一株新城疫病毒的分离鉴定及其F基因的克隆与序列分析

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新城疫病毒广东基因Ⅶ型分离株的分离鉴定及F基因克隆与序列分析

研究于２０１１年从广东省分离到了一株ＮＤＶ，对此
１．２．１Ｆ基因引物设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ中的鸡源ＮＤＶＦ基因核苷酸序列，设计特异性引物，
刘佳佳，严专强，刘迪，李欣莲，覃健萍，谢青梅，毕英佐，薛春宜，陈峰¨
（１．华南农业大学动物科学学院，广东广州５１０６４２；２．广东温氏食品集团股份有限公司，广东云浮５２７４３９；３．中山大学生命科学学院，广东广州５１０００６）
１材料与方法
１．１材料
世界公认的两大最重要的禽类传染病之一［１］。其病
原ＮＤＶ属ＲＮＡ病毒中的单股负链病毒目，副黏病毒科，禽腮腺炎病毒属，又名禽副黏病毒Ｉ型（Ａｖｉａｎ
ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ１，ＡＰＭＶ一１）Ｅ引。
ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００宝生物工程（大连）有限公司。
１．２方法
近年来，新城疫在我国部分省市鸡群频频暴发，给养禽业造成了严重的经济损失。ＮＤＶ基因型众多，病毒毒力不断增强，造成该病防控难度较大。本
ｍＬ／Ｌ鸡红细胞和灭菌生理盐水由本实验室按照常
ＮＤＶ包括６个基因片段，编码至少７个蛋白。
Ｆ蛋白是主要的宿主保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，Ｆ蛋白裂解位点的差异与病毒的毒力直接相关，根据Ｆ基因序列分析，所有强毒株裂解位点

新城疫病毒SDWF2003株F基因的克隆与分子特征分析

ＣｌｎｎｎｏｅｕａｈｒｃｅｉｔｓａａｙｉｆＦｇｎｏｉｇａｄｍｌｃｌｒｃａａｔｒｉｎｌｓｓｏｅｅｓｃＯｗｃｓｌｉｅｓｉｓＳＤＷＦ０３ｉｏａｅｆＮｅａｔｄｓａｅｖｒｅｕ２０ｓｌｔ
酸苷酸同源性分别为８．、８．％、９．，氨基酸同源性分别为；ａＳｔ、４Ｅ、Ｃ９４４％７１８９％
８－、９．％、９．％。８３％１７８４
关键词：ＮＤＶ；Ｆ基因；Ｒ．ＣＴＰＲ；分子特征分析中图分类号：￥５．５．８２６９５文献标识码：Ａ文章编号：１０ —５９２０）１０４００８０８（０８０－１—３０
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第３０卷第ｌ期２０年０８１月
中国预
防兽
医学报
Ｖｏ１０．Ｏ．．Ｎ１３Ｊｎ．２０８ａ０
ＣｈｎｓｏｒａｆＰｅｅｔｖｔｒａｙＭｅｉｉｅｉｅｅＪｕｎｌｒｖｎｉｅＶｅｅｎｒｄｃｎｏｉ
新城疫病毒ＳＷＦ０３株Ｆ基因的克隆与分子特征分析Ｄ２０
肖跃强，沈志强，刘吉山，管宇，韩玲，郭广君，王金良
（山东省滨州畜牧兽医研究院山东省畜禽用蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州２６０）５６０
ａｉｓｉｅｕｅｅｔｅｆ２－－ — ＲＦｔｅｃａａｅｓｅｗｉａｒｔｆｅｖｒｌｔＶｒｉ．ｅＦｃｔａｄｄｃｄｐｐｉ ” ＲＱＫ—－ ” ａｔｌｖｇｉ．ｈｃｉａｆｔｅｍｏｉｏｉｅｄｗｈｄｏＲｈｅｔｈｓｅｕｄｆｔｈｕｎＮＤｓａｎＴｔｓｈ

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

ＳｉｎｅａｄＶｔｒｎｒｃｅｎｅｅｉａｙＭｅｗｉｅ，ｈｎｏｇＡｇｉｕｔｒｌＵｗｅｔ，ａ ’ ７０８，ｈｎ）ｃｄｎＳａｄｎｒｌａｎｎｉＴｉａ２１１Ｃｉｃｕｙｎａ
ＡｂｔａｔＡＮｅａｔｓａｅＶｉｓｉｏａｅｎｍｅＮ８ｗａｏｌｃｅｏｐｇｏｎＳａｄｎ．Ｆｇｎｆｔｅｓｒｃ：ｗｃｓｅＤｉｓｒｓｌｔａｄＪ０ｓｃｌｔｄｆｍｉｅｎｉｈｎｏｇｅｅｏｈｌｅｕｅｒｉｏａｅｗａｌｎｄａｄｓｑｅｃｄｔｔｄｔｌｃｌｒｃａａｔｒａｏｎｅｅｉｒａｉｔｎＪ８ｐｒｅｙｓｌｔｓｃｏｅｎｅｕｎｅｏｓｕｙｉｍｏｅｕａｈｃｅｉｔｎａｄｈｒｄｔｙｖｒｉ．Ｎ０ｕｆｄｂｓｒｚｉａａｏｉｉ
离较远。
关键词：；城疫病毒；鸽新Ｆ基因；子特性分
中图分类号：８８３￥５．９文献标识码：Ａ文章编号：０４５４（００） — ０００１０ —１２２１０１０２ — ５
Ｉｏａｉｎ，ｄｅｔｆｃｔｏａｄｏｅｕａｈｒｃｅｉａｉｎｆｒＦｅｆａＮｅａｓｓｌｔｏｉｎｉａｉｎｎｍｌｃｌｒｃａａｔｒｚｔｏｏｇｎｅｏｗｃ－ｉｔｅＤｉｅｓｒｓｉｏａｅｆｏｐｉｅｎｎＳｈｎｎｉｓａｅＶｉｕｓｌｔｄｒｍｇｏｉａｄｏｇ

新城疫病毒贵州不同鸡源分离株F基因的克隆与序列分析

新城疫病毒（ｅｃｓｅｄｓａｅｖｕ，Ｄ是副粘病毒ＮｗａｔｉｓｉｓＮＶ）ｌｅｒ
Ｎ５２：一ＴＡＴＩ ’ ＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴ一３ＣＡＣ ’ ｒＴＧＩＣＡＴＣＧ．
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
科腮腺炎病毒属成员，导致多种禽类发生严重的呼吸系能统和神经系统疾病，对养禽业危害极大。ＮＶ基因组为单Ｄ股负链ＲＡ，编码６种结构蛋白，Ｎ、、Ｆ、Ｎ可即ＰＰＭ、ＨＮ和Ｌ
鸡等不同鸡群中分离出ＮＶ毒株，采用传统方法进行了Ｄ并
毒力测定 ’ ，均未从分子水平上进行鉴定与分析。为但弄清贵州省不同鸡群ＮＶ分离株的分子特性，Ｄ本实验利用ＲＴ—ＰＲ技术扩增其Ｆ蛋白基因，制系统进化发生树，Ｃ绘
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贵州畜牧兽医
２００８年
第３２卷
第３期
１３
汪德生伍祥龙文明周碧君王文亮温贵兰。－。工－
（．贵州大学动物科学学院１
摘要
贵阳５０２２５０５．贵州大学动物疫病研究所）
应用ＰＲ技术扩增ＮＤＣＶ贵州不同鸡源分离株，包括肉鸡源Ｐ１株与ＢＹ株、蛋鸡源Ｈ２株与Ｆｗ株、七彩山鸡源Ｎ８株和９
越南斗鸡源ＤＱ株的Ｆ蛋白基因，将该基因片段分别进行克隆和测序，与国内外ＮＶ参考株的对应序列进行比较分析。结果表并Ｄ明：６株ＮＶ贵州不同鸡源分离株的Ｆ基因长度均为１６２ｂ，Ｄ６ｐ编码５３个氨基酸；５分离株间核苷酸同源性为８．％一９．％，６９９７氨基酸同源性为９．％一９．％；国内外ＮＶ代表株（ａｏ１Ｏ９３与ＤＬＳｔ、１株、４Ｅａ株ＢＦ８９株、Ｈ００株和Ｔ００株）Ｃ２０Ｗ２０的核苷酸同源性为８．％一９．％，４Ｏ８９氨基酸同源性为８．％一８６经系统发育进化树分析，Ｑ株、９７２９．％；ＤＮ８株、１和ＨＰ株２株为基因ＶＩ，Ｂｌｄ型而Ｙ株

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

ＺＨＡＮＧｕｍｅ，Ｘｉ－ｉＣＨＥＮＧｉＪｎ一，ＳＨＡＹＩＬＡＮ —ｉＧｕｌ．ＸＩＪｎ，ＷＡＮＧｎ，ＡｕＰｉｇＬＵｉｉＧｕ－ｌ
（．ｎｔｔｔｆＶｅｅｉａｙＳｉｃ・ＸｉｊａｇＡｃｄｍｙｏ１ＩｓｉｅｔｒｎｒｃｅｅｕｏｎｎｉｎａｅｆＡｎｍａｃｎｅＵｒｍｑ，ｎｉｎ８００，ｈｎ；ｉｌＳｉｃ．ｕｉＸｉｊａｇ，３００Ｃｉａｅ２ＣｌｅｅｆＶｅｒｎｒｄｃｎ，ＸｉａｇＡｇｉｕｔｒｌＵｉｅｓｙ，ｒｍｑ，ｎｉｎ８０５，ｉ；．ｏｌｇｏｔｉｙＭｅｉｉｅｅａ，ｎｉｒｃｌｕａｎｖｒｉＵｕｉＸｉｊａｇ，３０２Ｃｎｔｈａ３ＸｉａｇＴｃｎＡｎｍｌＨｕｂｎｒｉ－ｅｈｏｏｙＣ．Ｌｄ．，ｎｅｏｉｓａｄｙＢｏｔｃｎｌｇｏ．ｔ．Ｕｒｍｑ，ｎｉｎ８０１，ＣｉａｉａｕｉＸｉｊａｇ。３０１ｈｎ）
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动物医学进展。０８２（）７１２０，９７：－２
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉｒｅｃｎｏｅｓｉｔｒｎａｙＭｄｉｉｅ
新城疫病毒贵州分离株Ｆ基因的克隆和序列分析
了８个ＮＤ贵州分离株的Ｆ基因片段，Ｖ并将其，ＭＤ１Ｔ上述分
离株Ｆ基因长度为１６２ｂ，码５３个氨基酸，苷酸和氨基酸序列同源性分别为８．～９．和６ｐ编５核４０９７

一株鸽源新城疫病毒主要毒力基因分析

（ＴＰＲａｄｓｑｅｃｄＡｔｌｎｎｄａａｓｆｅｅ，ｈｏａｅｒａｌｔｅｔｇｎｔｅＲ —Ｃ）ｎｅｕｎｅ．ｆｒｉｍｅｔｎｌｉｏｎｓｔｅｉｌｄｓａｗｓｃｓｒｄｉｏｅｏｙｅａｇｎａｙｓｇｓｔｔｉｎｕｅｎｐＶｂａｄｔｅｌａａｅｓｅｆｎｓｏｎａｅｔｅｍｏｆ．－ＫＲＦｌＴｅｔｉＣ．Ｄ．０８ｈｄＩｅｖｇｔｏｇｅｎｈｃｉＦｅｗａｕｄｏｈｖｈｔ ” ＲＱ．－．ｌ＿ｈｒｎＰＧ２０ａｆｔｉ７ｓａｈ曲ｃｒｌｉｉｅｅｉｅｃｓａｓｆｅｏｙｅＶｂｆｍｕｏｅｗｈｃｌｄｔａｔｅｇｔａｅａｉｏｒａｏｗｔｔｐｄｍｉｔｉｎｔｐＩｏＥｒｐ，ｉｉｉｔｙｍｉｈｖｅｔｎｈｈｒｎｏｇｒｈｍｐｅｈｈｈ
毒株与欧洲流行的鸽源基因ＶｂＩ亚型毒株进化关系密切，表明该毒株与欧洲分离可能存在共同来源。对Ｆ株
和Ｈ蛋白功能研究发现，除Ｈ蛋白第３７ＮＮ４位抗原位点由Ｅ突变为Ｇ，ＦＨ蛋白的中和位点、糖基化外和Ｎ位点及半胱氨酸残基高度保守。
关键词：新城疫病毒；鸽；Ｆ基因；Ｈ基因Ｎ
ｃｍｍｏｎｅｔｒＮｅｔｌｉｇｅｉｐｓｌｃｓｔｔｎｓｔｓａｄｃｓｅｎｅｉｕｓｏｎｏｎａｃｓｏ．ｕｒｉｎｐｔｅ，ｇｙｏｙａｉｉｎｙｔｉｅｒｓｅｆＦａｄＨＮｒｔｉｒａｚｏｏｅｄｐｏｅｗｅｅｎ

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

段，将其构建到ｐ．９体上。核苷酸序列测定结果表明：基因片段全长１６２ｂ，码５３个氨基酸，Ｇｎ并ＭＤ１Ｔ载该６ｐ编５与ｅ．
Ｂｎ下载的１参考毒株Ｆ基因比较，苷酸和氨基酸序列同源性分别为９．％一９２和９．％一９．％；与ａｋ３株核７２９．％６９８７但ＬＳｔ、４ＥａｏＦ８９及Ｂ等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为８．％～９．％。ＮＶ分离株Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸序列ａ１８６１５Ｄ
２．ｅａｔｎｆＡｎｍａｄｃｎ，ｏｌｇｎｍｌＳｉｎｅＨｅｅＮｏｈＵｉｅｓｔ，ｈｎｊｋｕ０５０ＣｉａＤｐｒｍｅｔｏｉｌＭｅｉｉｅＣｌｅｏＡｉａｃｅｃ，ｂｉｒｎｖｒｉＺａｇｉｏ７００，ｈｎ；ｅｆｔｙａ
ＺＨＡＮＧｉｑｎ，ＡＮＧ — ｕＺＨＡＮＧｕｓａ，ＡＮｉｎ。ＤＵｎ — ｕ，Ｌ．ｉｇ一ＷＡｉｈａ，Ｘｉ．ｈｎＰＬ— ａＤｏｇｈａ
，
ＺＨＯＵｉｇＹＡＮＳｕｃｉ．ＵＮｊ．ｕＪｎ．ｈ．ａＳｉｇｏ
为１２．－．．ＦＩＧｌ９，于基因 Ⅶ ＮＶ。１ＲＲＱＦ基因；隆；列分析克序
中图分类号：４２４￥３．１文献标识码：Ａ文章编号：００—７９（０８ｏ１００１２０）４—０１０９一Ｏ４

山东地区新城疫病毒分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

ｑｕｅｎｃｅｏｆＦｇｅｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｖｉｒｕｓｅｓｓｈａｒｅｄａｖｅｌｏｇｅｎｉｃｍｏｔｉｆＲＲＱＫＲＦ… ａｔｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｗｈｉｃｈｗｅｒｅ
ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｅｘ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＳＤ０１・ＳＤ０４ａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓｄｅｉｖｒｅｄｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎ
摘要：２０１１年从山东不同地区的发病鸡体内分离到４株新城疫病毒，分别命名为ＳＤＩ～ＳＤ４。４株毒株经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的ＮＤＶ病变；为了解其遗传起源和分子特性对其融合蛋白（Ｆｕｓｉｏｎ，Ｆ）进行序
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２０１１．Ｔｈｅｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｐｕｉｆｒｉｅｄｂｙｐｌａｑｕｅａｓｓａｙｃａｎｆｏｒｍｔｙｐｉｃａｌｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ．ＴｈｅＦｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｔｏｓｔｕｄｙｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｉｚｒａｔｉｏｎａｎｄｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ —

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定

・
３・试验研究６
广东畜牧兽医科技２１年（３卷）３０１第６第期
一
株鸽新城疫病毒的分离鉴定
赵明秋，胡永明，许丽娜，易琳（华南农业大学兽医学院，广东广州５０４１６２）
摘要：对广东地区疑似发生鸽新城疫感染的鸽病料进行病毒分离，通过血凝试验（Ａ、中和试验、Ｈ）
ＺａｉｇｉＨｕＹｏｇｎ，ｎ，ｉｈｏＭｎｑｕ，ｎｍｉｇＸｕＬｉａＹｉｎＬ
（ｏｌｅｆｔｒａｄｃｅＳｕｈＣｉａｒｕｔｒｌｎｖｒｉ，ｕｎｚｏ１６２ＣｉａＣｌｇＶｅｉｒＭｅｉｎ，ｏｔｈｎｉｌａＵｉｅｓｙＧａｇｈｕ５０４，ｈｎ）ｅｏｅｎｙｉＡｇｃｕｔ
Ｆ因扩增及序列测定。结果分离到１基株血凝效价为４ｇｌ能被ＮＶｏ，且Ｄ阳性血清中和的病毒；用针对ＮＶＤＦ因设计的特异性鉴定引物对该分离株进行ＰＲ基Ｃ扩增，可扩增出相应的目的片段；测序及Ｂａｔｌｓ分析表
明其与山东分离株ｃｉｋｎＣｉａＳ５２０ｈｃｅ／ｈｎ／Ｄ／０８相似性高达９％系统进化树分析表明该分离株属于基因Ｖ５，Ｉ型。由此，该分离株为鸽新城疫病毒，并命名为Ｇ２１。Ｄ００关键词：新城疫病毒；分离；鉴定；鸽；广东
Ｉ引起的一种高度接触性急性传染病，）以肠炎、严
重腹泻和神经症状为特征。ＰＭＰＶ是新城疫病毒（ｅｃｓｌｉｅｓｉｕ，Ｄ）的一种变异株，ＮｗａｔｅｄｓａｅｖｒｓＮＶ两者在流行病学、病症状、检变化等方面有很发剖大的相似性，在发病率、但死亡率及死亡时间等方面有一定的差异＿－１。该病于１８年首次在苏丹和－－９１埃及的信鸽中发现，现已广泛流行于世界各地［３３。－４近年来，随着人民生活水平的不断提高，国肉鸽我养殖业迅猛发展，各地陆续有发生鸽瘟的报道［］５。－７２１００年ｌ月，东某肉鸽养殖场鸽群发生以１广

一株鸡新城疫病毒陕西分离株F基因的遗传进化分析

（陕西石羊（集团）农牧有限公司，陕西西安７１００００）
摘
要：从陕西省某大型养鸡场的疑似新城疫病鸡群中分离到１株新城疫病毒。对该新城疫病毒陕西
分离株进行Ｆ基因的扩增、序列测定和遗传进化分析。结果显示，该新城疫病毒分离株的Ｆ基因全长为１６６２ｂｐ，Ｆ蛋白裂解位点区的氨基酸序列为１１２Ｒ — Ｒ— Ｑ— Ｋ— Ｒ — Ｆ１１７，具备强毒株的特征；同源性分析表明，该新城疫病毒瘾分离株与国内外流行的基因 Ⅶ型强毒株之间的同源性较高，在９２．４～９８．０之间，其中与国内流行的基因Ⅶｄ亚型毒株的同源性最高，达９７．３以上，而与现用疫苗毒株ＬａＳｏｔａ（ＤＱ１９５２６５）、Ｆ４８Ｅ９
４８ｈ～７２ｈ死亡的鸡胚尿囊液。将无菌收集的鸡胚
尿囊液，采用５ＯｍＬ／Ｌ的鸡红细胞悬液进行直接血
凝试验，检测尿囊液有无血凝性。
１．２．３引物的设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ中已发
新基因（亚）型出现，宿主范围扩大和毒力增强等，给该病的预防和控制带来了巨大挑战口］。Ｆ蛋白是位于ＮＤＶ囊膜表面的一种功能性糖蛋白，是病毒进入宿主细胞的必须成分之一，其结构功能变化与ＮＤＶ致病性密切相关口］。根据ＮＤＶ的Ｆ蛋白裂解位点区的氨基酸序列可以判定病毒的毒力强弱，强毒株为１１２Ｒ－Ｒ — Ｑ— Ｋ～Ｒ — Ｆｌｌ７，弱毒株为１１２Ｇ～Ｒ — ＱＧ～Ｒ — Ｌ１１７［５］。对ＮＤＶ分离株Ｆ蛋白的研究，有助于了解鸡新城疫的发病原因。２０１２年从陕西省某大型养鸡场的发病鸡群中分离到１株ＮＤＶ，从基因水平证实了该ＮＤＶ分离株为强毒株，并对该分离株进行了Ｆ基因的序列测定和遗传进化分析，

新城疫病毒云南分离株F基因变异特性分析

动物医学进展。００３（）１ —８２１，１５：４１
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅｏｅｓｉｔｒｎｒｄｃｎ
新城疫病毒云南分离株Ｆ基因ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 异特性分析
宋建领，田建国。，叶丛华。张文东。焕云。吕粤。岳亮。，，赵，，，王金萍，
ＲＮＡ／ＮＡ提取试剂盒（ａＲｎＢＳｒｌＤＴＫａａＭｉｉＥＴＶｉａ
ＤＮＡ／ＲＮＡｔａｔｎＫｉＶｅ．．）ＴａＲａＯｎＥｘｒｃｉｔｒ３０、Ｋａｅｏ
六种结构蛋白。其中融合蛋白Ｆ是使病毒脂蛋白囊膜与宿主细胞表面包膜融合的主要因子，同时也是
７．～９．。系统发育分析表明，０株病毒中２Ｏ７０８３１株属于基因型 Ⅶ ，裂解位点氨基酸为ＲＲＱ．ＲＦ， — — Ｋ— —
与传统认为强毒裂解位点氨基酸序列相同；７株属于基因型 Ⅱ，５株裂解位点氨基酸为Ｇ— — Ｇ— — ，于ＲＱＲＬ属
邱薇冯子良张思东。，，，范泉水，张应国。张富强，
（．南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，南昆明６０２；．云南农业大学，１云云５２４２云南昆明６０２；５２３
３云南省动物疫病预防控制中心，南昆明６０５；．都军区疾病预防控制中心，南昆明６０３）．云５０１４成云５０２

孔雀新城疫病毒F基因的克隆及其变异分析

Ｆｇｎｎｐａｏｋｅｅｉｅｃｃ
ＪＨｏｂｎ，ＣＡＯＵｕ— ｉＨｕｏｒｎ，ＺＨＡＮＧｅ— ｉ，Ｌ１ｉｎ，ＺＨＯＵｉｐｎ —ｅＷｉｙＵＪａＪｎ— ｉｇ
（．ｈｎｈｉｅｔｒｆＡｉｌｓａｅＣｎｒｌＳａｇａ００，ｈｎ；１ＳａｇａＣｎｅｎｍａＤｉｓｏｔ，ｈｎｈｉ１３Ｃｉａｏｅｏ２１
关键词：孔雀；新城疫；Ｆ基因；变异分析中图分类号：￥５．５．８２６９５文献标识码：Ａ文章编号：１０ —５９２１）７０６ —３０８０８（０００ —５７０
ＣｌｎｎｎｅｕｎｅｏｗｃｓｌｓａｅｖｒｓｏｉｇａｄｓｑｅｃｆＮｅａｔｄｉｅｓｉｅｕ
ｐｙｇｎｔｅｆｅｅｉｉｔｄｔａｅＮＤｔｉｆｍｈｎｈｉｅｉｎｗａｉｌｔｔｉｉｌｅＨｅｎｊｎｈｌｅｅｃｔｅｏｇｎｄｃｅｔｈＶｓａｒＳａｇａｒｇｏｓｖｒｅｒｎｓａｔｔｌｇｉｇｏｉｒＦｎａｈｔｒｎｏａｕｎｓａｍｉｒｏｈｏａ
分离和ＮＤＶ荧光ＲＴＰＲ检测以及ＮＤＦ基因的序列分析，结果发现内脏病料样品的Ｎ —ＣＶＤＶ荧光ＲＴＰＲ检测 —Ｃ
为阳性；通过ＤＡｔ序列分析，Ｆ基因与其它参考株核苷酸同源性为８．％～９．ＮＳａｒ１１６８％，与Ｅ５２０龙江毒Ｆ９５８黑株的同源性高达９．６８％，基因系统进化树分析表明，该病毒株与黑龙江毒株的关系较近，均为强毒株。

1株蛋鸡典型新城疫病毒的分离鉴定

新城疫（ｗｃｓｌＤｓａｅＮＤ）称亚洲鸡瘟药监察所；流感Ｈ５和Ｈ９型阳性血清购自哈尔Ｎｅａｔｉｓ，ｅｅ也禽
或伪鸡瘟，由新城疫病毒（ｗｃｓｌＤｓａｅＶｉ滨兽医研究所；ｉｌｐＭ－ｅｓ体、ＭＬ是Ｎｅａｔｉｓ — ｅｅＴｒｏ、ＧＥＴａｙ载ｚＭ－Ｖ
采用ＯＩ准规定的ｆ微量法进行血凝试验Ｅ标｝Ｉ（ＨＡ）和血凝抑制试验（）如果标准新城疫阳性ＨＩ，
根据ＧｅＢｎｎａｋ中收录的ＮＤＦ基因序列，Ｖ用血清能够抑制病毒尿囊液的血凝性，而标准Ｅ７Ｄ６Ｐｅｅ．０设计合成１对引物（ｓ５ｒｍｉ５ｒＰ： ’ＡＴ— 阳性血清、流感Ｈ５和Ｈ９型阳性血清不能抑制禽
３瑞普（定）．保生物药业有限公司，北保定，７００河０１０
摘要关键词笔者于２１００年１Ｏ月２５日在河北南和地区发病蛋鸡群中分离到１较为疑似新城疫病毒的毒株，株疑似新城疫病毒；分离；鉴定
并进行了一系列的分离鉴定试验，定其为典型新城疫病毒强毒株。确
收稿日期：０１Ｏ —Ｏ２１一３１
．
２．试验研究
２２病毒的鉴定．
养殖与饲料２１年第４期０１
１７致病力试验．
１鸡胚半数致死量（Ｌ５））ＥＤ０的测定。将分离毒

一株致鸡产蛋下降新城疫病毒的分离与分子鉴定

取 9 ～ 10 日龄 SPF 胚（来源于扬州大学比较医学中心），将上述上清液接种于鸡胚尿囊腔内，0． 2 mL / 胚，置于 37 ℃ 孵化箱内，定时观察鸡胚状况。24 h 后对死亡鸡胚收集尿囊液，并观察鸡胚病变情况。根据试验结果决定是否继续传代培养。
收稿日期： 2012 － 09 － 30 基金项目：教育部创新团队项目（编号： IRT0978）；江苏省青蓝工程；
摘要：某鸡场蛋鸡群产蛋大幅下降，采集病鸡不同脏器研磨，接种 SPF 鸡胚分离病毒，结果发现输卵管研磨液接种的鸡胚死亡，收集死亡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验鉴定病毒，证实为新城疫病毒。采用 RT － PCR 方法扩增分离该病毒的 F 基因，克隆测序，并对该序列进行分析，结果表明该毒株为基因Ⅶ型新城疫病毒，裂解位点序列显示该毒株属强毒。
病料研磨液上清接种鸡胚后，只用病鸡输卵管研磨液接种的鸡胚在 48 h 左右死亡，其他病料接种的鸡胚未死。收集死亡鸡胚尿囊液后再接种 9 日龄 SPF 鸡胚 2 枚，每枚接种 0． 2 mL 传代 1 次，36 ～ 48 h 时 2 枚鸡胚全部死亡。 2． 2 病毒鉴定
第 1 代死亡的鸡胚尿囊液在血凝试验中没有出现明显的血凝性，但首次传代后尿囊液血凝效价达到 1 ∶ 32，再次传代后血凝效价达到 1 ∶ 64。直接提取尿囊液中的病毒基因组，用 EDSV 引物进行 PCR 扩增，结果没有出现条带。
关键词：蛋鸡；产蛋；新城疫病毒；基因Ⅶ型；分子鉴定中图分类号： S858． 31 文献标志码： A 文章编号： 1002 － 1302（ 2012） 12 － 0230 － 02
印度尼西亚首次发现新城疫病毒（ NDV），英国新城首次分离到该病毒［1］。至今新城疫已有 3 次大暴发，20 世纪 90 年代以来，新城疫虽没有世界性大流行，但局部地区流行和暴发时常发生，免疫鸡群发病和生产性能下降所造成的损失特别严重。每次新城疫的流行特点、临床病理表现、病毒毒株基因型都有一定差异。20 世纪 90 年代后期，研究者将 NDV 划分为 7 个基因型，前 3 次大流行的 NDV 主要是由基因Ⅱ至Ⅵ 型所致，目前欧洲流行的 NDV 及 1984 年以来我国台湾地区流行的 NDV 是由基因Ⅶ型所致［2］。严维巍等首次报道基因 Ⅶ型在中国大陆存在［3］。曹殿军等又将 NDV 分为 9 个基因型，基因Ⅸ型为我国特有［4］。目前基因 Ⅶ 型在我国的流行十分普遍［1］。近期某蛋鸡场蛋鸡发生疫情，主要症状表现为产蛋量大幅度下降，有软壳蛋、沙壳蛋、畸形蛋甚至无蛋情况出现，没有明显神经症状，有部分鸡死亡，笔者从患病鸡输卵管部位分离到新城疫病毒，并用 RT － PCR 方法对其 F 基因功能区进行扩增，鉴定其基因型，证明为基因Ⅶ型。本研究分析了该病原的重要蛋白基因，旨在丰富 NDV 的分子流行病学资料，为进一步探讨其演化规律提供参考。

郑州地区新城疫病毒的分离与鉴定

ＮＶ致病性越强．强毒力的ＩＰ接近３０而弱毒型毒力的ＩＰ为０Ｄ最ＣＩ．，ＣＩ。
３讨论
本研究通过Ｈ１Ｉ等一系列试验，郑州市４个县Ａ／Ｉ－从（）５个养禽场６市１５份疑似新城疫病料中分离和鉴定出１０株ＮＤＶ。根据目前ＮＤ毒力判定标准，ｌＶ对０株分离毒株ＭＤＩＰ和ＩＰ检测结果表明，Ｔ、ＣＩＶＩ２个分离株（Ｙ、Ｍ３Ｘ２Ｚ）ＭＤＴ为强毒株，其余毒株为中等毒力毒株。通过这些数而据表明，州地区现在的新城疫流行情况主要以中等毒力毒郑株为主，一结果与发病的临床表现比较符合。这近年来发现，Ｉ体效价的高低往往不能完全代表鸡Ｈ抗的免疫状况，的鸡Ｈ抗体效价很高，不能保护强毒的攻有Ｉ但击，而有的鸡ＨＩ体效价很低或检测不到，能抵抗ＮＤ抗但Ｖ的感染。本研究同时对发病鸡群新城疫抗体水平进行了检测，果显示，Ｉ体效价在２～２之间的病鸡群均可以分结Ｈ抗离出ＮＶ。鸡群在新城疫较高抗体水平下仍有新城疫发Ｄ生，明新城疫免疫可能存在不合理现象，者鸡群中流行表或的ＮＶ侵袭力可能发生了变化【。Ｄ５ＪＮＤ的发生和流行除与饲养管理不当、苗质量、同毒疫不株混合感染和免疫程序不当等因素有关外，城疫病毒发生新部分抗原变异可能是一个很重要的原因。这种现象给防治ＮＤ带来很大的困难，仅要防治和扑灭已经存在和流行的不强毒株，更要监控弱毒株，防弱毒株转变为强毒株。我国预对Ｎ的预防和控制主要依据疫苗免疫。由于Ｎ基因型较ＤＤ多，苗免疫并不能保证免疫效果，且在较大的免疫压力疫并下，Ｖ可能会发生新的变异。梁荣等【对我国西北地区ＮＤ６的ＮＶ进行分析时发现，ａｏａ苗对某些病毒具有免疫ＤＬＳｔ疫保护功能，对其他一些病毒保护却很弱。近年来，中国而从和台湾地区分离的毒株分析，Ｉ因型毒株成为我国的主ＶＩ基

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析王爱华;周静;杜冬华【摘要】通过RT-PCR技术扩增和克隆2003?007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型.结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在.分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%～98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%～97.7%.表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2010(033)001【总页数】5页(P88-92)【关键词】新城疫病毒;F基因;克隆;序列分析【作者】王爱华;周静;杜冬华【作者单位】河北北方学院,动物医学系,河北,张家口,075000;河北北方学院,动物医学系,河北,张家口,075000;河北北方学院,动物医学系,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】S858.31新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的侵害禽类的一种急性、高度接触性传染病,常呈败血症经过,是目前危害养禽业最严重的传染病之一,给世界养禽业带来了极大的损失,被国际兽疫局确定为I类传染病[1-2]。

目前从不同地区和鸡群分离到的新城疫病毒,对鸡的致病性有明显差异,按其致病性强弱可分为强毒株、中等毒力株、弱毒株3种类型。

1998年 Lomnizim[3]根据 F基因 47～435nt之间的389个核苷酸序列对1992—1996年流行于西欧国家的NDV分离株绘制了系统发育进化树,并进一步将NDV划分为7个基因型。

目前关于河北省NDV分子流行病学方面的研究报道还较少,为了有效地防制这种高变异的传染病流行,本研究对2003—2007年间分离自河北省具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因部分片段进行克隆测序和遗传变异分析,确定出分离株的基因型,并与国内外相关研究结果进行了比较,旨在研究分离株间的联系及其与国内外NDV主要流行毒株的遗传变异关系,从而为当地制定合理的新城疫防制措施提供理论依据。

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析柴迎梅;曹殿军;闫丽辉;刘培欣;黄永芬;汪清胤【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2002(024)002【摘要】根据NDVNP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物,利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段,将该片段克隆到pMD18-T Vector上,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子.为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性,采用Sanger＇s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定,获得了F48E9株NP基因片段的基因序列,利用DNASIS分析软件,将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较,其核苷酸序列同源性为88.2%.至此,我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆.【总页数】3页(P110-112)【作者】柴迎梅;曹殿军;闫丽辉;刘培欣;黄永芬;汪清胤【作者单位】哈尔滨师范大学生物系,150080;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨师范大学生物系,150080;哈尔滨师范大学生物系,150080【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.新城疫病毒F48E9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定 [J], 刘文丽;刘怀然;刘培欣;张馨心;孔宪刚;陈维多2.新城疫病毒中国株F48E9融合蛋白基因序列分析 [J], 陈金顶;廖明;辛朝安3.鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析 [J], 陈珍;施少华;程龙飞;傅光华;陈红梅;万春和;林芳;林建生;黄瑜4.11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析 [J], 孙建华;谢芝勋;刘加波;唐小飞;庞耀珊;邓显文5.新城疫病毒长春株NP、P、M蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 王承宇;金宁一;丁壮;王兴龙;金扩世;米志强;李太原;宣华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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文献标识码：Ａ文章编号：１０－７３２１）４００．３０７１３（０１０－０５０以本研究从山东某鸡场分离到新城疫病毒，对其生物学
特性和致病性进行了分析，并对Ｆ因进行了研究，旨从基分子水平阐明各毒株问的异同，为该病的防控及分子流行病学研究奠定基础。
参考文献
９１，１样品呈假阳性；其余样品均为阳性。，Ｏｌ号
２１０１年第４期（总第１１期）７
试验研究
一
株新城疫病毒的分离鉴定及其Ｆ因的克隆与序列分析基
苏文政 ① ② 牛钟相 ① 张琳 ② 朱荣生② 韩红②
泰安２１１ ② 山东省农业科学院畜牧兽医研究所７０８济南）
（山东农业大学动物科技学院 ①
据。根据上述方法计算可以得到１号样品为阴性；２
免疫力外，猪场中的技术人员还应定期做一些血清学检测，随时了解猪体内的各种抗体含量，这对以后制定一
项适合本猪场的免疫程序会有很大的帮助。
中图分类号：￥５．８２６９５
新城疫Ｄ）由新城疫病毒ｌｅ是
（ｅｃｓｅＤｓａｅＶｒｓＮｗａｔｉｓｉ，ＮＤ￣起的禽类一种急性、败ｌｅｕＶ）ｆ血性传染病，世界动物卫生组织（Ｉ）其列为对畜禽危ＯＥ将害最大的Ａ类传染病之一【，其病原—－Ｖ属于副粘病毒 “ ＮＤ科禽腮腺炎病毒属，为有囊膜的负链ＲＮＡ病毒口。ＮＤＶ】基因组为单股不分节ＲＡ，编码６结构蛋白，其中融合Ｎ种
猪体内母源抗体水平比较高，疫苗与母源抗体中和而使疫苗的免疫效果大打折扣。为保证猪场以后各种免疫都达到很好的效果，建议除了加强饲养管理，提高猪群的
所以本试验验结果有效，即所得试验数据为有效数
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以来，新城疫都危害禽类养殖，造成严重经济损失，所
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检测标本ｏＤ５ｌ值 ≥ 临界值判定为本试验阳性；检４Ｉ０测标本Ｏ＜界值判定为本试验阴性。Ｄ帅值临本试验中空白对照平均值＝Ｏ１８０１３／＝．５，（．＋．）０１５００２０阳性对照ＯＤ５２０－．５＝．９５０，阴性对照４ｎ值＝．５０１５１９＞．ｏ００８４
１材料与方法
１１病料与实验动物病料分离自山东某规模化肉鸡场．发病鸡群。ＳＦ胚及ＳＦ鸡由山东省农科院家禽研究Ｐ鸡Ｐ雏
所提供。
１主要试剂．２Ｔｉｌ于Ｉｖｏｅ公司；Ｍ— Ｖ、ｒｏ购ｚｎｉｇｎ￣ＭＬ
蛋白（）Ｆ和血凝素．经氨酸酶蛋白（）神ＨＮ为ＮＤＶ的功能性糖
蛋白，Ｆ白能够促进病毒囊膜和宿主细胞膜的融合，蛋蛋白裂解位点处的氨基酸序列对病毒的毒力有着非常重要
的影响，被看作判定ＮＤＶ力的重要标准【。此外，根据毒３】
Ｆ因的高变区序列将ＮＤＩ为不同的基因型【。一直基Ｖ￣分Ｊ
ＲａｅＩｉｉｒＥＴｑＤＮｎｓｎｂｔ、ｘａＡ聚合酶、ｐｈｏＭＤ１．ｅｔｒ８ＴＶｃｏ、
限制性内切酶、ＤＡｒｅ２０均购于宝生物工程ＮＭａｋｒＤＬ００（大连）有限公司：ＤＡ凝胶回收试剂盒、质粒快速提取试Ｎ
摘要
本试验对山东某鸡场发生疑似新城疫感染的肉鸡分离得到的一株病毒，经鸡红细胞血凝、血抑试验和动物回
归试验，结果表明，该分离株为新城疫病毒。对其毒力学指标进行测定，结果ＭＤＴ为５．ｈ，ＩＰ为１５ｖＰ为５６ＣＩ．，ＩＩ９２８，表明该毒株为新城疫强毒株。ＰＲ．５Ｃ特异性扩增Ｎ－Ｄ．２基因，大小为１６ｂ，编码５３ＤＶＳ０的Ｆ６２ｐ５个氨基酸，Ｆ因裂解基位点氨基酸序列为 “ＲＲＱＫ．．“ ，符合强毒株氨基酸序列的特点，与生物学特性测定的结果完全相符。对分离株Ｆ．．．ＲＦ基因的序列分析表明，与近年来国内外分离得到的Ⅶ型ＮＤＶＩ￣源性较高，为８．％～８ ‰ 该毒株属基因Ⅶ型。４７９．９关键词新城疫病毒生物学特性Ｆ因序列分析基
ＯＤ４ｏ＝．９ — ．０５一．０５０１５ｌ值００８０１５＝００７＜．Ｉ
保护率很高。但其中有３血清中细小病毒ＩＧ抗体呈假份ｇ
阳性，可能是由于给仔猪免疫细小病毒弱毒疫苗时，仔