抑制消减杂交的原理及应用

人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
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抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别.
探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理：
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
大肠杆菌
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抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
巢式PCR示意图
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抑制消减杂交的原理
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抑制消减杂交的实验过程
杂交双方为tester和driver ,tester含有要寻找的差异表达基因
合成ds cDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将
mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3'端具有poly A结构 的特点，合成3'端引物.反转录体系中要加入T4 DNA聚合酶以产生平头 cDNA 。
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抑制消减杂交的原理
杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产 生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在 丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。
抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使 非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡 的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制 了非目的基因片段的扩增。
核酸
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抑制消减杂交的实验过程
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巢式PCR反应：巢式PCR是一种 变异的聚合酶链反应(PCR)，使 用两对（而非一对）PCR引物扩 增完整的片段。第一对PCR引物 扩增片段和普通PCR相似。第二 对引物称为巢式引物，结合在 第一次PCR产物内部，使得第二 次PCR扩增片段短于第一次扩增。 巢式PCR的好处在于，如果第一 次扩增产生了错误片断，则第 二次能在错误片段上进行引物 配对并扩增的概率极低。因此， 巢式PCR的扩增非常特异性
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抑制消减杂交的实验过程
driver准备:对于driver的d Nhomakorabea cDNA只需经Rsa I或HacⅢ限制性内切酶
酶切成短片段，而不需添加接头。
消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的driver cDNA，于杂交缓
冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合， 再加入过量变性的driver cDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板 的差异表达序列。
动
要了解人体各项生命活动的 分子调控机制，就必须将这 些差异表达的基因分离、
鉴定作深入研究
抑制消减杂交
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抑制消减杂交的原理
抑制性消减杂交技术的定义：
是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术. 其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的 cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于 测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达 的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他 消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等 优点而得到广泛应用.
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抑制消减杂交的实验过程
※蓝白斑筛选原理：
大肠杆菌（ β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半 乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽 段的基因位于载体上并含有不影响其ORF （open reading ）的多克隆位点（MCS）， 而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。 二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与 载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无 色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛 蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而 使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互 补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的 物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳 性克隆即选择白斑。
抑制消减杂交的原理及应用
尚立娜
主要内容
1
抑制消减杂交的定义
2
抑制消减杂交的基本原理及实验过程
3
抑制消减杂交技术的优点
4
抑制消减杂交技术的应用
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抑制消减杂交的定义
人类基因组包括100000 个不同的基因，但对于每个 细胞而言一般只有15 000
种基因表达
基因的选择性表达决定 了生物体的各项生命活动
tester准备:产生平头ds cDNA后，用Rsa I或Hae Ⅲ限制性内切酶将ds
cDNA酶切成短片段，将tester cDNA分为两组，在T4连接酶的作用下 分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接 头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利 于以后的选择性扩增。