶依据模板链上的碱基进行DNA合成，并走向模板链的末端。
这样，生成了两条新的DNA链，每一条都是目标序列的镜像复制。
整个反应会多次循环进行，每一次循环都会产生指数级增加的DNA复制产物。
通过PCR技术的多个循环，可以产生大量目标DNA的复制产物。
理论上，PCR技术可以在几小时内从一份DNA样本中扩增成百上千倍的目标DNA序列。
PCR技术在基因工程、医学诊断、法医学和生物研究等领域具有广泛的应用。
PCR技术整个流程
PCR技术整个流程概述聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外复制DNA的重要技术，它能够在较短时间内大量复制特定DNA片段。
PCR技术广泛应用于医学、法医学、农业科学和生物学研究等领域。
本文将介绍PCR技术的整个流程，包括所需试剂和设备、反应步骤等。
所需试剂和设备•DNA模板：待扩增的DNA片段。
•引物（Primers）：两个与DNA模板序列相互补充的寡核苷酸序列。
•DNA聚合酶：如Taq聚合酶，具有耐高温特性。
•脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dTTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）和脱氧胞苷酸（dCTP）。
•缓冲液：钠离子、镁离子等离子平衡反应环境。
•试管或PCR反应管：用于混合反应物的容器。
•PCR仪：用于控制反应温度的仪器。
PCR反应步骤1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA分子的双链解开，形成单链DNA。
2.Annealing（退火）：将PCR反应体系温度降低至50-65℃，使引物与DNA模板的目标序列互相结合，形成引物-模板复合物。
3.Extension（延伸）：将PCR反应体系温度调节至72℃，在这一温度下，DNA聚合酶以引物为模板，向3’端方向合成新的DNA链，形成双链DNA。
4.循环反应：通过反复进行变性、退火和延伸步骤，扩增DNA分子的数量。
每个PCR循环可以产生指数级增加的目标DNA序列。
5.延伸步骤时间：延伸步骤的时间根据所需扩增的DNA片段长度和DNA聚合酶的活性进行调控，通常为30秒至3分钟。
PCR结果分析PCR反应结束后，产生的扩增产物可通过多种方法进行分析： 1. 琼脂糖凝胶电泳检测：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶孔中，通过电泳使DNA分子在凝胶中迁移，从而确定DNA片段的大小。
2. 实时荧光定量PCR：通过添加一种荧光染料，实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，可以定量分析初始模板的数量。
pcr技术的原理和步骤
pcr技术的原理和步骤一、前言PCR技术（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA片段，从而使其数量呈指数级增长。
PCR技术的原理和步骤对于分子生物学研究者来说非常重要。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理是利用DNA聚合酶，在高温条件下将DNA模板复制成多个同样的DNA片段。
PCR反应需要三个主要组分：模板DNA、引物和聚合酶。
1. 引物引物是一小段单链DNA序列，它与待扩增的目标序列互补配对，可以作为起始点启动扩增反应。
通常需要设计两个引物，一个称为前向引物（Forward primer），另一个称为反向引物（Reverse primer）。
它们分别位于待扩增序列的两端，并且是互补配对的。
当这两个引物结合到待扩增序列上时，就形成了一个完整的PCR模板。
2. 聚合酶聚合酶是一种特殊类型的酶，在高温条件下能够读取DNA模板并将新核苷酸加入正在生长中的新链中。
聚合酶的最常用类型是Taq聚合酶，它来源于一种热喜好性细菌，可以在高温下保持稳定。
3. PCR反应步骤PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
（1）变性PCR反应开始时，将PCR管中的混合物加热到95℃，使DNA双链分离成两条单链。
这个过程称为变性。
此时，模板DNA和引物都变成了单链状态。
（2）退火然后将温度降低到50-60℃，引物与模板DNA序列互补配对并结合在一起。
这个过程称为退火。
（3）延伸最后将温度升高到72℃，Taq聚合酶开始读取模板DNA，并在每个引物的末端加入新核苷酸以扩增新链。
这个过程称为延伸。
每次循环后，扩增产物数量都会呈指数级增长。
三、PCR技术的步骤PCR技术的步骤主要包括以下几个方面：1. 样品制备首先需要从样品中提取出目标DNA片段，并纯化获得高质量的DNA样品。
通常使用化学方法或机械方法进行DNA提取和纯化。
2. 引物设计根据待扩增的目标序列，设计出一对互补配对的引物。
pcr的原理和步骤
pcr的原理和步骤PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速、特异地扩增DNA片段。
PCR技术的发明为分子生物学研究和临床诊断提供了重要工具，被广泛应用于基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定、病原体检测等领域。
本文将详细介绍PCR的原理和步骤。
一、PCR的原理。
PCR技术的原理主要包括DNA的变性、引物的结合、DNA的合成三个步骤。
首先是DNA的变性。
PCR反应液中的DNA双链在高温下（一般为94-98℃）会解旋成两条单链，使得引物能够结合到目标序列上。
其次是引物的结合。
在PCR反应中，需要加入两种引物，它们分别结合到目标序列的两端，并指导DNA聚合酶进行DNA合成。
最后是DNA的合成。
在引物的引导下，DNA聚合酶开始合成新的DNA链，生成两条新的双链DNA。
二、PCR的步骤。
PCR反应一般包括变性、引物结合和DNA合成三个步骤，具体步骤如下：1. 变性，将PCR反应管放入热循环仪中，进行变性步骤。
一般的变性温度为94-98℃，时间为1-3分钟。
2. 引物结合，降温至引物的结合温度，一般为50-65℃，使引物与目标序列结合。
这一步是为了让引物与目标序列进行特异性结合，避免非特异性扩增。
3. DNA合成，将温度升至DNA聚合酶的最适工作温度，一般为72℃，进行DNA合成。
DNA聚合酶会在引物的引导下合成新的DNA 链。
以上就是PCR的基本步骤，通过不断重复这三个步骤，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
三、总结。
PCR技术的原理和步骤相对简单，但是需要严格控制反应条件和引物设计，以确保扩增的特异性和准确性。
在实际操作中，还需要注意反应管的材料选择、反应体系的配制、反应条件的优化等方面的问题。
希望本文对PCR技术的原理和步骤有所帮助，能够更好地理解和应用PCR技术。
PCR的原理操作步
PCR的原理操作步PCR（聚合酶链反应）是一种通用的、高度敏感和特异性的DNA扩增技术，可以将微量的DNA片段增加至数量足够进行进一步分析。
它常被用于DNA测序、基因突变检测、分子标记和基因表达研究等领域。
PCR的操作步骤：PCR的操作步骤主要包括：DNA模板准备、引物设计、反应液配置、PCR扩增、PCR产物分析等。
1.DNA模板准备：首先，需要将目标DNA模板提取出来。
可以使用多种方法提取DNA，如酚氯仿法、磁珠法等。
2.引物设计：接下来，根据所需扩增的目标序列，设计两条引物，即外层引物和内层引物。
外层引物位于目标序列所在的区域外，而内层引物位于外层引物内，两个引物之间的距离通常为100-300bp。
引物的设计需要考虑特异性和互补性，以确保扩增的特异性。
3.反应液配置：将PCR反应体系配置好。
一般来说，PCR反应需要包含DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和Mg2+离子等组分。
配置过程中需要注意维持反应液的无菌环境，以防止污染。
4.PCR扩增：将反应液加入PCR扩增管，并将管盖密封。
然后，将PCR扩增管放入热循环仪（thermal cycler）中进行扩增。
扩增过程通常包括三个主要的温度阶段：变性、引物结合和延伸。
a.变性：将PCR反应体系加热至95°C，以使DNA融解为单链。
b.引物结合：将PCR反应体系降温至目标序列的熔点温度，使引物与DNA的目标序列结合。
c.延伸：在适合引物结合的温度下，加入DNA聚合酶，通过延伸反应将新DNA链合成。
延伸反应的温度和时间根据所用的DNA聚合酶而异。
这三个步骤按照一定的循环次数进行连续反复，可在短时间内产生大量相同的DNA产物。
通常，PCR扩增循环次数为25-35次。
5.PCR产物分析：PCR反应后，可以对扩增产物进行分析。
通常使用琼脂糖凝胶电泳分析，通过电场将DNA片段分离。
分离后，可以用DNA染色剂（如溴化乙啶）染色，并通过紫外线照射观察DNA的条带。
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聚合酶链式反应（PCR）原理DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性- 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
（3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。
在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。
应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。
若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。
为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。
这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。
这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。
（6）多重PCR技术(multiplex PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。
主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。
平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。
进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。
由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA 片段供分析、监测。
反应五要素--- 引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计？①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。
【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）DNA聚合酶：目前有两种T aq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR 产物的产量。
（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低T aq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RT-PCR -- 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
①总RNA提取（-70℃保存）Trizol法：1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4℃，离心12000 rpm，15min5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min6、4℃，离心12000 rpm，10min7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合8、4℃，离心7500 rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水+ 5ul RNA总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml= OD260×40×150 ug/ml= OD260×6 ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。