毛细管电泳技术

2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性 不同，产生的电渗流大小不同
3. 电解质溶液性质的影响
（1）溶液pH的影响
对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管 壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，将近达到最大； pH<3，完全被氢 离子中和，表面电中性，电渗流为零。
（4）毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF） 是一种根据等电点的差别分离生物大分子的电泳技术。两性物质以电中性 状态存在时的pH值称为等电点，用pI表示。将被分离的物质和两性电解质混合 物装入毛细管，在电场作用下，不同等电点的两性载体电解质沿毛细管自动形成 pH梯度，被分离的两性物质各自迁移至其等电点，形成很窄的区带，分辨率很 高。
毛细管电泳仪主要构造
（1）高压电源
能输出0～30kV稳定、连续可调、极性可转换的直流电源，具有恒压、
恒流和恒功率输出，有些仪器还有电场强度程序控制。 （2）毛细管 内径20~100 μm、外径350~400 μm、长20~100 cm的弹性石英毛细管。
（3）缓冲液池 内装缓冲液，为电泳提供工作介质，要求体积小、清洗方便、对缓冲液呈化 学惰性。 （4）检测器
实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。
毛细管电泳的几种分离模式
（1）毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis, CZE） 是指溶质在毛细管内均一的背景电解质缓冲溶液中以不同速率迁移而 形成彼此分离的溶质带的电泳模式，分离的基础是淌度的差别。CZE只能分 析带有电荷的离子而不能分离中性物质。
1967年，Hjerten使用内径为3mm的石英玻璃管进行了自由溶液电泳。 1979年，Everaerts使用内径为200m的聚四氟乙烯管成功分离了16种有机酸。
1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达 40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新 的分离分析技术——高效毛细管电泳。
HPCE中的参数 1.迁移时间（保留时间）
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。
t
Lef
V—外加电压；L—毛细管总长度；
ap

Lef
ap E

Lef L
ap V
2.分离效率（塔板数）
在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ 2=2Dt
n
apVLef
5.其他影响因素 （1）电分散作用对谱带展宽的影响
当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量 选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。
（2）“层流”现象对谱带展宽的影响
一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时， 出现抛物线形的层流；
产生的原因：毛细管两端液面高度不同。
（2）胶束电动毛细管色谱
（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MEKC）
在缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度（CMC）的表面活性剂。胶束相在分离中起准固定相 的作用，中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢， 流出时间长。
阻 力：F = fν 故： qE = fν
所以，迁移速度：
qE q E f 6π
（球形离子）
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。 电泳淌度μ ：单位电场强度下的平均电泳速度。
q E 6π

电渗现象和电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力 使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差， 叫做Zeta电势 。在毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层的阳离子被吸引而 向负极移动。由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向 负极运动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整 体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow ，简称EOF）。
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速 度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.表观淌度 μap
离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速）：
μap = μab + μEOF
带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出。
毛细管内径小、进样量少，须采用高灵敏度的检测器。应用较多的有紫外-可 见吸收、荧光、电导检测器等。
类型 紫外-可见 荧光 激光诱导荧光 电导
检测限/mol 10-13～10-15 10-15～10-17 10-18～10-20 10-18～10-19
特点 加二极管阵列，光谱信息 灵敏度高，样品需衍生 灵敏度极高，样品需衍生 离子灵敏，需专用的装置；
HPCE 进样方式
(1) 流体力学进样方式 a、进样端加压 b、出口端抽真空 c、虹吸进样
进样体积 Pd 4π t 128L
（2）电动进样方式 毛细管一端插入样品瓶，加电压
（ eo ef )Vπ r 2ct 进样量 t L
(3)扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处
HPCE 基本操作
4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。
温度每变化1℃ ，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
5. 添加剂的影响
加入表面活性剂，可改变电渗流的大小 和方向； 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗 流。 加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫 酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加， zeta电势增大，电渗流增大； 加入有机溶剂如甲醇、乙腈，通常使 电渗流增大。
电渗流： 直接影响分离情况和分析结果的重现性。
电渗流的流型
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很 小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处 的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。
HPCE中影响电渗流的因素
1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度 正比于工作电压。
高效毛细管电泳技术
内 容
1 、 概述
2、 理论基础
3、毛细管电泳仪主要部件及功能
4、毛细管电泳应用
5、毛细管电泳技术展望
概
述
电泳技术发展
1809年俄国物理学家F F Reuss 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负 两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移 动，这就是电泳现象。 1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施 以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α 、β 、γ 球 蛋白。1948年，获诺贝尔化学奖。 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析技术相比。
2 DL

ap ELef
2D
;
tR n 5.54 Y 1/ 2
2
3.分离度
2(t 2 t1 ) R W2 W1
影响分离效率的因素
1.纵向扩散的影响
在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可 获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。 2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分 离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。
1984年，胶束毛细管电动色谱问世，可分析中性物质。
1987年，毛细管凝胶电泳技术出现。
1992年，阵列毛细管电泳技术出现，并用于重要改进： 一是采用了小内径的毛细管,
二是采用了可高达数万伏的电压。
• 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电 场电压可以很高。 • 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， • 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/ 米，特殊柱子可以达到数百万。
（2）阴离子的影响 电泳介质中由于各种阴离子的形状、大小、荷电量不同，它们的电 导率不同，因而电流会有很大差别，进而导致介质产生的焦耳热不同， 温度和黏度不同，电渗流的大小也不同。
（3）离子强度对电渗流的影响 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流 大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。
3.焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：
V I 2 Q Λm cb E 2 πr L
m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cb—电解质浓度；
散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高）， 破坏了塞流，导致区带展宽。
改善方法： （1）减小毛细管内径； （2）控制散热；
电渗流的大小可用电渗速率
EOF / E
电渗淌度
EOF /
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
νEOF = Lef /teo
Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。