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实验八血清学实验PPT幻灯片
【实验目的】
❖ 掌握人体血型的测定方法，同时了解 自己的血型
❖ 观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型 鉴定的原理
❖ 熟悉沉淀反应中双向免疫扩散、对流 电泳和免疫比浊的原理、操作方法和 用途
【实验原理】
❖ 一、凝集反应
❖ 血型是指红细胞的血型，是根据红细胞膜 外表面存在的特异性抗原（镶嵌于红细胞 膜上的糖蛋白和糖脂）来确定的，这种抗 原或凝集原是由遗传决定的。
❖ 停止电泳后，在与电泳方向平行的槽内加入 相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，已 分离的各抗原与相应抗体在琼脂中扩散而相 遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的沉淀 弧。
【注意事项】
❖ 采血时注意消毒，采血针不可混用，避免污 染。
❖ 抗体和红细胞混合后，应即刻混匀，避免红 细胞粘附板底，影响凝集的观察。
❖ 抗体或凝集素存在于血清中，它与红细胞 的不同抗原起反应，发生凝集，最后溶解。 由于这种现象，临床上输血必须提前验血 型，以确保输血安全。
❖ 二、沉淀反应
❖ 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应机体结合后出现沉淀物，此类 反应称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉 淀原，与沉淀原发生反应的抗体叫沉淀素。
❖ 1、免疫扩散
❖ 根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗 体进行定性分析，也可用于抗体的半定量检 测。
○○ ○
三孔型
○○ ○○
双排孔型
○○
双孔型
○
❖ 免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散 相结合的免疫化学分析技术。
❖ 先将抗原样品在琼脂平板上进行电泳，使其 中的各种成分因电泳迁移率的不同而被分离 成肉眼不可见的区带。
❖ 掌握人体血型的测定方法，同时了解 自己的血型
❖ 观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型 鉴定的原理
❖ 熟悉沉淀反应中双向免疫扩散、对流 电泳和免疫比浊的原理、操作方法和 用途
【实验原理】
❖ 一、凝集反应
❖ 血型是指红细胞的血型，是根据红细胞膜 外表面存在的特异性抗原（镶嵌于红细胞 膜上的糖蛋白和糖脂）来确定的，这种抗 原或凝集原是由遗传决定的。
❖ 停止电泳后，在与电泳方向平行的槽内加入 相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，已 分离的各抗原与相应抗体在琼脂中扩散而相 遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的沉淀 弧。
【注意事项】
❖ 采血时注意消毒，采血针不可混用，避免污 染。
❖ 抗体和红细胞混合后，应即刻混匀，避免红 细胞粘附板底，影响凝集的观察。
❖ 抗体或凝集素存在于血清中，它与红细胞 的不同抗原起反应，发生凝集，最后溶解。 由于这种现象，临床上输血必须提前验血 型，以确保输血安全。
❖ 二、沉淀反应
❖ 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应机体结合后出现沉淀物，此类 反应称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉 淀原，与沉淀原发生反应的抗体叫沉淀素。
❖ 1、免疫扩散
❖ 根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗 体进行定性分析，也可用于抗体的半定量检 测。
○○ ○
三孔型
○○ ○○
双排孔型
○○
双孔型
○
❖ 免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散 相结合的免疫化学分析技术。
❖ 先将抗原样品在琼脂平板上进行电泳，使其 中的各种成分因电泳迁移率的不同而被分离 成肉眼不可见的区带。
血清型与红细胞酶型ppt课件
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新生儿出生时带有母体的Ig,在此期间与母亲有相 同的同种异型，约出生后6个月产生自己的Ig，表 现出自己的同种异型因此，亲子鉴定查同种异型 要求受检者出生6个月以上
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五、免疫球蛋白同种异型分类
• 同种型（isotype）：种属特异性标志 • 同种异型（allotype）：个体特异性标志
其他
• • • • • 转铁蛋白型 碱性磷酸酶型 结合珠蛋白型 低密度脂蛋白型 拟胆碱酯酶型
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二 红细胞酶型
• 红细胞酶型是红细胞多态性同工酶个体 间的遗传差异。同工酶是指能催化相同 的化学反应，但蛋白质分子结构不同的 一类酶。 • 红细胞酶对底物具有高度专一催化作用 ，受遗传基因所控制。它广泛存在于人 体的组织、器官、细胞和体液中
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Lyon假说
• 其内容主要是：
• （1）正常雌性哺乳动物体细胞中的两个染色体之 一在遗传性状表达上是失活的；（被称为巴氏小体）
•
•
（2）在同一个体的不同细胞中，失活的X染色体 可来源于雌性亲本，也可来源于雄性亲本；
（3）失活现象发生在胚胎发育的早期，一旦出现 则从这一细胞分裂增殖而成的体细胞克隆中失活的都 是同一来源的染色体。如XXY、XXYY有？个巴氏小 体，而XXX、XXXY有？个巴氏小体等。 无忧PPT整理发布
• 独特型（idiotope）：免疫调节网络
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同种型(isotype):同一物种内所有 个体共同具有的Ig抗原特异性结构
• 同种型Ig的抗原决定簇存在于CH、CL • 据CH的不同，Ig分类、亚类 • 据CL的不同，Ig分型、亚型
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新生儿出生时带有母体的Ig,在此期间与母亲有相 同的同种异型，约出生后6个月产生自己的Ig，表 现出自己的同种异型因此，亲子鉴定查同种异型 要求受检者出生6个月以上
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五、免疫球蛋白同种异型分类
• 同种型（isotype）：种属特异性标志 • 同种异型（allotype）：个体特异性标志
其他
• • • • • 转铁蛋白型 碱性磷酸酶型 结合珠蛋白型 低密度脂蛋白型 拟胆碱酯酶型
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二 红细胞酶型
• 红细胞酶型是红细胞多态性同工酶个体 间的遗传差异。同工酶是指能催化相同 的化学反应，但蛋白质分子结构不同的 一类酶。 • 红细胞酶对底物具有高度专一催化作用 ，受遗传基因所控制。它广泛存在于人 体的组织、器官、细胞和体液中
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Lyon假说
• 其内容主要是：
• （1）正常雌性哺乳动物体细胞中的两个染色体之 一在遗传性状表达上是失活的；（被称为巴氏小体）
•
•
（2）在同一个体的不同细胞中，失活的X染色体 可来源于雌性亲本，也可来源于雄性亲本；
（3）失活现象发生在胚胎发育的早期，一旦出现 则从这一细胞分裂增殖而成的体细胞克隆中失活的都 是同一来源的染色体。如XXY、XXYY有？个巴氏小 体，而XXX、XXXY有？个巴氏小体等。 无忧PPT整理发布
• 独特型（idiotope）：免疫调节网络
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同种型(isotype):同一物种内所有 个体共同具有的Ig抗原特异性结构
• 同种型Ig的抗原决定簇存在于CH、CL • 据CH的不同，Ig分类、亚类 • 据CL的不同，Ig分型、亚型
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第九章血清学反应 58页PPT文档
补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相 结合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。
补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反 应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏
膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检
验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或
抗体是否存在。
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二、溶解试验
9/5/2019
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9/5/2019
36
（正向）间接凝集反应原理示意图
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37
（反向）间接凝集反应原理示意图
9/5/2019
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间接凝集抑制反应原理示意图
A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原
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第四节 与补体有关的试验
一、补体的性质
补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。
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特点：简便、敏感性低、耗时、应用最 广
用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血 清效价的测定，抗原组分的分析及传 染病的诊断等，如马传染性贫血病的 诊断。
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第三节 凝集试验
细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的 抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮 片状团块，这种试验称为凝集试验 （Agglutiation test）。
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19
一 液相沉淀试验
1．环状沉淀试验
原理：试管内，下层沉淀素与上层
沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。
用途：检测皮毛中的炭疽
杆菌抗原（Ascoli试验）
2．絮状沉淀试验
抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗
原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒
EMG检查的应用PPT幻灯片课件
1. 熟悉解剖知识及详细的NS检查 2. 掌握适应症: 前角细胞以下病变 3.了解禁忌症: (1) 出血倾向、血友
病、血小板<3000；(2) 乙肝（重 复针电极）；(3) HIV (+)
5
常规EMG检查的临床意义
发现临床下病灶或易被忽略的病变（肥胖儿 童)
诊断和鉴别诊断（N源性、M源性和NMJ 损 害）
３. 高频RNS 频率：和包括10 c/s 持续时间：3 ~ 20 秒 正常值：↓< 30％；↑> 56％为可疑；>100％为异常 意义：诊断前膜病变如肌无力综合征和肉毒中毒
20
F波产生的机制 3. Ｆ潜期的组成和特点： 兴奋逆行至前角细胞的时间 突触传递时间 (1ms) 顺行冲动到达肌纤维的时间 F波的特点：重复刺激波形、潜伏期变异很大 4. Ｆ波的测定：计算机有现成的程序 电极的放置：记录电极同MCV；刺激电极放置与MCV相反 潜伏期的定：10-20个连续Ｆ波平均计算 出现率（Ｆ－Persistence)：80-100% F波的正常值：上肢：26 ms左右；下肢：48 ms左右
19
RNS技术
1．常用的神经 面神经：刺激—耳前 记录—眼轮匝肌 腋神经：刺激—Erb’点 记录—三角肌 尺神经：刺激—腕 记录—小指展肌 副神经：刺激—胸锁乳突肌后缘；记录—斜方肌 ２. 低频RNS 频率：5 c/s（大部分病人能忍受） 计算：第4、5波比第1波波幅下降的百分比 正常值：国外↓8%或10%，我室↓15% 意义：诊断MG
是一个或几个MUAPs的重复放电，伴皮下肌肉蠕动。
意义：见于面肌痉挛、脑干胶质细胞瘤、MS、GBS、放射性神经病特别是神经 丛的损害及低钙等
病、血小板<3000；(2) 乙肝（重 复针电极）；(3) HIV (+)
5
常规EMG检查的临床意义
发现临床下病灶或易被忽略的病变（肥胖儿 童)
诊断和鉴别诊断（N源性、M源性和NMJ 损 害）
３. 高频RNS 频率：和包括10 c/s 持续时间：3 ~ 20 秒 正常值：↓< 30％；↑> 56％为可疑；>100％为异常 意义：诊断前膜病变如肌无力综合征和肉毒中毒
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F波产生的机制 3. Ｆ潜期的组成和特点： 兴奋逆行至前角细胞的时间 突触传递时间 (1ms) 顺行冲动到达肌纤维的时间 F波的特点：重复刺激波形、潜伏期变异很大 4. Ｆ波的测定：计算机有现成的程序 电极的放置：记录电极同MCV；刺激电极放置与MCV相反 潜伏期的定：10-20个连续Ｆ波平均计算 出现率（Ｆ－Persistence)：80-100% F波的正常值：上肢：26 ms左右；下肢：48 ms左右
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RNS技术
1．常用的神经 面神经：刺激—耳前 记录—眼轮匝肌 腋神经：刺激—Erb’点 记录—三角肌 尺神经：刺激—腕 记录—小指展肌 副神经：刺激—胸锁乳突肌后缘；记录—斜方肌 ２. 低频RNS 频率：5 c/s（大部分病人能忍受） 计算：第4、5波比第1波波幅下降的百分比 正常值：国外↓8%或10%，我室↓15% 意义：诊断MG
是一个或几个MUAPs的重复放电，伴皮下肌肉蠕动。
意义：见于面肌痉挛、脑干胶质细胞瘤、MS、GBS、放射性神经病特别是神经 丛的损害及低钙等
血清学反应试验ppt课件
对流免疫电泳结果断定
1为阳性 2为弱阳性 3/4为强阳性
对流电泳方法评价
简便、快速、敏感度较双向琼脂分散实验高 8~10倍，但分辨力低于双向琼脂分散实验。
火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis, RIE)
火箭免疫电泳
火箭免疫电泳是单向单分散和电泳技术相结合的一种血清 学实验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中 定向泳动，二者比例适宜时构成类似火箭样的沉淀峰。沉 淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。
对流免疫电泳原理
在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只 带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小， 小于电渗力，泳向负极；而普通抗原蛋白质常带较强 的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向 正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗 体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相 遇，在比例适当处构成肉眼可见的沉淀线。
在适宜条件下，发生凝集反响。 载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝； 活性炭等。
抗原抗体反响类型-----间接凝集反响
间接血凝实验
吸附抗原的红细胞间就接称为血致凝敏红实细胞验。致敏红细胞
与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集景象。 用知抗原吸附于红细胞上检测未知抗体称为正向间 接血凝实验，用知抗体吸附于红细胞上鉴定未知抗 原称为反向间接血凝实验。 常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的O型红细胞。
抗原决议族
抗原的种类
半抗原〔只需反响原性而无免疫原性〕
完全抗原
天然抗原 人工抗原 合成抗原
抗原种类
异种抗原 同种异体抗原 本身抗原
蛋白质抗原 核酸抗原 多糖抗原 脂抗原
微生物抗原成分-----细菌抗原成分
血清学反应试验课件
血清学反应试验
24
抗原抗体反应凝类集型反--应---凝集反应
颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、 白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性 抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见 的凝集小块。
凝集原——凝集素
直接凝集反应
玻片法 试管法
血清学反应试验
25
血清凝集试验
血清学反应试验
血清学反应试验
12
IgG结在于血清（占血清免疫球蛋白总量的13%）
和外分泌液中
血清学反应试验
14
IgM 等结构
IgＭ：血液中
IgＤ：血清中，1%
IgＥ：血清中，0.002%
血清学反应试验
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淋巴器官
抗体的产生部位
胸腺
一级淋巴器官
骨髓 (鸟)法氏囊
二级淋巴器官
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火箭免疫电泳
火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清
学试验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中
定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉
淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。
血清学反应试验
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火箭免疫操作步骤
1. 制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷 却至55℃左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。 2. 打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距2mm。置琼脂 板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10μl。 3. 电泳 样品孔放负极侧，电压8~10V/cm或电流3~5mA/cm，电 泳6h。 4. 观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔 中心到峰尖的高度。 5. 绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)， 绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度
血清学实验技术课件
•本质：间接凝集试验
•原理：不完全抗体(单价抗体)与颗粒抗原结合不出现可见凝集反应，用单价抗体免
疫动物,将获得的抗抗体与结合有单价抗体的颗粒载体混合，出现可见的凝集反应 •应用：初生动物自身免疫溶血性贫血诊断，布氏杆菌病的不完全抗体检测，抗组织细 胞不完全抗体的检测
Step 1 Step 2
+
不完全Ab
原分析和疾病诊断的基础；但不同微生物的 部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出现 交叉反应，后者是区分血清型或亚型重要依 据
• 结合比例:抗原抗体结合在比例适当时才出现 明显可见反应,抗原或抗体过多可抑制可见反 应,称为带现象
• 可逆性:抗原抗体结合力与非共价键性质、数
量和距离有关,形成的复合物可以解离, 离解 常数(K)反映抗体与抗原之间的亲合力,高亲
=
颗粒性抗原 如：RBCs
+
=
Anti-AbFc
第14页，幻灯片共36页
沉淀试验分类
液体沉淀试验 沉淀试验
凝胶内沉淀试验
絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳
第15页，幻灯片共36页
环状沉淀试验
• 在小口径玻璃管内进行 • 主要用于抗原的定性检测(如诊断
• 分类 • 凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原或与颗粒性载体
（红细胞、乳胶等）结合的可溶性抗原与相应抗体结合， 在电解质参与下形成肉眼可见的凝集团块 • 沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与 下形成肉眼可见的沉淀物
第8页，幻灯片共36页
凝集试验分类
直接凝集性试验 凝集性试验 间接凝集性试验
(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)
•原理：不完全抗体(单价抗体)与颗粒抗原结合不出现可见凝集反应，用单价抗体免
疫动物,将获得的抗抗体与结合有单价抗体的颗粒载体混合，出现可见的凝集反应 •应用：初生动物自身免疫溶血性贫血诊断，布氏杆菌病的不完全抗体检测，抗组织细 胞不完全抗体的检测
Step 1 Step 2
+
不完全Ab
原分析和疾病诊断的基础；但不同微生物的 部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出现 交叉反应，后者是区分血清型或亚型重要依 据
• 结合比例:抗原抗体结合在比例适当时才出现 明显可见反应,抗原或抗体过多可抑制可见反 应,称为带现象
• 可逆性:抗原抗体结合力与非共价键性质、数
量和距离有关,形成的复合物可以解离, 离解 常数(K)反映抗体与抗原之间的亲合力,高亲
=
颗粒性抗原 如：RBCs
+
=
Anti-AbFc
第14页，幻灯片共36页
沉淀试验分类
液体沉淀试验 沉淀试验
凝胶内沉淀试验
絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳
第15页，幻灯片共36页
环状沉淀试验
• 在小口径玻璃管内进行 • 主要用于抗原的定性检测(如诊断
• 分类 • 凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原或与颗粒性载体
（红细胞、乳胶等）结合的可溶性抗原与相应抗体结合， 在电解质参与下形成肉眼可见的凝集团块 • 沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与 下形成肉眼可见的沉淀物
第8页，幻灯片共36页
凝集试验分类
直接凝集性试验 凝集性试验 间接凝集性试验
(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)
第5章--免疫血清学检验技术PPT课件
高，约为10μg／ml2。021
32
2021
33
（四）火箭电泳 Rocket Electrophoresis
又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电
泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体
的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时
间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，
沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特
96000
14 2021 Dy3+-PTA
1000 51
3、信号增强作用
Eu3+标记 的抗原-抗 体复合物
pH<4
Eu3+ 解离
结合 β-二酮体
荧光 增强
固相双抗体夹心法原理示意图
2021
52
4、双抗体夹心法
固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物
在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发
光下发射613nm荧光。2021
53
5、固相抗体竞争法
待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体 竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧 光增强液,测定荧光强度，荧光强度与 待检抗原含量成反比。
2021
54
6、固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的 Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加 入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度 与待检抗原含量成反比。
22
（二）间接Coombs试验
检测血清中的2021不完全抗体
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六、沉淀反应 precipitation reaction
可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清
蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一
定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和
温度)下，经一定时间，于比例合适处形