抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用
SSH技术及其应用3
SSH技术的应用
发育基因的克隆 疾病相关基因的克隆 各种受体蛋白质相关基因的克隆 免疫调控基因研究 代谢调控机理研究
SSH技术的优点
对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。 简便易行：本技术所采用的技术方法简单，成熟， 易掌握，易操作。 灵敏度高：用抑制消减杂交技术，仅需1~2μg的 mRNA，而mRNA差异显示技术需20 μg的 mRNA，cDNA消减杂交需至少200 μg的mRNA。 重复性好，阳性率高达94%。 快速：一般3~4d即可获得差异表达基因片段的 cDNA。
疾病相关基因的克隆
癌细胞的表达图谱:乳腺癌、人结肠癌、前 列腺癌、 Zanders等用SSH和微阵列杂交，比较RA 组织和正常组织的表达图谱差异。 脑组织中央脑动脉阻塞引起的暂时或永久 性局部缺血时的差异表达基因。 大鼠高转移胰腺癌细胞抹与低转移细胞抹 比较。
各种受体蛋白质相关基因的克隆
总RNA提取及纯化（TRIzol法） mRNA 提取 mRNA 浓缩 RNA 质量和浓度检测
抑制消减杂交
cDNA 第一链和第二链合成 双链 cDNA 的 Rsa I 酶切 Rsa I 酶切检测 Tester 双链 cDNA 接头连接 连接效率检测 第一次杂交 第二次杂交 第一轮 PCR 扩增 第二轮 PCR 扩增
SSH技术的不足
消减库中的cDNA经过RsaI等限制酶消化 后，不再是全长cDNA。当然，可进行定量。 不能同时对数个材料之间进行比较，材料 之间存在过多的差异及小片段缺失也不能 有效被检测。
SSH技术的展望
抑制消减杂交技术的关键
tester与driver要配对密切，最好双方是共源细胞 株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异 表达基因才可能与表型关系密切，从而减少工作 量、减少下一步工作的盲目性。 在选用限制内切酶时应尽量选用对于基因组 DNA是酶切位点较少的限制内切酶，使酶切后 产生的片段尽量大一些。 接头要含有酶切位点以连于平端cDNA上，重要 的是要在其末端含有一段反向末端重复序列，这 使得在PCR反应中能选择性扩增目的cDNA片段， 同时抑制非目的cDNA片段的扩增。
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用
Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ｅ ｏ ｇｉ ｇＡ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｌ ａ ｅ
ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａｙＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｒ ｒ ｄｃｎ ｎ № ２ ２０ ０８
近。 由于 Ｖ Ｐ 在 立 体 结 构 上 与 天 然 病 毒 相 同或 类 Ｌｓ 似， 因此 Ｖ Ｐ Ｌ ｓ能激 发 体 液 免疫 、 细胞 免 疫 和黏 膜 免 疫， 具有 安全 、 高效 的特 点 ， 是很 有发 展前 景 的候 选疫 苗 。但 是 ， 目前 Ｖ Ｐ 主要 通 过基 因工 程 手 段从 酵母 Ｌｓ 或感染重 组杆状 病毒 的昆虫细 胞 中制备 ， 这对操 作者 有 较高 的要求 和较复杂 的试验 操作 条件 。 ３ 利用 反 向遗传 操作 技术制 备的疫 苗
随着 人类 基 因组 计 划 的完 成 及后 基 因组 计划 的 启 动 ， 异基 因表达就 成 了一 项热 门 的技 术 。由于分 差
工程疫 苗及 反 向遗 传疫苗 并存应 用 的局 面。
参 考文献 ：
［ ］ 丁壮 ， １ 金宁一 ， 王兴 龙 ， 鸡 新城疫病毒 Ｈ 等． Ｎ基因亚单 位疫苗
诱导免疫保护 的试验 研究 ［ ］ Ｊ ．动物 医学进 展 ，０ ２ ２ （ ） ２０ ，３ １ ：
４ —５ ． ９ １
清学 方法 无 法 区 别 是疫 苗 株 还 是 野 毒 株 感 染 所 致 。 因此通过 改变免疫 原蛋 白的某 些 中和表 位 ， 构建一 个 能用 合适 的血 清 学 方法 鉴 别 的疫 苗 是 十分 必 要 的 。 Ｐｅｅ ｅｔｓＢＰ等人 通过 反 向遗传 操作 构建 了 Ｎ Ｖ感 染 ｒ Ｄ
３ １ 卵内免疫 疫苗 ．
其 表达外 源基 因 ， 诱 发 对 载体 和表 达基 因的 免疫 。 来 葛金英 等人利 用反 向遗传 操作 技术 以 Ｎ Ｖ 的 ＬＳｔ Ｄ ａｏ ａ 疫 苗株 为载体 ， 入 Ｈ ＡＶ 的 Ｈ Ｎ 插 ＰＩ ５ １株 Ｈ Ａ基 因 ． 研
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用
科学研究表明， 因的选择性差异表达决定植 基 物的生长 、发育、衰老、死亡 、对逆境 的适应等生 理过程 。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体 的生长 、发育规律 ， 进而有针对性地对生物性状进 行改良具有重要意义。近年来随着 Ｐ Ｒ 技术 的兴 Ｃ 起， 出现了许多基于 Ｐ Ｒ的分离差别表达基因的新 Ｃ
由于速度快 、假阳性率低 、灵敏度高等优点 ，现 已 广泛应用于植物学研究 的各个领域【 ６ 】 。烟草是我 国
重要 的经济作物之一 ，面积 和总产量都 居世界第
一
。
与此 同时，它作为模式植物 ， 在植物学的研究
领域具有重要 的科研意义 ，尤其是在遗传 、繁育、
生理、 生化和转基 因等研究领域 。 笔者就 Ｓ Ｈ技术 Ｓ
Ｒｅ ｅ ｃ ｓ ａｒ ｈ
ＬＩＬｉ ｎ． ｑｉ ＬＵ ｍｉ Ｌｉ ｎｇ
（ ｒ ｎ ｍｙＣ ｌ ｇ ｆ ｉｈ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎ ｖ ｒ ｔ， ａ ａ ， ｉ ｕ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ Ａｇｏ ｏ ｏｌ ｅ ｃ ｕ ｎ ｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｙ ’ Ｓｃ ａ ６ ５ １ ， ｈｎ ） ｅ ｏＳ Ａｇ ｃ ｕ ｉ ｎ ｈｎ Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｎ ｗ ｍｅ ｏ ，ｅｍｅ ｐ ｒｓｉｎｓ ｂｒｃｉｅ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ（ Ｓ ， ａ ｅ ｎｄ ｖ ｌｐ ｄｂ ｓｄｐ ｍａ ｌ ｎｔｅ ｅ ｈ ｉｕ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｔ ｄ ｔｒ ｄｓ ｐ ｅ ｓ ｔ ｔ ｂ ｄｚ ｉ Ｓ Ｈ）ｈ ｓ ｅ ｅ ｅｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｒ ｙｏ ｃ ｎｑ ｅ ｈ ｕ ｏ ｕ ａ ｖ ｈ ｉ ａｏ ｂ ｉ ｉ ｈ ｔ
Ｄ Ｉ ０ ９９ ．ｓ． ０—１９ ０１ ３ １ Ｏ ：１． ６￣ｉ ｎ ０７５ １． １． ． ９ ３ ｓ １ ２ ００
抑制消减杂交
抑制消减杂交及其在鱼类基因克隆中的应用摘要：抑制消减杂交在研究差异基因表达上表现出很大的优势，其运用在人类及高等脊椎动物中已很成熟，在对鱼类的研究中还有待进一步的发展。
关键词：鱼类；抑制消减杂交；生殖与发育基因；免疫调控相关基因1 引言随着人类基因组计划的完成及后基因组计划的启动，差异基因表达就成了一项热门的技术。
由于分子生物学及相关技术的迅猛发展，在转录水平研究差异基因表达的方法也层出不穷。
目前，研究较多的主要有mRNA差异显示技术(DDRT- PCR)、代表性差异分析技术(RDA)、基因表达系列分析技术(SAGE)、cDNA 微阵列技术(cDNA microarray)和抑制消减杂交技术(SSH)。
其中抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization SSH）是一种将抑制PCR与消减杂交技术相结合的一种快速分离差异表达基因的方法，它将传统的消减杂交方法与抑制PCR 相结合，比较2个细胞群的mRNA 以获得差异表达的基因克隆，具有检测的特殊性，在动物、植物、微生物的生殖和发育等相关领域中得到了广泛应用。
鱼类中，抑制消减杂交的应用仅限于生殖和发育相关基因和免疫调控相关基因的研究上。
2 SSH的原理和步骤示意图2.1 SSH的原理抑制消减杂交技术是由Diatchenko等[1]于1996年以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。
它主要基于最近出现的抑制PCR ，并结合标准(normalization 或equalization ) 和消减杂交( subtractive hybridization)。
抑制PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列，PCR 中不能扩增，从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。
标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA的丰度，即低丰度差异表达的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。
抑制差减杂交法_SSH_及其在植物中的应用
e)才得以指数扩增 ,而 c类因一端有接头 ,另一 端无接头 ,只能线性扩增 ,形成牢固的“锅 - 柄 ” 结构 ,不能有效扩增 。第二轮 PCR 实际上为巢 式 PCR ,极大地提高了扩增的特异性 ,使得差异 表达目的基因片段大量富集 。
3 SSH 的技术评价
3. 1 主要优点 (1)假阳性率较低 。 SSH方法采用加接头和
然后各自与过量的 D river cDNA 变性后退火杂 交 ,这时得到 4种产物 a, b, c和 d。这种不充分 杂交使单链 cDNA 分子在浓度上基本相同 ,同时 由于 Tester cDNA 与 D river cDNA 的序列相同片 段大都形成异源双链分子 c,使得差异表达基因 得到第一次富集 。然后混合两份杂交样品 ,同时 加入过量的新的变性 D river cDNA 进行第二次差 减杂交 ,这次杂交进一步富集了差异表达 cDNA , 并形成了两个 5’端分别接有不同接头的双链分 子 e。杂交完全后 ,补平末端 ,加入合适引物 (即 部分接头 1和接头 2的单链寡核苷酸片段 )进行 两轮 PCR扩增 。第一次 PCR 是基于抑制反应 , 只有两端连有不同接头的双链 cDNA 片段 (如
39
山西农业科学 2007年 35卷第 4期
玉米 、小麦 、马铃薯 、大豆 、辣椒 、胡萝卜 、大麦 、棉 花 、康乃馨 、拟南芥 、甘蔗 、甜菜 、人参 、芒果 、灌 木 、梭梭 、橡胶树等多种植物 。
目前 , SSH方法在植物上的应用主要包括两 个方面 :一方面涉及植物的生长发育及组织特异 性研 究 。如 刘 军 等 [ 6 ] 以 水 稻 茎 尖 分 生 组 织 ( SAM )为对照材料 ,幼穗分生组织 ( pb / sb)为试 验材料 ,进行抑制性差减杂交 ,分离得到了 40个 水稻幼穗分生组织中特异表达或表达增强候选 基因 ; Kim M 等 [ 7 ]通过此技术分离得到了辣椒素 的生物合成相关基因 ; Feng DR 等 [ 8 ]也对水稻茎 尖分生组织和开花分裂组织的差异表达进行了 筛选 ; Kloos DU 等 [ 9 ]对甜菜根中表达的基因进行 了分离和鉴定 ; 常青山等 [ 10 ]同样应用此技术对 矮败小麦花药中特异表达的基因进行了研究 ;罗 志勇等也进行了人参皂苷生物合成相关基因的 筛选和鉴定 [11 ] ; 张雷等应用此项技术分离了胡 萝卜体细胞胚根发育相关基因 [ 12 ]等 。
抑制性消减杂交技术介绍
A B C
D
•
实验流程
由RNA合成 cDNA A B C D 第一次消减杂交
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E E
第二次消减杂交 加入共用PCR引物 末端补齐 A, D: 不能被扩增 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因
•
C: 线性扩增 B: 扩增受到抑制
EE
5’ 3’
3’ 5’
•
Tester杂交液 （Adaptor 2R） A B C D
Driver cDNA （加热变性）
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
A, B, C, D cDNA 末端接头连接
E
末端补齐 第一次消减杂交 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 E E 富集差异表达基因
Driver cDNA （过量）
Tester cDNA with Adaptor 2R
A B C D
A
B
C D
•
实验流程
由RNA合成 cDNA Tester杂交液 （Adaptor 1） A B C 第一次消减杂交 D 第二次消减杂交 末端补齐 第一次PCR扩增 第二次PCR扩增 富集差异表达基因 A, B, C, D
抑制性消减杂交
主要内容
1 2 3 抑制性差减杂交技术概述
抑制性差减杂交原理 抑制性差减杂交流程
•
抑制差减杂交技术SSH
抑制差减杂交（SSH）SSH是一种 基于抑制PCR和差减杂交技术建 立的,在转录水平上研究基因表达 的技术。
•
抑制性消减杂交—原理
抑制性消减杂交技术
抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。
该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。
通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。
所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。
抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。
首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。
接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。
第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。
抑制性消减杂交技术及其应用研究进展
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ｍ ｅ ｈ ｎｉｍ ｆｄ ｖ ｌ ｐｍ ｅ ｔｒ ｌ ｔ ｄ ｇｅ ｅ ｕｌ ｔｏ ｍ ｏ ｅ ｕ ｅ ｍ ｅ ｈａ ｉｍ ｉｅ ｓ ｍ ｅ ｈ ｎｉｍ ｆ ｃ ａ ｓ ｏ ｅ ｅｏ ｎ — ｅａ ｅ ｎｅ ｒ ｇ ａ ｉ ｎ， ｌ ｃ ｌ ｃ ｎ ｓ ｏｆｄ ｓ ａ ｅ， ｃ ａ ｓ ｏ
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抑制性消减杂交技术在甲壳动物中的应用研究进展
Ｓ ＮＡＰ ２ ５ 、微 管蛋 白、锌 指蛋 白、细 胞 内脂肪 酸 结 合蛋 白、细 胞外 超 氧 化 物歧 化 酶 前体 、精 氨酸 激 酶 、 热休克 蛋 白 ７ （ ］ 和Ｂ ａ ｘ抑制剂 １ ，所有 发现 的病毒 诱 导 的免 疫 相关 基 因为 对 虾 固有 免疫 系统 提 供 了全 的观点 。Ｊ ａ ｍｅ ｓ 等 采 用 Ｓ Ｓ Ｈ 技术 构建 感染 白斑 病毒 的印度 明对虾 （ Ｆ ｇ ” ， 一 ０ 声 ｅ ａ “ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ｕ ｓ ）肝 胰 腺
抑 制性 消减 杂 交技 术 在 甲壳 动 物 中 的应 用研 究 进 展
郜 卫 华 谭 北 平
（ 长 江 大 学 动物 科学 学 院 ，湖 北 荆 州 ４ ３ ４ ０ ２ ５ ） （ 厂 东 海 洋 大 学 水产 学院 ，广 东 湛 江 ５ ２ ４ ０ ２ ５ ）
（ 教 育 部 海 水 养 殖重 点实 验 室 （ 中国海洋大学） ，山 东 青 岛 ２ ６ ６ ０ ０ ３ ）
条下 调表 达 ，另有 ５条基 因 （ 漆 酶 、羧肽酶 Ｂ、氢 离子转 运 ＡＴ Ｐ合 成酶 、ＡＣ Ｂ Ｐ和 含 Ｉ Ｄ Ｉ 一 受 体 的皮质 颗粒 蛋 白）第 一次在 感染 白斑病 毒 的对 虾 中发现 ，这 步 研究对 虾 固有免疫 功能 提供 了新 的观点 。Ｚ ｅ ｎ ｇ等 － ｓ 采用 Ｓ Ｓ Ｈ 技 术构 建感 白 斑 病毒 的小 龙虾 （ Ｐ ｒ ｏ ｃ ａ ｍｂ ａ ｒ ｕ ｓ ｃ ｌ ａ ｒ ｋ ｉ ｉ ）血 细胞 差 异表 达 ｃ ＤＮＡ 文 库 ，并 结合 基 因芯 片技 术 鉴定 了 ３ ３
抑制消减杂交技术(SSH)及其在植物基因克隆上的应用
关 键 词 ：Ｓ Ｓ Ｈ技 术 ；差异 表达 ；Ｐ Ｒ Ｃ 中 图 分 类 号 ： ７５ Ｑ ８ 文 献 标 识 码 ： Ｂ
分 子 生 物 学 研 究 表 明 ， 物 的 生 长 、 育 、 老 和 死 生 发 衰 亡 ， 织 和 细 胞 间 的分 化 ， 组 凋亡 及 变 异 都 是 与 基 因 的选 择 性 差 异 表 达 有 关 ， 基 因 在 时 间 和 空 间 上 的 有 序 表 达 贯 即 穿 和调 控 了 个 体 的整 个 生 命 发 育 过 程 。 因 此 ， 离 并 克 分 隆差 异 表 达 基 因 不 仅 有 助 于 阐 明 生 命 的 奥 秘 ， 且 还 为 而 生 物 的改 良、 因诊 断 与 治 疗 提 供 重 要 的 理 论 依 据 。 近 基 年 来 ， Ｐ Ｒ技 术 的 基 础 上 ， 继 提 出 了 多 种 分 离 克 隆 在 Ｃ 相 差 异 表 达 基 因 的 技 术 ， ９ ２年 Ｈａ ｇ和 Ｐ ｒｅ １９ ｎ ａｄｅ等 … 首 次 提 出 的 差 异 显 示 技 术 （ Ｒ ｉｅｅ ｔ ｉ ｌ ｅｅｓ ｍ ＮＡ ｄｆ ｒｎｉ ｄｓ ａ ｒｖ ｒ ｆ ｌ ａ ｐｙ ｅ ｔ ｎｃｉｔ ｎ Ｐ Ｒ） １ ９ 年 Ｈ ｌ ｒ ｒ ｓｒ ｉ Ｃ ； ９ ４ ａ ｐｏ Ｌ ａｋ等 Ｌ 提 出 的 Ｉ Ｄ ｂ ２ 』 （ ｅｅｅ ｔｔ ｎ ｄｆ ｒｎｅ ａａ ｓ ｒｐ ｓｎａｉ ａ ｏｌ ｉｅ ｃ ｎ ｌ ｉ ｅ ｙ ｓ） 技 术 ； １９ 年 ９６ Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｌ等 Ｌ ｉａ ｈｎ ｏ ｔ ３ 提 出 的 Ｓ Ｈ （ ｕ ｐｅｓ ｎ ｕ ｔ ｅ ｖ Ｓ ｓｐ ｒｓｉ ｓｂｒ ｔ ｅ ｏ ａｉ ｈ ｂｉｚｔ ｎ ｖ ｒ ａｉ ）技 术 及 １９ 年 Ｊｓ 等 』提 出 的 Ｄ Ｄ ｄ ｏ ９８ ｏｈ Ｓ （ ｉｃｅ ｆ ｌ ｕ ｔ ｃｉ ｉ ｌ ） 术 等 ， 中 ｍ Ｎ 差 异 显 ｄｆ ｒｎ ａ ｓｂｒ ｔ ｎｄｓ ａ 技 ｉ ａ ｏ ｐｙ 其 ＲＡ 示 技 术 已在 筛 选 差 异 表 达 基 因方 面 得 到 了 广 泛 使 用 ， 后 三 者 应 用 还 不 多 ， 别 是 Ｓ Ｈ技 术 的 应 用 主 要 集 中在 肿 特 Ｓ 瘤 基 因 的 克 隆方 面 ， 植 物 研 究 领 域 较 少 。郭 新 红 【 等 在 ５ Ｊ 利 用 ｓ Ｈ技 术 对 渗 透 胁 迫 诱 导 的 梭 梭 幼 茁 差 异 表 达 基 Ｓ 因 片段 进 行 了 分 离 和 克 隆 ， 取 得 了 成 功 。本 文 就 Ｓ Ｈ 并 Ｓ 技术及其应用作一介 绍 。 １ Ｓ Ｈ技 术 的 主 要 原 理 和 基本 过 程 Ｓ Ｓ Ｈ 技 术 主 要 原 理 是 以抑 制 Ｐ Ｒ为 基 础 的 ｅ Ｎ Ｓ Ｃ Ｄ Ａ消 减 杂交 。 所 谓 抑 制 Ｐ Ｒ是 利 用 非 目标 序 列 片 段 两 端 的 Ｃ 长 方 向重 复 序 列 在 退 火 时 产 生 类 似 发 卡 的 互 补 结 构 ， 无 法 作为 模 板 与 引 物 配 对 ， 择 性 地 抑 制 了非 目 的 基 因 片 选 段 的扩 增 。 在 经 济 消 减 杂 交 后 ， 据 复 性 动 力 学 原 理 ， 根 浓 度 高的单链 ｅＮ Ｄ Ａ分 子 迅 速 复 性 ， 度 低 的单 链 ｅ Ｎ 浓 Ｄ Ａ分 子 仍 以单 链 形 式 存 在 ， 得 杂 交 后 不 仅 目的 基 因 间 的 丰 使 度 差 异 基 本 消 除 ， 且 富 集 了差 异 表 达 基 因 。 而 其 基 本 过程 是 ： 提 两 种 不 同 细 胞 （ ｅｔ 和 ｄ ｖｒ 抽 Ｔｓ ｒ ｅ ｉ ｒｅ） 的 总 ｍＲ Ａ逆 转 录 转 成 ｃ Ｎ 用 Ｒ ａ 或 Ｈ ｅⅢ 限制 酶 切 Ｎ Ｄ Ａ， ｓ ｌ ａ 割 为 小 片段 。 将 ｔ ｔｒ Ｄ Ａ分 为 两 份 ， 别 连 接 不 同 的 ｅ ｅ Ｎ ｓ ｅ 分
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH是一项可以快速获取两个不同生物材料中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。
该技术尤其适合以genome尚不完全清晰的物种或者以特殊材料为研究对象的科研工作者。
是基因芯片技术的有效补充。
基本流程:通过差减文库构建，文库验证和筛选（逆向斑点杂交），获得阳性克隆，对阳性克隆测序及生物信息分析，可判定差异基因的情况。
另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列，并可用Northern blot 或Real－Time PCR加以验证。
抑制性消减杂交文库技术是一种革命性的差异表达基因筛选技术。
该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。
与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特点。
现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基因分型差异的研究。
技术方法成熟有效不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。
只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异基因片段。
放大稀有转录本本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也就是说，利用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。
仅仅需要500ng的poly A＋RNA与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA 即可进行有效实验。
如果您只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑制性消减杂交实验。
抑制消减杂交的原理及应用
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别.
探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理：
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
大肠杆菌
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抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
抑制性消减杂交技术在动物疫病防控中的应用
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｃｎ ｏ ｅ ｓｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄｉｉ ｅ
抑 制性 消 减 杂 交技 术 在 动 物 疫病 防控 中的应 用
马 清 霞 ， 相 华 ， 守媛 ， 周 刘 赵 娟 ， 玉乾 何
时期 的基 因表 达按 照 时 间 和空 间顺 序 有序 地 进 行 ，
收 稿 日期 ：０ ９０ － １ ２ ０ — ９２
直 接或 间接关 系到疾 病 的发生和 易感性 。筛选 和鉴
作 者 简 介 ： 青 霞 （９ ８ ） 女 ， 南 淇 县人 ， 医师 ， 要 从 事 动 物 疫 病 的 快速 诊 断和 综 合 防 控 工 作 。 马 １７一 ， 河 兽 主
４ ０ — ４１ ． ４ ７ ４ ４
ｔ ａ ａ ｉ ｒ ｔＳ，Ｃｈ ｅ ｍａ ｏ ｅ ｓ ｎ Ｓ，Ｃａ ｔ ｒ Ｒ． Ｌ ｎ ａ ｅ ｇ ｏ ｐ ｓ — ｒｅ ｉ ｋ ｇ ｒ ｕ ｅ ［ ３ Ｐａ ｔ ｒ ｄ ｌ ｋ ａ １］
ｌ ｃ ｉｎ： ｔ ｗａ ｄ ｄ ｎ ｉ ｉ ｇ ｇ ｎｅ ｏ ｔ ｏ ｌ ｇ ｓ ｒ ｉ ｓ ｅ ｉｉ ｅ ｔｏ ｏ ｒ ｓ ｉ ｅ ｔｆ ｎ ｅ ｓ ｃ ｎ ｒ ｌ ｎ ｔ ａ ｎ ｐ ｃ ｆ ｙ ｉ ｃ
中图 分 类 号 ： ８ １ ３ ￥ ５ ． 文献 标 识 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ７ ５ ３ （ ０ ０ ０ — １ ４０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ５ ０ １ —４
在高 等生 物个 体 发 育 中 ， 同组 织 细 胞 在不 同 不
称 之为 基 因的差 异 表达 ； 些 异 常 表达 的基 因可 能 那
用 于寻找差 异基 因的研 究 。为筛选 与病原体 致病 相 关基 因， 了解病 原体与 感 染细胞 之 间的分 子响应 机制 ， 从
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，简称SSH）文库构建是一种用来富集和表达特定基因的方法。
它可以用于比较两种样品中的差异基因，以便进一步研究其功能和调控机制。
下面将介绍SSH文库构建的步骤及相关注意事项。
1.SSH文库构建的原理：SSH文库构建过程中，通过对目标样品和参考样品进行两轮的杂交和选择，可以移除两者之间相似的序列，从而富集出两者之间差异的序列。
这是通过抑制性消减和杂交的方式实现的。
第一轮杂交可以提取出高表达的差异基因，第二轮杂交可以进一步筛选出表达量更低的差异基因。
2.SSH文库构建的步骤：（1）制备目标DNA和参考DNA：从目标样品中提取总RNA，合成cDNA；从参考样品中提取总RNA，合成cDNA。
（2）第一轮杂交：将目标cDNA和参考cDNA进行杂交。
可根据实验要求对目标和参考cDNA进行标记，如将目标cDNA用偶联荧光物标记为红色，参考cDNA用偶联荧光物标记为绿色。
（3）第一轮选择：通过差异表达的双链RNA（dsRNA）的特性，使用RNAse H酶将dsRNA降解，保留差异表达的单链RNA（ssRNA），并与固相矩阵连接。
（4）第二轮差异杂交：将第一轮杂交产物与参考cDNA进行杂交，反转标记荧光物，即将红色标记转为绿色，绿色标记转为红色。
（5）第二轮选择：采用同样的方法将差异表达的ssRNA连接到固相矩阵上。
（6）PCR扩增：对固相矩阵上连接的差异基因进行PCR扩增，得到SSH文库。
3.注意事项：（1）杂交温度和时间：根据不同实验需求，可以调整杂交温度和时间，以保证高效的结合。
一般来说，较高的温度（如68℃）可以提高特异性结合。
（2）选择条件：选择条件要严格控制，以保证只有差异表达的ssRNA被固定在固相矩阵上。
（3）PCR扩增条件：PCR扩增过程中，应根据实验需求选择适当的引物和PCR条件，以获得高效的文库扩增。
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
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抑 制 性 消 减 杂 交 技 术
（ｕｐ ｅｓｏ Ｓ ｐｒ ｓ ｉｎ
１３ 将 ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ分成 两组 （ 和 ２ ，分 别于其 ． ｅｔｒｃＮ １ ）
Ｓ ｂ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｈ ｂ ｉ ｉ ａ ｉ ｎＳ Ｈ 是 Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｕ ｔ ａ ｔ ｖ ｙ ｒ ｄ ｚ ｔ ｏ ，Ｓ ） ｉ ｔｈｎ ｏ
一
阳性率低 、 筛选效 率高 、 操作 简单等优 点 ， 别适用 于 特 克 隆分析造成 某种特 殊表型 的 目相 同但 在
短链 （ １ 约 ０余个核苷 酸 ） 组成 的双链 ＤＡ片 段 ， Ｎ 长
同， 内侧序 列与第二次 Ｐ Ｒ引物序列 相 同。 外 ， 而 Ｃ 此 在
［ 摘
要］ 制性消减杂交技术 （Ｓ ） 抑 Ｓ Ｈ 是一种高效检测差异表达基 因的方法 。 详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改 良中的应用 。 ［ 关键词］ 抑制性消减 中 ８ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章编 号 ］ １ ０ — ０ ５ ２０ ） ７０ ３ － ３ 文 ０ ３ ５ ９ （０ ８ ０ － ０ １０
５ 端接上 去磷酸 化 的接 头 １ 接 头 ２ （ｄ ｐｏ ， 和 ａ ａｔｒ １
等于 １９ 依据 消减杂 交和 抑制 Ｐ Ｒ发 展起 来 的 ９６年 Ｃ
一
种 分 离差 异表 达 基 因的新 方 法 ［３该 技术 具 有假 ， ２
ａａ ｔｒ２。 ｄｐ ｏ ） 两接头分别是具有一段反向末端重复序 列 的寡核苷 酸序 列 ， 由一长链 （ ４ 约 ０余个 核苷酸 ） 和
含有 目的基 因的样 品称 为试验方 （ｅ ｔ ｒ 。 Ｔ ｓ ｅ ）
除接 头不 同外 是完 全同源 的， 然形成 ａｂＣｄ但第 仍 ，、、，
二次杂交还 产生了 含有不同接头的新双链分子ｅ ， ｅ 这种 型 分破 Ｔ ｓ ｅ 较 Ｄ ｉｅ 特 ｅｔｒ ｒｖ ｒ ｃ Ｎ。 ＤＡ
１６ 两轮 杂交后 ， ． 补平黏性末 端 ， 加入 针对两 种接头 外侧 相 同序 列 的一 对 引 物 ，利 用巢 式 Ｐ Ｒ Ｎｓ ｅ Ｃ （ｅ ｔｄ Ｐ Ｒ原 理进行第 一次扩 增 ，、 Ｃ） ａｄ由于 没有 引物 结合位 点而 不 能进 行扩 增 ； ｂ由于 两 端 有 长 序 列 的 反 向重 复， 在退 火 时单链 内部易形 成发 夹状 结 构 ， 法进行 无 有效扩 增 ； Ｃ只一端 有接 头 ， 只有 一个 引物 结合位 点 ，
１２ 用识别 四碱 基 的限制 性 内切 酶 Ｒ ａ （ ． ｓＩ或 ｅ ） Ｉ Ⅱ 酶 切 。双 链 ｃＮ ＤＡ经 酶 切 后 ，每 个 片 段 一 般 小 于 ６ ０ｂ ，可防止长链 ｃＮ ０ ｐ ＤＡ片段 所形成 的复杂结构干 扰 消减 杂交 。
链外侧 ２ ０余个核苷酸序 列与第一次 Ｐ Ｒ引物 序列相 Ｃ 接 头上 还含 有 Ｔ 启 动 子序列 和 内切 酶识 别 位 点 ， 为 以后 连接克隆载体和 测序提供方便 （ １。 图 ） １４ 将过量 的 Ｄ ｉｅ Ｄ Ａ分别与含接 头 １ ． ｒ ｖｒ ｃＮ 和接 头 ２的 Ｔ ｓ ｅ ＤＡ杂交 ，形成 ４ 产物 ａｂＣｄ （ ｅ ｔｒｃＮ 种 、、、 图 ２。ａ是 单链 Ｔ ｓｅ Ｄ Ａｂ是 自身 退 火 的 Ｔ ｓｅ ） ｅ ｔｒｃＮ ： ｅｔｒ
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第 ３ 卷第 ７ ｌ 期 ２０ ０８年 Ｏ 月 ７
左
工
Ｖ． ０８ Ｊ ３Ｎ７ ｏ １ １ ２ａ ｕ １． ０
抑制性消减 杂交 （Ｓ ） 术及其应 用 ＳＨ 技
刘 静， ห้องสมุดไป่ตู้ 颖
００１） ５０ ５ （ 华北制药集 团新药研 究开发有 限责任公司， 河北 石 家庄
１５ 合 并两 组第一次 杂交产物 ，加上 新制备 的变性 ．
Ｄ ｉ ｅ Ｄ Ａ 再次进行杂交 。由于两 组 Ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ ｒ ｖｒｃＮ ， ｅ ｔ ｒ ｃＮ
１１ 提取样本 ｍＮ ，利用随机 引物反转录为双链 ． ＲＡ
ｃＮ ，将不含 目的基 因的一方作 为驱动子 （ｒ ｖ ｒ， ＤＡ Ｄ ｉ ｅ）
（ｒ ｖ ｒ ， Ｄ ｉ ｅ ） 与含有 目的基 因的试验 方 （ｅ ｔ ｒ 进行杂 Ｔ ｓ ｅ）
交 ，选 择性 的去 除两部 分共 同基 因杂交形 成 的复合 物 ，最后将含有相 关 目的基 因的未例 如细胞 生长 、 器官形 成 、 恶性转 化 、 定代 谢产物 分泌 等都 是基 因 特 选择性表达 的结果 ， 要弄清这 些生命现 象的分子 调节
ｃＮ 链 ； Ｄ Ａ双 Ｃ是 Ｔ ｓ ｅ 和 Ｄ ｉ ｅ ｅ ｔｒ ｒ ｖ ｒ的异 源双 链 ： ｄ是
个别功 能或特 性上不 同的材 料 （ 同类菌种 的高产 、 如 低产 品系）提取 ｍＮ ， Ｒ Ａ经反 转录合成 ｃＮ ， 一定条 Ｄ Ａ在 件 下用大 大过 量 的不含 目的基 因 的一方作 为驱 动子
Ｄ ｉｅ ＤＡ ｒｖ ｒｃＮ 。第一 次杂交依据杂 交的二级动 力学原 理 ，丰度 高的单链 ｃＮ Ｄ Ａ在退火 时产 生 同源 杂交 的速 度 要快 于 丰 度低 的单 链 ｃＮ ，同 时 ， 由于 Ｔ ｓ ｅ ＤＡ ｅ ｔｒ ｃＮ ＤＡ中 和 Ｄ ｉｅ Ｄ Ａ序 列 相 似 的 片 段 大 都 和 ｒｖｒ ｃＮ Ｄ ｉｅ ｒｖ ｒ形成 异源双 链分 子 Ｃ ，使 Ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ中的 ｅ ｔｒｃＮ 差异表 达基因 的 目标 ｃＮ （ 低丰度 ｃＮ ） 到大 ＤＡ包括 Ｄ Ａ得
量 富集 。
机制， 就要对选择性表达的基因进行分离、 克隆、 序列 分析 ，然 后研 究其 氨 基酸 组成 ，表达 产物 的结 构功
能 。 抑制性消 减杂交技 术为寻找表达 基 因和研 究 已 知基 因的新 生物 学功 能提供 了一个有利工 具。 １ ＳＨ的基本原理 与过程 Ｓ 帕