体外PCR 扩增和体内DNA 复制
PCR扩增原理及操作
PCR扩增原理及操作PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子技术，它能够在短时间内扩增特定DNA序列，从而使得微量的DNA可以被快速有效地检测和研究。
PCR的成功应用广泛，包括基因检测、病毒检测、遗传疾病诊断等等。
下面将详细介绍PCR的扩增原理及操作步骤。
PCR的扩增原理：PCR是一种体外合成DNA的方法，它需要三个关键组分：DNA模板、一种酶称为DNA聚合酶以及两段称为引物的DNA序列。
PCR的基本原理是通过重复进行三个温度环境的循环反应，以使得DNA链的扩增。
PCR的操作步骤：2.DNA提取：将DNA从样本中提取出来，以获得纯净的DNA样品。
常见的DNA提取方法包括蛋白酶消化、有机溶剂抽提、离心法等。
3.设计引物：引物是PCR的关键组成部分，它们能够指定目标DNA序列的区域。
引物一般由20-30个碱基组成，能够与目标DNA序列的两端部分互补配对。
4.准备PCR反应液：PCR反应液通常包括DNA模板、引物、dNTPs （即四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲溶液和镁离子。
引物的浓度一般为0.2-0.5μM，聚合酶的浓度为2.5-5.0U/μL。
5.PCR循环反应：PCR反应需要进行循环反应，即进行一系列的温度周期变化。
一般来说，PCR循环反应包括三个步骤：变性、退火和延伸。
-变性：将PCR反应液加热到94-98℃，将DNA模板的双链DNA变为单链。
此步骤有助于使DNA链分离以便于引物的结合。
-退火：将PCR反应液冷却到50-65℃，使得引物与DNA模板的目标序列互补配对。
-延伸：将PCR反应液加热到72℃，使得DNA聚合酶能够在引物的引导下在目标DNA序列上合成新的DNA链。
每个循环通常持续数十秒至数分钟，可由PCR仪自动控制。
6.PCR循环反应次数：PCR循环的次数通常是25-40次。
这些循环的重复会使所需扩增的目标DNA序列数量指数级增加。
7.凝胶电泳分析：通过凝胶电泳，可以确定PCR产物的大小、纯度和数量。
PCR
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化 的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增 反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特 异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异 的扩增条带。
二、退火 模板DNA与引物的退火（复性），模板 DNA经加热变性成单链后，温度降低至 55℃左右，引物与模板DNA单ห้องสมุดไป่ตู้的互补序 列配对结合。
三、延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，dNTP为反应原料靶序列为模板 ，按碱基配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板DNA链。
中国药科大学生物化学精品课程习题核酸的代谢和蛋白质合成
中国药科大学生物化学精品课程习题核酸的代谢和蛋白质合成第一节核苷酸的代谢一、填空题1(人类对嘌呤代谢的终产物是。
2(痛风是因为体内产生过多造成的，使用作为黄嘌呤氧化酶的自杀性底物可以治疗痛风。
3(核苷酸的合成包括和两条途径。
4(脱氧核苷酸是由还原而来。
5(从IMP合成GMP需要消耗，而从IMP合成AMP需要消耗作为能源物质。
6(不能使用5-溴尿嘧啶核苷酸代替5-溴尿嘧啶治疗癌症是因为。
7(细菌嘧啶核苷酸从头合成途径中的第一个酶是。
该酶可被终产物抑制。
二、是非题1(黄嘌呤氧化酶既可以使用黄嘌呤又可以使用次黄嘌呤作为底物。
2(嘌呤核苷酸的从头合成是先闭环，再在形成N糖苷键。
3(IMP是嘌呤核苷酸从头合成途径中的中间产物。
4(真核细胞内参与嘧啶核苷酸从头合成的酶都位于细胞质。
5(嘧啶合成所需要的氨甲酰磷酸合成酶与尿素循环所需要的氨甲酰磷酸合成酶是同一个酶。
三、选择题(下列各题均有五个备选答案，其中只有一个正确答案) 1(嘌呤环1号位N原子来源于( )(A)Gln的酰胺N (B)Gln的α氨基N (C)Asn的酰胺N (D)Asp的α氨基N (E)Gly的α氨基N2(dTMP的直接前体是( )(A)Dcmp (B)dAMP (C)dUMP (D)dGMP (E)dIMP 3.人类嘧啶核苷酸从头合成的哪一步反应是限速反应,( )(A)氨甲酰磷酸的形成 (B)氨甲酰天冬氨酸的形成(C)乳清酸的形成 (D)UMP的形成(E)CMP的形成4(下面哪一种物质的生物合成不需要PRPP,( )+ (A)啶核苷酸 (B)嘌呤核苷酸 (C)His (D)NAD(P)(E)FAD 5(下列哪对物质是合成嘌呤环和嘧啶环都是必需的,( )(A)Gln/Asp (B)Gln/Gly (C)Gln/Pro (D)Asp/Arg (E)Gly/Asp四、问答题1(你如何解释以下现象:细菌调节嘧啶核苷酸合成的酶是天冬氨酸-氨甲酰转移酶，而人类调节嘧啶核苷酸合成的酶主要是氨甲酰磷酸合成酶。
PCR扩增原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤[资料] PCR扩增反应的操作第一节 PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的2+DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态;然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火;再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’?3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。
1(模板DNA的变性模板DNA加热到90~95?时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变G-C间由三个性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO)，并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97?，时间适当延长，即所谓的热启动。
PCR技术
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（3）GC的含量 GC的含量
一对引物的GC含量和Tm值应该协调， 引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。 G+C一般占40-60%。 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T） 可估计 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计 引物的Tm值 引物的Tm值。
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（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端 ）两引物间避免有互 序列，尤其避免3’端 的互补 的互补重叠。 一般来讲，引物自身连续互 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能 超过3个，一对引物间也不易多于四个连续 个，一对引物间也不易多于四个连续 碱基的互补 碱基的互补性。
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三、PCR的反应 三、PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的 作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中 温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的 基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使 基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙 锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。
4
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA 特定DNA片段 DNA片段
1983年
Mullis的构思 Mullis的构思
5
94℃变性
5050-65℃退火
XX℃延伸
6
DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，缺点： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每 次循环都要重新加入。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生 模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异 性较差，合成的DNA片段不均一。 由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变 性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。
2020-2021学年高二生物人教版一教学案：专题5课题2多聚酶链式反应扩增片段版含答案生物
一、PCR扩增的原理和过程 (阅读教材P58～62 )1．细胞内DNA复制的条件原料4种脱氧核苷酸模板2条DNA母链酶解旋酶和DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2.PCR扩增的原理及条件(1)PCR(多聚酶链式反响)：一种体外迅速扩增DNA片段的技术.它能以极少量的DNA 为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝.(2)原理：DNA的热变性原理,即：(3)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸.(4)条件①模板：DNA .②引物：能分别与DNA两条模板链相结合的物质 .③原料：4种脱氧核苷酸.④酶：耐高温的DNA聚合酶,一般用Taq DNA聚合酶.⑤其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调控温度的温控设备.(5)引物一小段DNA或RNA ,能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,用于PCR引物的长度通常为20～30个核苷酸 .3．PCR的反响过程(1)变性：温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链.(2)复性：温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合.(3)延伸：温度上升到72 ℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原那么合成新DNA链.二、实验操作及DNA含量的测定(阅读教材P62～63 )1．实验操作程序准备―→移液―→混合―→离心―→反响.2．DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量.(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm处紫外分光光度计的读数)×稀释倍数.注：在标准厚度为1 cm的比色杯中,OD260为1相当于50 μg/mL的双链DNA .[共研探究]多聚酶链式反响简称PCR ,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的.请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识,答复以下问题.1．PCR技术(1) PCR的原理：在80～100_℃的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性.当温度缓慢降低后,两条彼此别离的DNA链又会重新结合成双链.(2)子链扩增：需要引物,合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.(3)条件①模板：DNA .②引物：分别与DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段.③原料：A、T、G、C四种脱氧核苷酸.④酶：耐热DNA聚合酶,一般用耐高温的Taq_DNA聚合酶.⑤其他条件：需要一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备.(4)PCR扩增中的重点解读①DNA聚合酶不能从头开始合成DNA ,只能从引物的3′端延伸DNA链,因此扩增DNA 时应参加两种引物.②PCR扩增DNA过程中不需要解旋酶.③利用PCR技术扩增1个DNA分子n次,所得DNA分子中,不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是1/2n .含引物的DNA分子所占的比例是100% .2．PCR技术的过程(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链.(2)复性温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合.(3)延伸温度上升到72 ℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A ,T ,C ,G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原那么合成新的DNA链.3．PCR扩增的理论计算PCR扩增时,DNA数目呈指数形式扩增.假设只有一条DNA模板,那么复制n次后有2n条DNA；假设一开始有a条模板,那么复制n次后有a×2n条DNA .[总结升华]生物体内的DNA复制与PCR反响的比较体内DNA复制PCR反响不同点时期细胞有丝分裂间期和减数第|一次分裂前的间期体外随时进行场所活细胞内微量离心管内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)解旋在解旋酶的作用下,细胞提供能量,局部解开加热至||90 ℃以上时,双链全部解开,不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA也可以是单链DNA分子片段合成子链在引物根底上,一条链连续合成,另一条链不连续合成分别从两条链的引物的3′端开始,都是连续合成,控制温度在72 ℃左右特点边解旋边复制,半保存复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30屡次产物完整DNA DNA片段相同点原料4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)复制原理严格遵循碱基互补配对原那么,半保存复制模板以DNA母链为模板引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端,即DNA的两条链是反向平行的.(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,DNA聚合酶、DNA连接酶催化形成磷酸二酯键.(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上,需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板.(4)从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反响,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸.这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数形式扩增.[对点演练]1．近20年来,PCR技术(多聚酶链式反响)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段,其原理是利用DNA半保存复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图) ,在短时间内,将DNA扩增几百万倍甚至||几十亿倍,从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体.(1)加热使DNA双链间的__________键完全翻开,称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的.(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段,应该参加________种特定的引物.当温度降低至||55 ℃时,引物与两条 "舒展〞的模板的特定位置结合,在DNA聚合酶的作用下,只能在引物的________端连接脱氧核苷酸,两条子链的延伸方向都是________________ .(3)PCR技术的必需条件,除了模板、原料、酶之外,至||少还有三个条件,即液体环境、适宜的________和________ ,前者由________自动调控,后者那么靠________来维持.(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制,如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中,以14N 标记的脱氧核苷酸为原料,连续复制四次之后,那么15N 标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________ .解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂,称为解旋,而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂.(2)PCR分为三个根本反响步骤：变性(95 ℃)、复性(55 ℃)、延伸(72 ℃) ,其特异性依赖于与靶序列互补的引物,引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段,两引物之间的距离决定扩增片段的长度.由于DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,那么DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同,除了需要模板、原料、酶以外,还需要液体环境(稳定的缓冲溶液) ,每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等 .(4)一个DNA分子连续复制四次之后,形成16个DNA分子,15N标记的DNA分子有2个,那么15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8 .答案：(1)氢解旋解旋(2)两3′从子链的5′端向3′端延伸(3)温度酸碱度PCR仪缓冲液(4)1/8[共研探究]PCR是在PCR仪中完成的,经过屡次的循环使DNA片段得以大量地扩增,这个过程有严格的操作规程.1．结合下面实验操作过程,答复以下问题：(1)实验操作过程准备：按照PCR反响体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用微量移液器按照配方向微量离心管中依次参加各组成成分↓混合：盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁↓离心：将微量离心管放在离心机上,离心约10 s ,使反响液集中在离心管底部↓反响：将离心管放入PCR仪中进行反响(2)本卷须知①防止外源DNA污染：所用离心管、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌.②缓冲液和酶分装成小份,并在－20_℃储存.③每添加一种反响成分,更换一个移液器上的枪头 .④混匀后离心处理,使反响液集中在离心管底部.2．实验中DNA含量的测定理论上DNA呈指数增长,但实际可能会有诸多因素影响DNA含量,所以需要对DNA 含量进行测定.(1)原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰.峰值的大小与DNA的含量有关,可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定.(2)过程①稀释：取2 μL PCR反响液,参加98 μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释.②对照调零：以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm 处,将紫外分光光度计的读数调节至||零.③测定：取DNA稀释液100 μL至||比色杯中,测定260 nm 处的光吸收值.④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数.[总结升华]1．PCR过程用到的重要仪器(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度,实现DNA的扩增.如果没有PCR仪,可用3个恒温水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反响的微量离心管.(2)微量离心管：总容积为0.5 mL ,实际上是进行PCR反响的场所 .(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体.2．PCR技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液,对细菌、病毒感染进行早期诊断.(2)对单细胞中的DNA进行扩增,用于遗传病的基因诊断,并在此根底上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用.(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定.(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品,追溯其生存年代或迁徙踪迹.(5)在农业生物技术中,可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等.[对点演练]2．以下对PCR的实验操作顺序的表达,正确的选项是()A．准备→移液→混合→离心→反响B．准备→移液→离心→混合→反响C．离心→移液→混合→反响D．移液→离心→混合→反响解析：选A PCR的实验操作中,首||先是准备,即按照PCR反响体系的配方将需要的试剂摆放在实验桌上；其次是移液,即用微量移液器按照配方在微量离心管中依次参加各组分；然后是混合,即盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁,使反响液混合均匀；接着是离心,即将微量离心管放在离心机上,离心约10 s；最||后是反响.1．PCR技术扩增DNA ,需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④耐热的DNA聚合酶⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥解析：选A PCR技术扩增DNA需要DNA模板(目的基因)、两种引物、四种脱氧核苷酸和耐热的DNA聚合酶等.2．以下有关PCR技术的表达,不正确的选项是()A．PCR技术利用的是碱基互补配对原那么B．PCR技术可用于基因诊断,判断亲缘关系等C．PCR技术需在体内进行D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段解析：选C PCR技术是聚合酶链式反响的简称,是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术.3．DNA的复制需要引物,主要原因是()A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链解析：选D DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物.当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.4．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题,而被广泛应用,与细胞内的DNA复制相比,PCR可以快速扩增所需的DNA片段,请分析答复以下有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶翻开双链DNA ,而PCR技术中的解旋原理是________________________________ .(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶,该酶是从__________________中别离的 .(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶具有的特性是____________ .(4)与体内DNA复制相比较,PCR反响要在________________中才能进行,并且要严格控制________条件.(5)PCR中参加的引物有________种,参加引物的作用是_____________________ .解析：(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键翻开,从而解旋,其原理是DNA的热变性原理.(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的.(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性,具有耐高温的特性.(4)PCR反响需要适宜的温度和pH,因此PCR反响要在一定的缓冲溶液中进行,并需要严格控制好温度条件.(5)PCR需要两种引物,引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段.PCR中参加的引物是小段单链DNA或RNA ,作用是引导DNA复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点.答案：(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温度(5)2作为DNA复制的起点。
PCR 技术原理
5．PCR 反应液的配制
PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的
正常进行。 常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子， 要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
5．PCR 反应液的配制
对于使用具 3‘-5’ 外切活性的高温 DNA 聚 合酶时，有时会扩增不出产物。
DNA 聚合酶是 DNA 复制的动力，在 dNTP
等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合
成互补的 DNA 链。
2．扩增原理
PCR技术 的基本原理类似于天然DNA复制
过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核
苷酸引物。
PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤
构成。
PCR技术的工作原理
⑤引物的碱基组成 1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的 结合力。 2）避免引物内部或引物之间存在互补序列，减 少引物二聚体及发夹结构的形成。
3）避免形成引物二聚体（dimer）
两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列
互补。
4．模板
① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯 合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，一般的PCR扩增，104-107个模板 分子即可。 100l反应体系中100ng。
2．脱氧核苷三磷酸（dNTP）
脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准
的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种
dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，
终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓度）。
pcr扩增的原理和步骤
PCR技术的原理与反应步骤20世纪70年代末，随着DNA重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题。
1983年K.Mullis发明了聚合酶链反应（PCR）技术。
该技术可将微量DNA片段大量扩增，使微量DNA或RNA的操作变得简单易行。
PCR技术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。
PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。
PCR技术的发明者Kary Mullis为此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
近年来，PCR技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测定。
该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。
新的PCR技术类型层出不穷。
一、PCR技术的工作原理PCR的基本工作原理是在体外模拟体内DNA复制的过程。
以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3'-0H末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。
不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
PCR反应的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物。
组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引物、耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。
每个PCR体系均包括4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物（primer）、TaqDNA聚合酶（TaqDNA polymerase）和脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）。
PCR的基本反应步骤包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：①高温变性：将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除；②低温退火：将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃，约50-65℃），两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链，使引物与模板DNA结合；③适温延伸：将温度升至TaqDNA聚合酶的最适温度72℃，DNA聚合酶以引物3'端为合成的起点，以单核苷酸dNTP为原料，沿模板以5'→3'方向延伸，催化DNA的合成反应，合成DNA新链。
某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(820)
某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 色氨酸操纵子中含有衰减子序列。
（）[华南理工大学2005研]答案：正确解析：色氨酸操纵子的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化子系统。
2. 蛋白质变性和DNA变性的机理是相似的，复性时都可以恢复原来的生物活性。
（）[天津商学院研]答案：错误解析：蛋白质变性根据变性程度可以分为可逆变性和不可逆变性，原来的生物学活性不一定能够恢复；DNA变性后一般可以恢复原来的生物学活性。
3. 纤维素中葡萄糖分子以β1,4糖苷键连接，而直链淀粉中葡萄糖分子则是以α1,4糖苷键相连。
（）[中山大学2018研]答案：正确解析：4. 淀粉和糖原的生物合成都需要有引物的存在。
（）答案：正确解析：多糖合成时末端需要葡萄糖残基引物存在，以利于多糖链的延长，糖原的合成需要带有寡糖链的多肽作为引物，一般情况下引物是至少含4个葡萄糖残基的α1,4葡聚糖。
5. 呼吸链中将电子直接传递给氧的是细胞色素aa3。
（）[中山大学2018研]答案：正确解析：6. 饮茶能够抑制脂肪的动员。
（）答案：错误解析：茶叶中含有茶碱，这种物质能够抑制cAMP的水解，从而能够延长肾上腺素的作用时间，动物的脂肪动员是受到肾上腺素的刺激的，因此茶碱不是抑制脂肪动员，而是促进脂肪动员。
7. 氨基酸与茚三酮反应都产生蓝紫色化合物。
（）答案：错误解析：除了脯氨酸与茚三酮的反应颜色呈亮黄色且不释放NH3外，其他的α氨基酸均能与茚三酮反应生成蓝紫色物质并放出NH3。
8. 在肌肉细胞中磷酸戊糖途径比在脂肪细胞中更活跃。
（）答案：错误解析：磷酸戊糖途径能为脂肪酸合成提供大量的还原当量NADPH，因而在脂肪细胞中该途径远比在肌肉细胞中更为活跃。
PCR原理与技术
PCR原理
PCR过程：变性、退火、延伸，此过程循环反应。 变性就是将双链的DNA打开，使其变成单链，以使引 物可与其结合（碱基互补配对）。变性的方法就是升 高温度到94℃-98℃，温度因酶而异。 退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。 延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度，进行聚合 反应。 以上3个过程完成一次为一个循环，一般PCR可以进行 25-35次循环。扩增2^25-35倍。
一步法和两步法
一步法：逆转录和特异性扩增在一管内完成， 需用基因特异性引物
两步法：先逆转录得到cDNA ，再分别进行扩增， 需用Oligo dT 或随机引物
两者区别：一步法简单，减少污染的几率，可适用于 大量样品和定量分析，但一次只能分析一个基因，
cDNA 不能重复利用；两步法比较灵活，一次逆转录
普通PCR与real-time PCR的比较
普通PCR ：终点定量，结果不稳定，反应环境、循环 次数对结果影响较大，不能定量起始DNA模板数量。
Real-time PCR ： 灵敏度高（SYBR green 法）/特异 性高（分子信标、Taqman法），线性关系好，高通 量，可定量起始DNA模板数量。
PCR原理
从PCR的过程可知道，PCR反应的进行需要的条件为： DNA聚合酶 模板 引物 原材料和能量——dNTP 反应发生所需要的水盐环境 还有外部环境条件——温度（PCR仪提供）
PCR经典反应条件
94℃ 94℃ 60℃ 72℃ 72℃ 4℃ 3min （预变性） 30s （变性） 25-35个循环 30s （退火） 1min （延伸） 10min （充分延伸） hold （可有可无）
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反 应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响 DNA聚合酶的活性
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增一、聚合酶链式反应（PCR）的定义PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
二、聚合酶链式反应（PCR）的基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，一般是94℃，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
核酸体外扩增
交链 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引
物为起始点的延伸反应
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
PCR的基本原理 示意图
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二、PCR引物设计原则
在PCR反应中使用的耐热Taq（或其他）DNA聚合酶， 相应的缓冲体系及dNTP（核苷三磷酸）已经商品化，可从 相应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人 员准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后 讨论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核 苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。
5、引物的3’端 与模板D资N料仅A供一参考,定不当之要处，请配联系对改正。，（引物的延伸是从3’端开始 的，不能进行任何修饰）。有资料表明3’端末位碱基在很大程度上影响Taq 酶延伸效率，当末位为A时，即使错配，也能引发链的合成，（A：A错配使 产量下降至1/20；A：G和C：C错配下降至1/100）。而末位为T时，错配引 发效率会大大降低，因G或C居中间，所以3’端末位碱基最好选T、C或G， 而不选A。
4、引物自身和引物之间 引物自身不应存在互补序列，（避免引 物自身成发卡结构或引物本身复性，这种二级结构会因空间位阻效应影 响引物与模板复性结合，若人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp）。引物之间不应有互补性，尤应避免互补重叠，（以防引物二聚 体的形成。一对引物间不应多于4个碱基的同源性或互补性）。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
PCR引物设计原则要点 1. 长度为15~30个核苷酸 2. 碱基随机分布，G+C的含量为45~55% 3. 避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不 超过3bp 4. 引物之间不应存在互补序列，避免3 ′端互补重叠 5. 引物的碱基序列与非扩增区域无同源性 6. 引物3 ′端碱基一定与模板配对，最佳碱基选G和C 7. 引物5 ′端可以修饰，如加酶切位点，突变位点，起 始密码子，终止密码子等。
医学生物化学与分子生物学实验智慧树知到课后章节答案2023年下山东第一医科大学
医学生物化学与分子生物学实验智慧树知到课后章节答案2023年下山东第一医科大学山东第一医科大学第一章测试1.夏天天热，同学们进入实验室可以不用穿戴隔离衣。
（）A:错 B:对答案:错2.我们的教学实验室主要从事基础的教学研究，不需要特殊的安全设施。
属于生物安全一级实验室。
（）A:错 B:对答案:对3.实验结束，所有的仪器设备、电灯、空调等都要关闭电源。
（）A:对 B:错答案:对4.实验过程中产生的损伤性废弃物如：注射器针头、采血针等要放入黄色的医疗废物专用垃圾桶内，交由废弃物处理平台工作人员收取后统一处理。
（）A:错 B:对答案:错5.实验过程中如果使用易挥发的有毒有害试剂，一定要做好个人防护，戴好手套口罩，注意室内通风。
（）A:对 B:错答案:对第二章测试1.刻度吸量管调刻度时，视线与（）相平。
A:凹液面 B:刻度线 C:俯视线 D:仰视线答案:凹液面2.在分光光度法中，运用光的吸收定律进行定量分析，应采用的入射光为（）。
A:特定波长的光 B:可见光 C:白光 D:紫外光答案:特定波长的光3.使用分光光度计测定物质浓度时，波长应选择（）。
A:600nm B:500nm C:一般待测物质最大吸收峰的波长 D:650nm答案:一般待测物质最大吸收峰的波长4.关于玻璃仪器的清洗，错误的是（）A:玻璃仪器如果常规清洗后仍不干净，需干后用铬酸洗液浸泡，然后用自来水冲洗至水不显黄色后再冲洗几次，最后用少量蒸馏水冲洗内壁2-3次，倒置晾干即可B:非计量玻璃仪器或粗容量仪器，可直接用毛刷蘸洗洁精刷洗，然后用自来水冲洗，直至器壁内外既不聚成水滴，水也不成股流下，最后用少量蒸馏水冲洗内壁2-3次，倒置晾干即可 C:比色皿光学面不能用滤纸擦拭 D:刻度吸量管用后要用专用的毛刷蘸洗洁精刷洗，然后用自来水冲洗，直至器壁内外既不聚成水滴，水也不成股流下，最后用少量蒸馏水冲洗内壁2-3次，倒置晾干即可答案:刻度吸量管用后要用专用的毛刷蘸洗洁精刷洗，然后用自来水冲洗，直至器壁内外既不聚成水滴，水也不成股流下，最后用少量蒸馏水冲洗内壁2-3次，倒置晾干即可5.关于微量移液器的使用，错误的有（）A:吸液时，移液器本身倾斜 B:平放带有残余液体吸头的移液器 C:用1ml量程的移液器移取10μl液体 D:装配吸头时，无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸头答案:吸液时，移液器本身倾斜;平放带有残余液体吸头的移液器;用1ml量程的移液器移取10μl液体6.离心机机体震动剧烈，响声异常的原因有（）A:离心温度低于室温 B:离心管重量不平衡，放置不对称 C:电机转子松动 D:转头孔内有异物，负荷不平衡或使用了不合格的试管套答案:离心管重量不平衡，放置不对称;电机转子松动;转头孔内有异物，负荷不平衡或使用了不合格的试管套7.比色皿的使用注意事项，错误的是（）A:盛装液体体积超过四分之三比色皿体积 B:使用前后必须清洗干净 C:用手拿比色皿的光学面 D:使用中应使磨砂面对向光路答案:盛装液体体积超过四分之三比色皿体积;用手拿比色皿的光学面;使用中应使磨砂面对向光路8.使用微量移液器吸取液体时，按压至1档。
pcr与体内dna复制的异同点
pcr与体内dna复制的异同点PCR是一种基因重复扩增技术，而体内DNA复制是一种天然过程。
这两种过程之间存在许多异同点。
本文将分步骤对它们进行详细阐述。
1. 异同点之一：起始点PCR扩增和体内DNA复制的起始点不同。
PCR扩增是从特定位点（引物）开始的，而体内DNA复制起点是DNA末端。
体内DNA复制的起点是受酶的调控，而PCR扩增的起点则是由引物的位置决定的。
2. 异同点之二：酶的作用体内DNA复制和PCR扩增所需的酶也不同。
体内DNA复制需要DNA聚合酶和其他辅助酶，例如DNA拓扑异构酶、DNA单链结合蛋白等。
在PCR扩增中，用于扩增的酶是Taq聚合酶，它是一种热稳定性的酶，因为PCR过程中需要多次变温，这种酶才能在高温下进行反应。
在PCR 扩增中，还需要核苷酸，这些核苷酸可以在DNA聚合过程中起到模板的作用。
3. 异同点之三：复制速度体内DNA复制和PCR扩增速度差异非常大。
在体内DNA复制中，DNA聚合酶每秒钟能够合成近1000个核苷酸，而PCR扩增可以在几小时内扩增数百万甚至数千万个DNA片段。
这是因为体内DNA复制的过程是由DNA拓扑异构酶和其他酶调节的，并且不需要特别快的速度进行，而PCR扩增则是在试管中进行，不受多种限制，为快速扩增DNA提供条件。
4. 异同点之四：储存方式PCR扩增和体内DNA复制的储存方式也不同。
PCR扩增产生的DNA 是在试管中扩增出来的，并且需要保存在低温和无水环境中，以避免所扩增的DNA在保存过程中被降解。
这与体内DNA复制储存方式不同，体内DNA复制的DNA通过直接以染色质的形式保存在细胞核中，并且通过复杂的DNA修复网络保持稳定。
总之，PCR扩增和体内DNA复制虽然有着相似的基础，但在操作方式、速度、成本和准确性等方面都存在一定的差异。
PCR扩增在基因工程、生物学和医学领域有广泛应用，可用于DNA序列分析、基因诊断等领域。
而我们生命的复制过程，则受到复杂的调控和机制的控制，赋予我们生命的继承和传递。
体外PCR扩增和体内DNA复制
复
（lagging strand)。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为
制
冈崎片段（Okazaki fragment)。由DNA连接酶将冈崎片段连起来。PCR 扩增中
过
2 条单链完全解开，分别同时以5′－3′方向连续合成。
程
的
比
较
谢谢
酶 体内DNA 复制是边解旋边复制，需要DNA 解旋酶；延伸需要DNA 聚合酶；冈崎片段的连接需 要DNA 连接酶； 引物的合成需要RNA 聚合酶。而PCR 扩增引物是体外合成，不需要RNA聚合酶； 双链DNA 利用高温变性解为两条单链，不需要DNA 解旋酶；在扩增过程中没有出现冈崎片段，也 就不需DNA 连接酶，只需要Taq 酶（一种热稳定的DNA 聚合酶）。
PCR 扩增和DNA 复制条件的比较
原料 都以4 种脱氧核苷酸为原料。 能量 体内DNA 的复制过程中，解旋酶将DNA 双链解成单链需要ATP 提供能量。而体外DNA 的扩增是通过提高温度使双链解成单链，不需要ATP 提供。 引物 PCR 扩增需要在体外根据需要扩增的目的DNA 各设计一条单链DNA 片段作上游和下游 引物； 而体内DNA复制却有所不同，由RNA 聚合酶在DNA 的模板上合成一段RNA 引物。
扩
（DNA helicase）等的参与。
增
4.体内DNA 的复制A
能以5'→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA
链时的方式是不同的。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基
本上是连续进行的，这一条链被称为前导链（leading strand)。而以5'→3'方向 的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随从链
PCR扩增DNA
三、操作提示：
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中 使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等 在使用前必须进行高压灭菌。 • 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出， 放在冰块上缓慢融化。 • 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取 一种试剂后，微量移液器上的枪头都必须更换。 所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用 手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再 将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反 应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反 应。
DNA的两条母链 模板：__________________ 四种脱氧核苷酸 原料：__________________ 解旋酶、 DNA聚合酶 酶： __________________ DNA或RNA片段 引物：__________________
ATP 能量：_______
2、DNA合成的方向 • （1）DNA单链两端的命名
得到两个拷贝的44pcrpcr循环的结果循环的结果dnadna聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引dnadna聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的物之间的dnadna序列序列使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈指数扩增指数扩增22nnnn为循环次数为循环次数处于两个引处于两个引从第二轮循环开始从第二轮循环开始上一次循环的产物也作为模板参与反应为模板参与反应并且由并且由引物dnadna单链会与单链会与引物引物结合进行结合进行dna上一次循环的产物也作引物延伸而成的延伸而成的dna的延伸的延伸呈二二pcrpcr的实验操作的实验操作11pcrpcr仪仪一设备及用具一设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器实质上一台能够自动调控温度的仪器微量离心管微量离心管22微量离心管微量离心管一种薄壁塑料管总容积为一种薄壁塑料管总容积为05ml05ml33微量移液器微量移液器用于定量转移用于定量转移pcr的一次性吸液枪头用一次更换一次的一次性吸液枪头用一次更换一次pcr配方中的液体其上配方中的液体其上pcrpcr仪仪微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器二实验操作步骤
重难点突破练2 PCR技术的综合应用 试卷
重难点突破练2PCR技术的综合应用（时间：30分钟）1.下面关于聚合酶链式反应（PCR）的叙述正确的是（）A.PCR过程中只需要两个引物分子B.PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步C.PCR扩增仪需保持在37 ℃以维持Taq DNA聚合酶最佳活性D.PCR过程中边解旋边复制答案 B解析PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；PCR的循环过程分为高温变性（DNA双链解聚）、复性（模板链与引物结合）和延伸（合成子链）三步，B正确；PCR扩增仪温度有时会达到90 ℃以上，C 错误；PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。
2.RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。
该技术用于新冠病毒检测时，以下有关其检测反应体系的叙述，错误的是（）A.该体系应含有逆转录酶B.该体系应含有ATP和四种核苷酸C.该体系冷却时，引物结合到互补DNA链D.阳性样本在该体系中可形成大量相关DNA序列答案 B解析由题干信息“RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术”可知，RT-PCR会以RNA为模板，合成DNA，故该体系应含有逆转录酶，A正确；该体系是通过控制温度使反应在体外反复进行的，反应体系中无须加入ATP，B错误；PCR技术中，当温度超过到90 ℃时，双链DNA解聚为单链，当温度下降到50 ℃左右时，引物会结合到互补DNA链上，C正确；阳性样本（新冠病毒RNA）在该体系中，通过逆转录形成cDNA，再通过cDNA的扩增，可形成大量相关DNA序列，D正确。
3.用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是（）A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因D.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因答案 D解析第二轮复制得到4个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，故得到①②③④各一个，B正确；第三轮复制得到8个DNA分子，①复制得到①和③，③复制得到③和⑤，②复制得到②和④，④复制得到④和⑤，故得到①和②各一个，③和④各两个，⑤两个且等长，即2个X基因，C正确；第四轮复制得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，两个③复制得到两个③和两个⑤，两个④复制得到两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤，故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。
PCR与DNA扩增技术
PCR与DNA扩增技术PCR（聚合酶链反应）是一种重要的生物技术方法，被广泛应用于DNA的扩增和检测。
DNA扩增技术则是通过PCR等方法将目标DNA序列扩增至足够数量以供后续实验分析。
本文将介绍PCR技术的原理、步骤和应用，以及DNA扩增技术在生物学研究中的重要性。
PCR技术是一种通过体外复制DNA的方法，可以将少量DNA扩增至数百万倍。
其原理基于DNA的双链结构，利用DNA聚合酶及引物和核苷酸作为反应物质，在不断的变温过程中完成DNA的复制。
PCR反应通常包括变性、退火和延伸三个主要步骤，每个步骤的温度和时间都经过精确控制，以确保DNA的扩增反应能够高效进行。
在PCR反应中，引物（primers）是起关键作用的短链DNA片段，它们与目标DNA序列的末端互补结合，作为DNA聚合酶的起始点。
通过引物的引导，DNA聚合酶能够沿着DNA链逐渐合成新的DNA链，从而实现DNA的扩增。
此外，PCR反应还需要适当的DNA聚合酶，常用的是来自热液泛素菌（Taq polymerase）的酶。
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用，如基因克隆、序列分析、基因表达分析等领域。
通过PCR技术，科研人员能够快速高效地复制目标DNA序列，并进行后续的分析和研究。
此外，PCR技术还被广泛用于医学诊断、法医学鉴定和生物工程等领域，为科学研究和技术发展提供了有力的支持。
与PCR技术相关的DNA扩增技术在现代生物学研究中扮演着重要的角色。
DNA扩增技术能够加速DNA序列的获取和分析过程，为科学家提供了更多的研究资源和方法。
在基因组学、遗传学、疾病诊断等领域，DNA扩增技术都发挥着至关重要的作用，推动了生命科学领域的发展。
总的来说，PCR技术作为DNA扩增技术的主要方法，已经成为生物学研究中不可或缺的重要工具。
其高效、精准的特点使得科学家能够更好地理解生命的奥秘，推动了科学技术的发展和应用。
PCR与DNA扩增技术的不断演进和应用将为生物学领域带来更多的机遇和挑战，为人类社会的发展和进步作出更大的贡献。
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PCR 扩增和DNA 复制条件的比较
• 原料 都以4 种脱氧核苷酸为原料。 • 能量 体内DNA 的复制过程中，解旋酶将DNA 双链解成单
链需要ATP 提供能量。而体外DNA 的扩增是通过提高温度 使双链解成单链，不需要ATP 提供。 • 引物 PCR 扩增需要在体外根据需要扩增的目的DNA 各设 计一条单链DNA 片段作上游和下游引物； 而体内DNA复制 却有所不同，由RNA 聚合酶在DNA 的模板上合成一段RNA 引物。
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体外PCR 扩增和体内DNA 复制是获得 复制DNA 的2 种途径， 它们都依据半保留复 制的原理，但因其操作的环境不同，所要求 的条件和具体的过程又有所不同。
Hale Waihona Puke ..PCR 扩增和DNA 复制条件的比较
• 模板 两者都以DNA单链为模板。PCR 以一段目的DNA 片段 作模板，体内DNA 复制以整个DNA 分子作模板。
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PCR 扩增和 DNA 复制过程 的比较
• 1.两者都遵循碱 基互补配对原则
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PCR 扩增和 DNA 复制过程 的比较
• 2.两者都遵循半 保留复制
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3.模板DNA 经加热至90～95℃左右一定时间后 ， 使模板DNA 双链成为单链。而体内DNA复制 的解链需要单链DNA结合蛋白（ssbDNA蛋白） 、DNA解链酶（DNA helicase）等的参与。 4.体内DNA 的复制是边解旋边复制，且是半不连 续复制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合 子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合 子代DNA链时的方式是不同的。以3'→5'方向的 亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连 续进行的，这一条链被称为前导链（leading strand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的 子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随 从链（lagging strand)。DNA在复制时，由随从 链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段（ Okazaki fragment)。由DNA连接酶将冈崎片段连 起来。PCR 扩增中2 条单链完全解开，分别同时 以5′－3′方向连续合成。
• 酶 体内DNA 复制是边解旋边复制，需要DNA 解旋酶；延伸 需要DNA 聚合酶；冈崎片段的连接需要DNA 连接酶； 引物 的合成需要RNA 聚合酶。而PCR 扩增引物是体外合成，不需 要RNA聚合酶； 双链DNA 利用高温变性解为两条单链，不需 要DNA 解旋酶；在扩增过程中没有出现冈崎片段，也就不需 DNA 连接酶，只需要Taq 酶（一种热稳定的DNA 聚合酶）。
PCR 扩增 和
DNA 复制 过程 的比 较
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