目的基因的亚克隆
基因工程习题+答案
第一章绪论名词解释：1.基因操作：将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2.间断基因：序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3.启动子：DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4.亚克隆：当初始克隆中的外源DNA片段较长，含有许多目的基因以外的DNA片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。
填空题：1.基因操作的核心部分是基因克隆，基因克隆的基本要点有（克隆基因的类型），（受体的选择）和（载体的选择）。
2.（基因）是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。
它可以是连续的，也可以是（不连续的）；可以是（DNA），也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以（存在于染色体之外如质粒、噬菌体）。
3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（表达）、（调控）、（检测）和（改造）等与基因研究相关的内容。
4.启动子是指（基因转录过程中控制起始的部位）。
通常一个基因是否表达，（转录起始）是关键的一步，是起决定作用的。
在转录过程中，启动子还是（RNA聚合酶）的结合位点。
5.原核生物的RNA聚合酶主要由两部分组成：（核心酶）和（σ因子），其中σ-因子并不参与RNA的合成，它的作用主要是（识别要转录的起始位点）。
6.从（启动区）到（终止区）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其中可包括一个或者多个基因。
7.转录终止子主要有两种，一种是（依赖ρ因子），另一种是（不依赖ρ因子）。
8.基因的书写方式，通常是写出的DNA序列总是与（mRNA）相同的那条链，方向是从（5'）到（3'）。
对于碱基的位置，一般自转录起始点向两个方向编号，其中转录起始点定为（+1），（在起始点上游第一个碱基）定为-1。
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
目的基因的克隆方法
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
基因克隆（Gene
基因克隆（Gene Clone ）
⼀、服务介绍
基因克隆(Gene Clone) ，是指对单个基因进⾏拷贝以及复制的过程；基因亚克隆，是指⽤限制性酶切或 PCR 等⼿段从已经克隆的DNA 中获得该克隆DNA 的序列或改造过的序列，再克隆到新载体中的技术。
⼆、服务内容
1 根据客户要求，从DNA 模板中PCR 获取⽬的⽚段，酶切后连接到⽬的载体中；
2 根据客户要求，从DNA 模板中酶切回收⽬的⽚段，连接到⽬的载体中。
三、服务说明
1 客户需提供克隆基因的详细信息及DNA 模板，DNA 模板默认为质粒；如模板为基因组DNA 或cDNA ，则需收取基因调取相关费⽤；
2 客户需提供克隆载体及载体相关信息，本公司可免费提供部分常规载体，⾮常规载体则需收取载体购买费⽤。
四、交付内容
1 提供⼀份质粒及⽢泊菌，
2 完整的实验报告、测序报告；五、服务价格、周期
Cat No.项⽬内容
价格周期备注
M0017亚克隆：⽬的⽚段(bp) < 15005001-2周含1个正确的阳性克隆
M0018亚克隆：⽬的⽚段(bp)1500-20006001-2周M0019亚克隆：⽬的⽚段(bp)2000-25008001-2周M0020亚克隆：⽬的⽚段(bp)2500-300010001-2周M0021
亚克隆：⽬的⽚段(bp)>3000
询价
备注：
1 ⾼GC 、重复序列等困难样品需要额外加收特殊处理费⽤，具体根据序列的情况定，具体咨询genelab@
2 免费提供常规抗性，特殊抗性需要客户⾃⼰提供抗⽣素联系⽅式：genelab@ ；QQ ：2834224669。
DNA的亚克隆综合实验方案
DNA的亚克隆综合实验方案班级：生物科学1班姓名：魏小笛学号：108012011087一、实验学时：3二、实验类型：综合性实验三、实验要求：必修四、实验目的对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等五、实验内容(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
六、实验过程一、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。
根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端、不对称粘性末端、平端。
具体步骤:１．按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。
•DNA 5μl•10×buffer 1μl•无菌水 3.5μl•内切酶0.5μl•总体积：10μl２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小时。
４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer以终止反应。
５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２小时。
载体的制备：用碱裂解法制备质粒。
（PUC18质粒载体DNA）具体步骤：1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。
-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。
影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解,DNA变性。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。
分子亚克隆实验报告
一、实验目的1. 掌握分子亚克隆的基本原理和方法；2. 学会利用PCR技术扩增目的基因片段；3. 熟悉DNA凝胶电泳、DNA连接、转化等分子克隆技术；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理分子亚克隆是指将目的基因片段插入到载体中，从而构建基因表达载体。
实验原理主要包括以下步骤：1. PCR扩增：利用PCR技术扩增目的基因片段；2. 凝胶电泳：分离PCR产物，确定目的基因片段大小；3. DNA连接：将目的基因片段与载体连接；4. 转化：将连接产物转化到宿主细胞中；5. 阳性克隆筛选：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 试剂：PCR试剂盒、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA标记物、质粒等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、离心机、移液器等；3. 细胞：大肠杆菌DH5α等。
四、实验步骤1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计引物，确保引物长度在18-25bp之间，G+C 含量在40-60%之间。
（2）PCR反应：按照PCR试剂盒说明书进行PCR反应，包括变性、退火、延伸等步骤。
2. 凝胶电泳（1）配制琼脂糖凝胶：按照实验要求配制琼脂糖凝胶。
（2）加样：将PCR产物加入琼脂糖凝胶孔中。
（3）电泳：设置合适的电压和时间进行电泳。
（4）观察结果：通过凝胶成像系统观察电泳结果，确定目的基因片段大小。
3. DNA连接（1）酶切：将载体和PCR产物分别进行限制性内切酶酶切。
（2）连接：按照DNA连接酶说明书进行DNA连接反应。
4. 转化（1）制备感受态细胞：按照大肠杆菌DH5α感受态细胞制备方法进行。
（2）转化：将连接产物与感受态细胞混合，进行热冲击转化。
（3）涂布：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的琼脂糖平板上。
5. 阳性克隆筛选（1）PCR检测：对涂布后的平板进行PCR检测，筛选出含有目的基因的克隆。
（2）测序：对阳性克隆进行测序，验证目的基因序列的正确性。
亚克隆名词解释
亚克隆名词解释亚克隆是特殊的生命体，它具有和普通活物一样的细胞组成和DNA结构，但是他们只由一个原始的DNA结构和一个母体所生产。
亚克隆是一种利用技术进行的复制，它可以用来为人类创造新的基因组合，用于培育特殊品种的作物以及人工繁殖特定的动物。
亚克隆技术由美国科学家于1978年发明。
它可以用来对细胞进行复制，从而产生出具有相同基因组合的物种。
细胞复制是通过把一个单一的细胞复制成一定数量的副本来实现的。
这种复制方法称为细胞分裂。
细胞在分裂的过程中，会根据DNA的指令进而产生新的细胞，而亚克隆则是在细胞分裂的基础上进行的，但它添加了一些步骤，使得整个复制过程变得复杂起来。
亚克隆技术可以用来繁衍特定的品种。
通过将植物或动物的细胞一一复制，就可以高效地繁衍出非常相似的品种。
这些特定品种可以是有用的植物和动物，也可以是有某种特殊性状的动物，比如通过亚克隆技术制作出的大头猪，它们的外观让人印象深刻。
此外，亚克隆在医学领域也有着重要的作用。
亚克隆技术可以被用来生产基因修饰的细胞，从而用来研究特定疾病的发病机制。
亚克隆也可以用来制作特定类型的干细胞，以用来治疗某些疾病，比如帕金森病。
另外，亚克隆也可以用来制作特定的药物，这些药物可以用来治疗一些困难治疗的疾病，比如癌症。
总之，亚克隆技术是一项重要的技术，它可以用来为人们带来很大的好处，比如繁衍特定的品种，用于基因修饰疾病治疗以及制造特定的药物等。
然而，亚克隆技术也存在着一定的风险，比如亚克隆动物和植物可能会带来环境污染，以及亚克隆细胞可能会被用来做不道德的行为等。
因此，亚克隆技术是一个极具争议的技术，应该在使用之前，科学家和政府机构应该积极讨论其风险和优势，以确保亚克隆带来的积极作用不会因其不良影响而使其成为一场灾难。
基因亚克隆
酶切反响(20 µl体系)将待酶切的DNA 溶液〔质粒〕参加0.5 ml EP 管，整个酶切体系如下：3-5 µl (用小量抽提得到的DNA质粒溶液，根据浓度决定检测量)2 µl 10×酶切反响缓冲液〔为公司提供〕10～20 Units 限制性内切酶加ddWater使总反响体积为20 µl，轻弹混匀；将上述反响体系置于所选酶要求的反响温度〔水浴或放置培养箱中〕，1-4 hr；对于PCR 产物的酶切，大量质粒的酶切，以与染色体DNA 的酶切，需要增加整个反响体系与限制性内切酶的单位。
问题：选择酶混切时间浓度温度星活性PCR产物需要加保护碱基琼脂糖电泳与DNA 片段的回收1.DNA片段的大小，配置0.5%-2.5%的琼脂糖凝胶〔含0.5 µg/ml EB 的1×TAE 溶解〕；2. 电泳样品参加1/10 体积的10×上样缓冲液，上样，电泳体系为1×TAE，3. 电压控制为10 v/cm，不时用紫外灯〔306 nm〕监测电泳结果；4. 样品跑出适宜的距离后，紫外灯下观察结果，照相记录；5. 回收DNA片段时，在紫外灯下切下所需的琼脂糖凝胶带，置于EP管中，6. 称重，按QIAGEN公司提供的方法用试剂盒回收DNA。
问题回收试剂盒小片段胶浓度溶胶酶切片段两段长度相近载体不回收DNA没有染色上连接反响载体适量 50-100 ng待连接的DNA片段适量T4 DNA ligase(takara) 1 µl (1 U/µl)T4 DNA ligase buffer(10×) 1 µl加ddWater至10 µl，16℃连接16hr或更长时间，即可用于转化。
问题连接酶选择连接比例连接时间连接温度•Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol1.Ken'ichiro Hayashi,2.Masako Nakazawa,3.Yukuo Ishizaki,4.Nobutsugu Hiraoka and5.Akira Obayashi+ Author Affiliations1.Takara Shuzo Co., Ltd., Central Research Laboratories 3-4-1Seta, Otsu-shi, Shiga 520-21, Japan•Received June 16, 1986.•Accepted September 16, 1986. AbstractPolyethlene glycol (PEG) stimulates ligation with T4 DNA ligase. In 10% (w/v) PEG 6000 solutions, only intermolecular ligation is enhanced by monovalent cations, while both inter- and intramolecular ligation occur without their presence. Similar stimulation was also caused by divalent cations or polyamines in the PEG 6000 solutions. Such properties of the ligase could be applied to control the extent of inter- and intramolecular ligation. Ligation with cations or polyamines in 10% PEG 6000 solutions was effective for intermolecular ligation. Ligation without cations or polyamines in 6.0% to 10% PEG 6000 solutions was effective forintramolecular ligation.质粒转化1. 冰上融化感受态细胞，参加适量的质粒或连接产物，冰浴30 min。
《目的基因的克隆》PPT课件
2021/4/25
1
一般来说，目的基因的克隆战略分为两另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因 ，然后将之克隆表达。
2021/4/25
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
2021/4/25
6
3. PCR盒式引物扩增法
5‘ 端不含磷酸基 团
变性 引物退火
Sau3A部分酶切 加装盒式接头片段
2021/4/25
扩增
染色体DNA
7
2021/4/25B 基因的构建基因的基本概念 基因文段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控
连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有 部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是 这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的
2021/4/25
20
酶切片段末端标记法
H
H
H
H
S S SS S SS S S
克隆DNA
载体DNA
S S SSS
十克隆指纹图谱
SS SS S
2021/4/25
单
将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种 不同序列的短探针，其序列是随机的
用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两 个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而 阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC 克隆的排列顺序
克隆和亚克隆-唐靖
242 g Tris, 57.1 ml 冰乙酸, 100 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
Tis-磷酸盐和EDTA缓冲液（TPE）： 10×
108 g Tris, 15.5 ml 磷酸(85%, 1.67 g/ml), 40 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
Tis-硼酸盐和EDTA缓冲液（TBE）： 5× 54 g Tris, 27.5 g 硼酸, 20 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
DNA的构象
凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 所用的电压 琼脂糖种类 电泳缓冲液
DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的影响因素
DNA分子的大小：
双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的 常用对数成反比
琼脂糖浓度：
lg = lg’ Kr
：DNA电泳迁移率；：凝胶浓度； Kr：阻滞系数
DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的影响因素
基因克隆与亚克隆
目的基因与载体的连接及后 续的转化过程习惯上称之为 克隆
基因的克隆与亚克隆技术基因克隆基因组cDNA人工合成
基因亚克隆
带有目的基因的载体
亚克隆技术步骤
获取目的片断
双酶切载体和目的片断
纯化回收载体和目的片断 连接载体和目的片断 转化E.Coli 鉴切
双酶切载体和目的片断
• 酶的总量不能超过反应体系的1/10体积 • 酶切buffer的选择
• 酶切PCR产物需要保护碱基，在设计引物时需要注意
• 酶切时间要适中，防止新活性产生 • 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注 意酶切顺序
切胶回收和连接
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过(1-3)和(1-4)糖苷 键交替构成的线装聚合物。通常情况下琼脂糖链形成螺 旋纤维，进而再聚合成半径20~30nm的超螺旋结构。 琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm 的三维筛孔的通道
目的基因的亚克隆
目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。
2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。
3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。
根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。
在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。
但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。
（实验操作同前述）三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。
目的基因的克隆
（2）探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸
序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时
必须考虑下列问题：
生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间
探针内部不应出现可能的互补区域
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率。
在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的Sal I 片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼
5’ A 5’ T T7 lacZ MCS ori Apr A 5’ T 5’ PCR扩增产物
T 载体
四 化学合成法
1.化学合成法的基本战略 2.化学合成的单元操作 3.DNA化学合成的用途
1.化学合成法的基本战略
（1）全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
①小片段粘接法
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
②补钉延长法
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链
DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
目的基因克隆
2021.03.07 —、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？欧阳光明(2021.03. 07)1、主要有以下几个克隆的策略：(1)PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA,以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
(2)核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
(3)免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二.蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为硏究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的*欧阳光明*创编DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三.基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过PCR方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份,每份为一个“反应池"进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的PCR反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
分子生物学实验技术方法
【实验技术方法】分子生物学技术(zt)分子生物学技术?真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|NorthernBlot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染??????真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。
2．TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。
3．裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20%SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
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目的基因的亚克隆
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；
(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
一、试剂准备
1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。
2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备
选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。
根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。
在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。
但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。
（实验操作同前述）
三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接
（一）连接要求和结果
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。
因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。
利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。
如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载
体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。
四、连接产物的转化
1.感受态细胞的制备
⑴保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。
⑵挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。
⑶取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。
（注：以下操作均应在冰浴中进行。
）
⑷将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl225ml悬浮30min。
⑸4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。
⑹以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。
注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于
-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。
2.连接产物的转化
⑴取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；
⑵加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；
⑶于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；
⑷加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；
⑸将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。
五、重组子的筛选
根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细
菌形成白色菌落。
六、注意事项
1.目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。
2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。
同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。
2.连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。
3.制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。
5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。